CN103497999A - 一种用于肉毒杆菌lamp核酸检测引物组和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组和试剂盒，其特征在于，引物组包括：外侧正向引物，其为SEQ ID No：1所示的多核苷酸序列；外侧反向引物，其为SEQ ID No：2所示的多核苷酸序列；内侧正向茎环引物，其为SEQ ID No：3所示的多核苷酸序列；内侧反向茎环引物，其为SEQ ID No.4所示的多核苷酸序列。一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒包括所述的引物组。本发明所述检测试剂盒是将恒温扩增技术与DNA显色检测相结合，灵敏度高、特异性强，结果准确，操作简单快速，相关仪器设备要求低，适于基层人员操作。

Description

一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子学和分类学领域，特别涉及用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组和试剂盒。

背景技术

肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium.botulinum)是一种生长在缺氧环境下的革兰氏阳性产孢子细菌，具有极强的生存能力。肉毒杆菌产生的毒素，肉毒毒素是已知的毒性最强的毒素之一。肉毒杆菌是一种致命病菌，人们食入和吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，病情严重可能导致死亡。目前报道新西兰恒天然浓缩乳清蛋白粉大批量被肉毒杆菌污染，多家产品被卷入其中。

传统肉毒杆菌检测技术为酶联免疫吸附剂测定(ELISA)，ELISA检测技术成本较低，但其受抗体批次和样本影响比较大，极易出现假阴和假阳性，其灵敏度和特异性无法满足检测需要。目前，肉毒杆菌的检测主要集中在荧光实时定量PCR方法。但是，荧光实时定量PCR方法需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，且操作复杂，检测耗时长，只有专业检测机构和实验室才能独立操作，不利于技术推广。

本发明所述用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组和试剂盒与传统检验技术和荧光定量PCR技术产品相比灵敏度高、特异性好、仪器要求低、易于操作、适用于高通量筛选和污染易控制等独到的优势，市场前景广阔。

发明内容

本发明目的之一在于提供用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的引物组。本发明的另一目的在于用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒。本发明的总体目的是将LAMP核酸检测与DNA显色检测相结合，开发出对仪器设备要求低，操作简单，适于基层人员操作的肉毒杆菌检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明公开了一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组，其特征在于，包括：

外侧正向引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

外侧反向引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；

内侧正向茎环引物，其为SEQ ID No.3所示的多核苷酸序列；

内侧反向茎环引物，其为SEQ ID No.4所示的多核苷酸序列。

一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。

优选的是，包括含有权利要求1所述的引物组的反应体系，25μl所述反应体系的配置为：8U/μl的链置换DNA活性聚合酶，2μl浓度为10mM内侧正向茎环引物，2μl浓度为10mM的内侧反向茎环引物，0.5μl浓度为10mM外侧正向引物，0.5μl浓度为10mM外侧反向引物，2.5μl10×PCR缓冲液，1μl浓度为10mM的dNTPs，1μl浓度为1～10μg/μl的待检测基因组DNA提取液，1.25μl20×DNA荧光染料和13.25μl双蒸水。

优选的是，所述DNA荧光染料为10000×SYBR Green I。

优选的是，以待测肉毒杆菌DNA为模板作为检测组，以肺炎球菌DNA、大肠杆菌DNA、金黄色葡萄球菌DNA、鼠伤寒沙门氏菌DNA、破伤风梭菌DNA和白色念珠菌DNA做为阴性对照组，用权利要求2所述试剂盒配制所述反应体系进行LAMP检测，之后用紫外分析仪测量所述反应体系的荧光强度。

优选的是，与所述阴性对照组相比所述检测组荧光强度增强说明检测样品为肉毒杆菌。

优选的是，所述试剂盒的检测反应条件为：95℃预变性5min，65℃恒温反应1h和80℃孵育10min。

本发明人使用本发明所述引物组和试剂盒，按照本发明的检测方法对肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白色念珠菌(Candida albicans)等11种不携带NTNH基因的菌种进行LAMP核酸检测，反应结束以后用紫外分析仪进行不开盖荧光检测，结果显示阳性对照产生高强度DNA扩增荧光，而不携带NTNH基因的对照菌种不产生高于本底水平的荧光。从而证明对不携带NTNH基因的其他菌种的LAMP检测不会产生假阳性的结果。

本发明的有益效果是本发明所述LAMP检测技术30min即可扩增至109倍，于低至几个拷贝的病毒模板也能有效扩增，与传统的PCR扩增技术相比，LAMP反应简单，反应效率大大提高，而且特异性高、仪器要求低，只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或紫外分析仪检测沉淀浊度即可判断、易于操作、适用于高通量筛选和污染易控制。本发明所述检测试剂盒是将恒温扩增技术与DNA显色检测相结合，开发出对仪器设备要求低，操作简单，适于基层人员操作的肉毒杆菌检测试剂盒。

