CN108251514A - 一种双重致病菌的比色传感新方法 - Google Patents

一种双重致病菌的比色传感新方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108251514A
CN108251514A CN201810128946.4A CN201810128946A CN108251514A CN 108251514 A CN108251514 A CN 108251514A CN 201810128946 A CN201810128946 A CN 201810128946A CN 108251514 A CN108251514 A CN 108251514A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
seq
sequence
complementary series
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810128946.4A
Other languages
English (en)
Inventor
罗云波
许文涛
黄昆仑
田晶晶
杜再慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201810128946.4A priority Critical patent/CN108251514A/zh
Publication of CN108251514A publication Critical patent/CN108251514A/zh
Priority to PCT/CN2018/099324 priority patent/WO2019153675A1/zh
Priority to CA3059288A priority patent/CA3059288C/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明建立了一种双重致病菌的比色传感新方法，用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的超灵敏检测。该方法建立了超快速PCR反应体系，将耗时3小时左右的传统PCR过程缩减到5分钟，显著减少了PCR反应的用时；将超快速PCR反应体系搭载核酸自组装显色模块，不仅再次放大了反应信号、有利于实现致病菌的超灵敏检测，而且解决了传统PCR结果难于可视化检测的难题。本发明所建立的检测方法和生物传感器比传统方法更快捷、灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在包括食品安全和快速检测领域的微生物检测领域，具有非常好的应用前景。

Description

一种双重致病菌的比色传感新方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种双重致病菌的比色传感新方法。
背景技术
传统的细菌检测方法主要根据细菌的生理生化特征，经过前增菌、选择性平板分离、生物化学鉴定等步骤，从取样到确定结果需要5-7天，检测周期长，操作繁琐，工作量大。利用抗原抗体反应的特异性，对细菌进行鉴别，已有了半个多世纪的历史，但是微生物抗体的筛选十分繁琐，并且最终的检测特异性不高。分子生物学检测技术的不断完善和发展，克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题，也使得针对微生物开展的快速检测方法得到迅速发展，但是分子生物学方法的缺点在于结果不可视化，不容易分析结果。
发明内容
本发明建立的比色传感新方法，克服了现有检测技术的不足，实现了对微生物进行准确、快速、简单高效的检测和分析。
本发明的一个目的是提供一种检测方法，所述方法包括体外核酸扩增技术,所述体外核酸扩增技术的反应体系包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括：互补序列A、连接臂、互补序列B和可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述连接臂位于所述互补序列A和互补序列B之间，所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列位于所述上游引物的5’端或3’端；所述互补序列A和所述互补序列B的核苷酸序列互补和/或反向互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增过程中新链延伸的结构；所述下游引物包括可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；
所述A、B只用于区别不同的互补序列，不用于排序。
所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。
所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶。
所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列具体包括根据待测目标的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法。
具体的，所述方法还包括下述1)-2)中的至少一种：
1)所述体外核酸扩增技术包括超快速PCR反应，所述超快速PCR反应的反应过程包括：90-98℃，2-6s；50-60℃，2-8s；共20-40个循环；
具体的，所述超快速PCR反应的反应过程包括：95℃，4s；58℃，6s；共30个循环；
具体的，所述超快速PCR反应的反应体系中上游引物和下游引物的浓度为普通PCR浓度的10倍以上；还具体的，为20倍；所述超快速PCR反应的反应体系中还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的浓度为普通PCR浓度的10倍以上，还具体的，为60倍；
2)所述连接臂包括具长链结构的化合物。
再具体的，所述连接臂为oxyethyleneglycol，oxyethyleneglycol的化学结构为：
具体的，所述方法还包括下述1)-8)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
2)所述下游引物包括序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1和/或SEQID №：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
