CN104561263A - B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法，其中试剂盒借助生物信息平台进行大规模基因组分析，根据B型肉毒梭状芽孢杆菌的产毒素基因设计了四条特异性引物，结合LAMP技术，针对B型肉毒梭状芽孢杆菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低、操作简便等优点，可用于食品、临床及环境等样品的安全快速检测。

Description

B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP）技术进行菌样快速检测的生物检测试剂，具体涉及一种B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术
肉毒梭状芽胞杆菌（Clostridium botulinum）又称为肉毒杆菌或肉毒梭菌，是一种革兰氏阳性厌氧芽孢菌，有鞭毛、无荚膜、产芽孢，由于芽孢比营养体宽，故呈梭状。肉毒梭状芽胞杆菌在自然环境中广泛存在，其芽孢热抵抗力较强，是引起食物中毒病原菌中热抵抗力最强的菌种之一。在厌氧条件下，该菌会产生强烈的细菌外毒素-肉毒毒素（Botulinum neurotoxin，BoNTs），肉毒毒素与神经元突触前膜受体结合，通过与神经细胞中的特异性底物蛋白相作用，阻止神经介质乙酰胆碱的释放，造成全身肌肉包括呼吸肌的松弛性麻痹，最终导致患者死亡。肉毒毒素是目前已知的毒性最强烈的生物毒素之一，其成人致死量仅为0.1-1.0μg，可用来制造生化武器。根据肉毒毒素的抗原性差异，可将肉毒杆菌分为A、B、C 、D、E、F、G七种血清型，其中A、B、E、F型能够引起人类中毒，而在我国以B型肉毒毒素中毒最为常见，A型和E型次之。
肉毒毒素的传播主要有三种类型，分别为食源性肉毒毒素中毒、创伤性肉毒毒素中毒和婴儿肉毒毒素中毒。根据国内外已有报道，在人类肉毒毒素中毒案例中，由于进食了含有肉毒毒素食品所引起的食源性肉毒毒素中毒最为常见。其原因主要是由于食品在制作过程中被肉毒杆菌芽孢污染，其后未进行灭菌或灭菌不彻底，芽孢在厌氧环境中发芽繁殖，并产生肉毒毒素，如果含有毒素的食品在食用前又未经过充分加热，就可能会造成食源性的肉毒毒素中毒。在欧美国家，引起肉毒中毒的食品主要包括罐头、乳制品、真空包装食品和冷冻食品等；而在我国，则以面制品和发酵豆制品居多。
目前针对肉毒梭状芽孢杆菌有多种检测方法。传统的增菌产毒培养方法（国家标准GB/T 4789.12-2003）一般需要10天以上，周期较长，且需要使用实验动物，成本较高；免疫学检测（Immunoassay，IA）是一种根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知抗体或利用已知的抗体检测未知抗原的技术，主要包括酶联免疫吸附（ELISA）、放射免疫（RIA）、反向间接血凝法（RPHA）和反向乳胶凝集实验（RPLA）等，此类方法周期短，一次可检测大量样本，且不需实验动物，但其缺点是必须有高亲和性的抗体；实时荧光定量PCR方法能够用于病原菌的检测，但对仪器设备和人员的专业技术水平要求较高，且操作复杂，耗时较长，限制了该技术的推广。
DNA环介导恒温核酸扩增技术（LAMP) 是一种新型的恒温核酸扩增方法，此技术克服了以往基因扩增方法的不足，能够在恒温条件下进行核酸的扩增，具有简单、快速、成本低、特异性强等优点，适于现场检测，有较好的应用性。目前，还没有专门针对B型肉毒梭状芽孢杆菌的环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明的目的在于构建一种快速灵敏准确的B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
本发明的技术方案为：B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括以下试剂：
（1）反应液1：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）；
（2）反应液2：10μmol/L外引物1（F3）、10 μmol/L外引物2（B3）、40 μmol/L内引物1（FIP）和40 μmol/L内引物2（BIP），引物序列如下：
外引物1：GTGTTCCACTCGAAGAGTT
外引物2：CATATTCTGGGCAAAACTTCA
内引物1：TTCGCTCCACTTCTCCTGGACAAACATTGCTAGTGTAACTGTT
内引物2：ACCTGGGCCAGTTTTAAATGAAAATTATACCCCCGAAGCCTTC；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
本发明还提供了一种B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一，提取待检样品的基因组DNA；
步骤二，环介导恒温扩增反应，取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，反应体系总体积25μL，将配置好的反应体系在65℃下扩增反应50-70 min后取出待检；
步骤三，分析判断反应结果，在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
本发明根据B型肉毒梭状芽孢杆菌的产毒素基因bont/B设计了四条特异性引物，该基因序列为B型肉毒梭状芽孢杆菌所共有，以保证检测不同来源的B型肉毒梭状芽孢杆菌的可靠性。本发明采用LAMP技术，针对B型肉毒梭状芽孢杆菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低、操作简便等优点，可用于食品、临床及环境等样品的安全快速检测。
附图说明
图1是不同菌株的阳性扩增结果对比图，其中2号反应瓶内样品为绿色，1和3-8号反应瓶内样品为橙色。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明中试剂盒及检测方法的建立和应用作进一步说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。
实施例1
B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及其检测方法的建立
步骤一，引物的设计、合成试剂盒的组装
本实施例确定用于检测的引物序列如下：
外引物1：GTGTTCCACTCGAAGAGTT
外引物2：CATATTCTGGGCAAAACTTCA
内引物1：TTCGCTCCACTTCTCCTGGACAAACATTGCTAGTGTAACTGTT
内引物2：ACCTGGGCCAGTTTTAAATGAAAATTATACCCCCGAAGCCTTC。
在此基础上设计用于B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：
（1）反应液1：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5 mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）；
（2）反应液2：10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
步骤二，待检样品的制备
采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA
检测菌种B型肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum B）来源于中国医学细菌保藏管理中心，编号CMCC64304。使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取样品基因组DNA。
步骤三，进行环介导恒温扩增反应