总之，本发明的有益效果为：

1.本发明中引物组为特异性引物，是专门用于扩增一段肉毒杆菌的特异性保守序列，保证了检测的特异性和准确性。

2.本发明试剂盒以LAMP代替荧光实时定量PCR，效率高，时间更短，特异性好灵敏度更高，检测效果更加准确。

3.使用本发明所述试剂盒检测肉毒杆菌无需采购昂贵仪器设备，无需专业技术人员，适于基层推广。

4.本发明所述试剂盒检测方法简单快捷：反转录和扩增反应在恒温统一环境中一步完成，省去了反转录步骤和改变温度所需的时间。

5.使用本发明所述试剂盒对肉毒杆菌进行在65℃恒温条件下高效、特异、快速的扩增目的基因，完成检测过程，整个检测过程只需1～2h就可完成。

6.检测结果肉眼即可辨别。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。

术语“PCR”意指聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

术语“环介导恒温扩增技术”意指针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA活性聚合酶在等温条件60～63℃保温30～60min，完成核酸扩增反应。

术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为DNA引物)。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3`端的复制起始点的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA模板5`端的复制起始点的引物。

术语“链置换DNA活性聚合酶”意指一类在细胞复制DNA的过程中起重要作用的酶，以DNA为复制模板，从将DNA由5′端点开始复制到3′端的酶。链置换DNA活性聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相辅的活性。

术语“缓冲液”意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化作用的溶液。

附图说明

图1为本发明所述肺炎球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门菌、白色念珠菌、痢疾志贺菌、破伤风梭菌和肉毒杆菌的LAMP核酸检测结果中各反应管的荧光强度对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：

引物设计：

所述引物组的四个引物使用Premier Biosoft公司的LAMP引物设计软件Lamp Designer1.10，根据肉毒杆菌NTNH结构域的保守序列来设计。

实施例2

使用本发明所述试剂盒进行肉毒杆菌检测

步骤一，提取检测样品的基因组DNA作为模板；

步骤二，将所述基因组DNA在95℃预变性5min，然后立即将所述预变性的基因组DNA置于冰上冷却；

步骤三，取1μl所述预变性的基因组DNA和所述试剂盒中试剂配制成所述LAMP检测反应体系，轻轻混匀；

步骤四，将所述配制成的LAMP检测反应体系65℃反应1h进行退火和延伸，之后将退火和延伸后的所述LAMP检测反应体系80℃孵育10min；

步骤五，所述孵育结束之后，将所述反应体系置于紫外分析仪中测量所述反应体系的荧光强度，根据所述荧光强度的变化确定检测结果。

实施例3：

阴性对照

步骤一，提取肺炎球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门菌、白色念珠菌、痢疾志贺菌和破伤风梭菌11种细菌的基因组DNA作为模板；

步骤二，将所述基因组DNA在95℃预变性5min，然后立即将所述预变性的基因组DNA置于冰上冷却；

步骤三，取1μl所述预变性的基因组DNA和所述试剂盒中试剂配制成所述LAMP检测反应体系，轻轻混匀；

步骤四，将所述配制成的LAMP检测反应体系65℃反应1h进行退火和延伸，之后将退火和延伸后的所述LAMP检测反应体系80℃孵育10min；

步骤五，所述孵育结束之后，将所述反应体系置于紫外分析仪中测量所述反应体系的荧光强度，根据所述荧光强度的变化确定检测结果。

如图1所示，编号为1～12的反应管分别对应肺炎球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门菌、白色念珠菌、痢疾志贺菌、破伤风梭菌和肉毒杆菌。

所述实施例2与实施例3中各阴性对照组比较实施例2中产生高强度DNA扩增荧光，如图1中12号反应管，而不携带NTNH基因的实施例3阴性对照菌种不产生高于本底水平的荧光，如图1中1～11号反应管。从而证明对不携带NTNH基因的其他菌种的LAMP检测不会产生假阳性的结果。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (7)

1.一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组，其特征在于，包括，

外侧正向引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

外侧反向引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；

内侧正向茎环引物，其为SEQ ID No.3所示的多核苷酸序列；

内侧反向茎环引物，其为SEQ ID No.4所示的多核苷酸序列。

2.一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组。

3.如权利要求2所述的用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1所述的引物组的反应体系，25μl所述反应体系的配置为：8U/μl的链置换DNA聚合酶，2μl浓度为10mM内侧正向茎环引物，2μl浓度为10mM的内侧反向茎环引物，0.5μl浓度为10mM外侧正向引物，0.5μl浓度为10mM外侧反向引物，2.5μl10×PCR缓冲液，1μl浓度为10mM的dNTPs，1μl浓度为1～10μg/μl的待检测基因组DNA提取液，1.25μl20×DNA荧光染料和13.25μl双蒸水。

4.如权利要求3所述的用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述DNA荧光染料为10000×SYBR Green I。

5.如权利要求2所述的用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，以待测肉毒杆菌DNA作为检测组，以肺炎球菌DNA、大肠杆菌DNA、金黄色葡萄球菌DNA、鼠伤寒沙门氏菌DNA、破伤风梭菌DNA和白色念珠菌DNA做为阴性对照组，用权利要求2所述试剂盒配制所述反应体系进行LAMP检测，之后用紫外分析仪测量所述反应体系的荧光强度。

6.如权利要求5所述的用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，与所述阴性对照组相比所述检测组荧光强度增强说明待检测样品为肉毒杆菌。

7.如权利要求5所述的用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测反应条件为：95℃预变性5min，65℃恒温反应1h和80℃孵育10min。

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