4)所述下游引物包括将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
5)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：5所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
6)所述下游引物包括序列表中SEQ ID №：6所示的核苷酸序列；
7)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：4和/或SEQ ID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：4和/或SEQID №：5所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
8)所述下游引物包括将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。
还具体的，所述上游引物为：
AGAGAGAGAGAGGGAAAGAGAGAG-oxyethyleneglycol-CTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCTCTTTTTTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA和/或
TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-oxyethyleneglycol-AACTATACAACCTACTACCTCAAAAAAAAAAAAGCACATAACAAGCG
所述上游引物公众可直接购买得到，其制备方法属于现有技术。
本发明的另一个目的是提供一种检测方法，所述方法包括核酸自组装显色反应,所述核酸自组装显色反应的反应体系包括发卡序列，其特征在于，所述发卡序列包括：构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列、互补序列C和互补序列D；所述构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列位于所述发卡序列的5’端和/或3’端；所述互补序列C与另一个发卡序列的互补序列C互补和/或反向互补；所述互补序列D与待测目标或与待测目标连接的核苷酸序列互补和/或反向互补；
所述C、D只用于区别不同的互补序列，不用于排序。
所述G-四链体功能核酸序列包括现有技术或公知常识所定义的G-四链体功能核酸序列；具体的，所述G-四链体功能核酸序列包括所述序列经自组装后能形成具有类辣根过氧化物酶活性的G-四链体功能核酸，所述G-四链体功能核酸在氯高铁血红素(hemin)的诱导下，能催化ABTS2-与H2O2生成使反应液呈蓝绿色的物质ABTS-。
具体的，所述发卡序列包括将G-四链体功能核酸序列按照25％和/或75％的比例劈裂，劈裂后的序列分别添加在所述发卡序列的5’端和/或3’端；再具体的，所述劈裂后还需添加T碱基；所述T碱基添加在劈裂后的序列的5’端和/或3’端；
具体的，所述G-四链体功能核酸序列包括序列表中SEQ ID №：7和/或SEQ ID №：8所示的核苷酸序列；
具体的，所述互补序列D可与本发明所述的互补序列A和/或互补序列B互补或反向互补
再具体的，所述发卡序列包括下述1)-4)中的至少一种：
1)序列表中SEQ ID №：9所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：9所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
2)序列表中SEQ ID №：10所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：10所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
3)序列表中SEQ ID №：11所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：11所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
4)序列表中SEQ ID №：12所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：12所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
还具体的，所述核酸自组装显色反应还包括下述1)-2)中所述的至少一种：
1)所述核酸自组装显色反应的反应条件包括于37℃孵育20min；
2)所述核酸自组装显色反应的反应体系中，所述发夹序列的终浓度为2μM。
本发明的再一个目的是提供一种检测方法，所述方法包括先通过本发明任一所述方法扩增待测目标，然后再通过本发明任一所述方法检测待测目标。
具体的，所述方法中，本发明所述互补序列D与本发明所述的互补序列A和/或互补序列B互补或反向互补。
具体的，所述方法还包括下述1)-4)中至少一种：
1)通过最终反应体系的颜色变化判断待测物中是否含有待测目标；
具体的，当反应体系的颜色发生变化时，判断待测物中含有待测目标；再具体的，当反应体系的颜色为蓝绿色时，判断待测物中含有待测目标；
2)通过最终反应体系的颜色来制作标准曲线的方法来计算待测物中的待测目标的浓度；
3)通过增加反应体系中的发夹序列的种类来放大待测目标的检测信号；
具体的，每增加一种，信号放大2-4倍；
4)通过增加反应体系中的上游引物或下游引物的种类，和同时增加发夹序列的种类来实现双重或多重检测；
具体的，当所述检测为双重或多重检测时，可通过微阵列法判断待测物中是否含有待测目标或含有几种待测目标；所述微阵列法包括，将所述不同种类的发夹序列分别单独放置于不同的微孔中进行反应，然后根据反应结果判断是否含有待测目标或含有几种待测目标，当微孔中的反应液颜色发生变化或变为蓝绿色时，判断含有待测目标；发生颜色变化或变为蓝绿色的微孔总数为待测物中含有的待测目标的种类总数。
所述发夹序列的种类包括：所述发夹序列中的互补序列D与同一个所述上游引物中的互补序列A和/或B互补或反向互补的发夹序列为同一种类的发夹序列，否则，为不同种类的发夹序列；所述上游引物核苷酸序列相同的为同一个上游引物。