（1）取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2、1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，反应体系总体积25μL；
（2）将配置好的反应体系在65℃下扩增反应50-70min后取出待检。
步骤四，分析判断反应结果
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检菌株为B型肉毒梭状芽孢杆菌。
实施例2
阴性对照
步骤一，引物的设计、合成试剂盒的组装
本实施例确定用于检测的引物序列同实施例1。
在此基础上设计用于B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：
（1）反应液1：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）；
（2）反应液2：10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
步骤二，待检样品的制备
采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA
使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取A型肉毒梭状芽孢杆菌、E型肉毒梭状芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和肠炎沙门氏菌等7种细菌的基因组DNA。
步骤三，进行环介导恒温扩增反应
（1）取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2、1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，反应体系总体积25μL；
（2）将配置好的反应体系在65℃下扩增反应50-70min后取出待检。
步骤三，分析判断反应结果
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
如图1所示，编号为1-8的反应管分别对应A型肉毒梭状芽孢杆菌、B型肉毒梭状芽孢杆菌、E型肉毒梭状芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和肠炎沙门氏菌。
所述的实施例1与实施例2中各阴性对照组比较，实施例1中产生阳性扩增结果，如图1中2号反应管，而不携带bont/B基因的实施例2阴性对照菌株没有产生阳性扩增结果，如图1中1号、3-8号反应管，从而证明本试剂盒及检测方法具有较强的特异性，对不携带bont/B基因的其他菌株不会产生假阳性结果。
SEQUENCE LISTING
<110>  河南师范大学
<120>  B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
gtgttccact cgaagagtt                                                19
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
catattctgg gcaaaacttc a                                              21
<210>  3
<211>  43
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
ttcgctccac ttctcctgga caaacattgc tagtgtaact gtt                       43
<210>  4
<211>  43
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
acctgggcca gttttaaatg aaaattatac ccccgaagcc ttc                       43
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。
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<110>  河南师范大学
<120>  B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
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<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
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<212>  DNA
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<212>  DNA
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catattctgg gcaaaacttc a                                              21
 
 
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<212>  DNA
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ttcgctccac ttctcctgga caaacattgc tagtgtaact gtt                       43
 
 
<210>  4
<211>  43
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
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acctgggcca gttttaaatg aaaattatac ccccgaagcc ttc                       43

Claims (2)

1.一种B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括以下试剂：
（1）反应液1：10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水；
（2）反应液2：10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2，引物序列如下：
外引物1：GTGTTCCACTCGAAGAGTT
外引物2：CATATTCTGGGCAAAACTTCA
内引物1：TTCGCTCCACTTCTCCTGGACAAACATTGCTAGTGTAACTGTT
内引物2：ACCTGGGCCAGTTTTAAATGAAAATTATACCCCCGAAGCCTTC；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L内引物1 1μL和40μmol/L内引物2 1μL。
2.一种权利要求1所述的B型肉毒梭状芽孢杆菌环介导恒温基因扩增快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、提取待检样品的基因组DNA；
步骤二、环介导恒温扩增反应，取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，反应体系总体积25μL，将配置好的反应体系在65℃下扩增反应50-70min后取出待检；
步骤三、分析判断反应结果，在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
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