所述上游引物或下游引物的种类包括：可扩增同一待测目标的引物对为同一种类的上游引物或下游引物；反之，可扩增不同待测目标的引物对为不同种类的上游引物或下游引物。
本发明的还一个目的是提供一种试剂盒和/或生物传感器，所述试剂盒和/或生物传感器包括下述1)-2)所述中的至少一种：
1)上游引物和下游引物，所述上游引物包括：互补序列A、连接臂、互补序列B和可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述连接臂位于所述互补序列A和互补序列B之间，所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列位于所述上游引物的5’端或3’端；所述互补序列A和所述互补序列B的核苷酸序列互补和/或反向互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增过程中新链延伸的结构；所述下游引物包括可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；
2)发卡序列，所述发卡序列包括：构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列、互补序列C和互补序列D；所述构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列位于所述发卡序列的5’端和/或3’端；所述互补序列C与另一个发卡序列的互补序列C互补和/或反向互补；所述互补序列D与待测目标或与待测目标连接的核苷酸序列互补和/或反向互补。
所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补；
所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶；
所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列具体包括根据待测目标的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法；
具体的，所述连接臂包括具长链结构的化合物；
再具体的，所述连接臂为oxyethyleneglycol，oxyethyleneglycol的化学结构为：
具体的，所述上游引物和下游引物包括下述1)-8)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
2)所述下游引物包括序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1和/或SEQID №：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
4)所述下游引物包括将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
5)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：5所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
6)所述下游引物包括序列表中SEQ ID №：6所示的核苷酸序列；
7)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：4和/或SEQ ID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：4和/或SEQID №：5所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
8)所述下游引物包括将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。
再具体的，所述上游引物为：
AGAGAGAGAGAGGGAAAGAGAGAG-oxyethyleneglycol-CTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCTCTTTTTTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA和/或
TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-oxyethyleneglycol-AACTATACAACCTACTACCTCAAAAAAAAAAAAGCACATAACAAGCG
所述C、D只用于区别不同的互补序列，不用于排序；
所述G-四链体功能核酸序列包括现有技术或公知常识所定义的G-四链体功能核酸序列；具体的，所述G-四链体功能核酸序列包括所述序列经自组装后能形成具有类辣根过氧化物酶活性的G-四链体功能核酸，所述G-四链体功能核酸在氯高铁血红素(hemin)的诱导下，能催化ABTS2-与H2O2生成使反应液呈蓝绿色的物质ABTS-。
具体的，所述发卡序列包括将G-四链体功能核酸序列按照25％和/或75％的比例劈裂，劈裂后的序列分别添加在所述发卡序列的5’端和/或3’端；再具体的，所述劈裂后还需添加T碱基；所述T碱基添加在劈裂后的序列的5’端和/或3’端；
具体的，所述G-四链体功能核酸序列包括序列表中SEQ ID №：7和/或SEQ ID №：8所示的核苷酸序列；
具体的，所述互补序列D可与权利要求1所述的互补序列A和/或B互补或反向互补；
再具体的，所述发卡序列包括下述1)-4)中的至少一种：
1)序列表中SEQ ID №：9所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：9所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
2)序列表中SEQ ID №：10所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：10所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
3)序列表中SEQ ID №：11所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：11所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
4)序列表中SEQ ID №：12所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：12所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
具体的，所述试剂盒和/或生物传感器包括下述1)-3)：
1)AGAGAGAGAGAGGGAAAGAGAGAG-oxyethyleneglycol bridge–CTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCTCTTTTTTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA和/或TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-oxyethyleneglycol bridge-AACTATACAACCTACTACCTCAAAAAAAAAAAAGCACATAACA；
2)TCATCGCACCGTCAAAGGAACC和/或GATAAAGAAGAAACCAGCAG；
3)序列表中SEQ ID №：9、SEQ ID №：10SEQ ID №：11、SEQ ID №：12所示的核苷酸序列中的至少一种。
其中，oxyethyleneglycol的化学结构为：
本发明的最后一个目的是提供本发明任一所述方法、本发明任一所述试剂盒和/或生物传感器的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-4)中的至少一种应用：
1)检测微生物；
2)制备检测微生物的产品和/或相关产品中的应用；
3)双重或多重微生物的检测；
4)制备用于双重或多重微生物检测的产品和/或相关产品中的应用。
具体的，所述微生物包括沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌。
可选的，所述任一应用不包括中国专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。
本发明建立的一种基于超快速PCR的双重比色传感新方法：
(1)该方法建立了超快速PCR反应体系，将耗时3小时左右的传统PCR过程缩减到5分钟，显著减少了PCR反应的用时；
(2)将超快速PCR反应体系搭载核酸自组装显色模块，不仅再次放大了反应信号、有利于实现致病菌的超灵敏检测；而且解决了传统PCR结果难于可视化检测的难题；
(3)将显色体系置于微孔中，经过微孔阵列排序，解决了致病菌的双重检测问题。
本发明的一个具体实施例根据沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的毒力基因，设计超快速聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的扩增引物，结合核酸自组装显色模块，整合建立一种基于超快速PCR的双重比色传感新方法，用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的超灵敏检测。
本发明具有下述有益技术效果：
1)本发明所建立的检测方法和生物传感器比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在包括食品安全和快速检测领域的微生物检测领域，具有非常好的应用前景。
2)本发明所建立的检测方法和生物传感器可同时实现对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的双重特异性检测，检测的特异性好、灵敏度高，检测结果可靠、肉眼即可辨别，检测过程快捷方便，在日常监控或市场筛查等方面具有重要意义。具体的，本发明所建立的检测方法和生物传感器对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检测的检测灵敏度分别为10cfu/mL，10cfu/mL；此外，特异性试验结果表明，本发明所建立的检测方法和生物传感器对志贺氏杆菌、大肠杆菌无交叉反应，可同时实现沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的双重特异性检测。
3)本发明核酸自组装显色模块为非酶反应，反应体系成分更简单、反应过程也更简单，减少了终止了酶促反应的步骤，且恒温反应简化了对酶促反应温度的要求，显著降低了经济成本、缩短了反应时间，有助于达到快速简捷检测的要求。
附图说明
图1为超快速PCR装置的结构图。
图2为双重超快速PCR反应的扩增效果验证结果图；其中，泳道1为未经过产物纯化的阴性对照(不添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组的双重超快速PCR反应体系)；泳道2为未经过产物纯化的阳性样品(添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组的双重超快速PCR反应体系)；泳道3为经过产物纯化的阴性对照(不添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组的双重超快速PCR反应体系)；泳道4为经过产物纯化的阳性样品(添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组的双重超快速PCR反应体系)。
图3为沙门氏菌的标准曲线图。
图4为金黄色葡萄球菌的标准曲线图。
图5为特异性实验结果图，其中1为微孔1,2为微孔2,3为微孔3,4为微孔4；a为对沙门氏菌与志贺氏杆菌样品进行检测的结果图；b为对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌样品进行检测的结果图；c为对沙门氏菌与金黄色葡萄球菌样品进行检测的结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种用于检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的基于超快速PCR的双重比色传感新方法的建立
(一)实验材料
本实施例所采用的菌株信息见表1，所设计的引物的核苷酸序列见表2和序列表。
表1
表2
表2中，上游引物Primer 1的连接臂(oxyethyleneglycol bridge)左侧的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列，连接臂右侧的核苷酸序列为序列表中SEQID №：2所示的核苷酸序列，连接臂的化学结构为：
表2中，下游引物Primer 2的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列。
表2中，上游引物Primer 3的连接臂(oxyethyleneglycol bridge)左侧的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：4所示的核苷酸序列，连接臂右侧的核苷酸序列为序列表中SEQID №：5所示的核苷酸序列，连接臂的化学结构与Primer1的连接臂的化学结构相同。
表2中，下游引物Primer 4的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：6所示的核苷酸序列。
表2中，发卡序列1-4(Hairpin 1、Hairpin 2、Hairpin 3、Hairpin 4)为将2种G-四链体功能核酸序列：序列表中SEQ ID №：7所示的核苷酸序列AGGG CGGG TGGG TGGG和SEQID №：8所示的核苷酸序列TGGG TGGG TAGGG CGGG，按照约25％，75％的比例劈裂，分别添加在发卡探针(HairpinProbe)的两端。且添加T碱基保护劈裂的G-四链体序列。经过“引发剂”(Intiator)促发核酸自组装，使劈裂的G-四链体在距离上相互靠近，在氯高铁血红素(hemin)的诱导下，形成具有类辣根过氧化物酶活性的G-四链体功能核酸，发挥催化ABTS2-与H2O2显色的功能。具体的，表2中发卡序列Hairpin 1的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：9所示的核苷酸序列；Hairpin 2的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：10所示的核苷酸序列；Hairpin 3的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：11所示的核苷酸序列；Hairpin 4的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：12所示的核苷酸序列。
表2中所列的序列均为人工合成。
Ex Taq DNA聚合酶,10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+Plus)与dNTP Mixture(2.5mM)均购自宝生物公司(TAKaRa)。氯高铁血红素(Hemin)与2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS2-)购自阿拉丁试剂(Sigma-Aldrich Chemical Co.)。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。
(二)超快速PCR装置的搭建
超快速PCR装置的主要结构如图1所示，其具体的结构、连接方式和工作原理、工作过程包括：
超快速PCR装置采用Light Cycler型号的毛细管(20uL，04 929 292 001，Roche)作为PCR样品室，通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端，离心完成后带有样品的毛细管被固定在塑料支架上。塑料支架连接到步进电机(42JSF630AS-1000，JustMotioin Control)上，由该步进电机带动固定在塑料支架上的毛细管样品室在95℃的高温水浴锅和58℃的中温水浴锅之间循环转换，实现超快速PCR反应过程中的反应温度变化及控制。所述步进电机由开关电源(S-100-24，Elecall)进行供电，采用直流伺服电机驱动器(YZ-ACSD60，Moving)以及Labview(version 2014)实现步进电机的上述循环转换的频率或时间的控制。温度测量利用封装在毛细管中的热电偶来实现。热电偶信号的放大及线性化处理过程则利用温度变送器(SBWR-2260，K，Yuancheng)进行传递并采用Arduino UNO v1.0芯片进行处理。Arduino UNO芯片将接收到的温度的模拟信号转换成数字信号，然后由Arduino IDE(version 1.8.1)模块执行运算。
(三)双重超快速PCR反应
1)配制双重超快速PCR反应体系，具体见表3：
表3
将沙门氏菌与金黄色葡萄球菌在LB培养基中过夜培养活化，采用NewIndustry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取沙门氏菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液中的基因组DNA，将提取到的两种基因组DNA各取1μL混合，作为表3中的模板。表3中的引物1-4(Primer1、Primer 2、Primer 3、Primer 4)具体为上述表2中所列的引物1-4(Primer 1、Primer 2、Primer 3、Primer 4)。
2)双重超快速PCR反应过程：
按照表3，在冰上配制10微升反应体系，迅速置于步骤(二)搭建的超快速PCR反应装置中进行温度控制，温度控制及循环数见表4：
表4
3)双重超快速PCR反应的扩增效果验证：
完成上述双重超快速PCR反应过程后，使用2％溴化乙锭预染色的琼脂糖凝胶电泳验证双重超快速PCR反应体系的扩增效果，电泳条件：130V for 25min，拍照系统：Molecular Imager Gel Doc XR(Bio-Rad)。并使用PCR产物纯化试剂盒(上海生工)去除引物二聚体、未反应的引物与反应杂质。
双重超快速PCR反应的扩增效果验证结果见图2，图2结果表明：双重超快速PCR反应体系实现了双重致病菌的有效扩增；且经过PCR产物纯化试剂盒的纯化，有效去除了引物二聚体、未反应的引物与反应杂质。
(四)核酸自组装显色模块的建立与双重致病菌的可视化检测
1)灵敏度实验
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌各自的标准曲线的绘制：
将上述表2所列的4条发夹探针(HairpinProbe)：Hairpin 1，Hairpin 2，Hairpin3，Hairpin 4分别用超纯水溶解至100μM，于95℃加热5min，后缓慢降至室温；
将沙门氏菌与金黄色葡萄球菌在LB培养基中过夜培养活化，将梯度稀释、经过平板计数，浓度分别为101cfu/ml,102cfu/ml,103cfu/mL,104cfu/mL,105cfu/mL的沙门氏菌菌液或金黄色葡萄球菌菌液采用New Industry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取基因组。将从相同浓度的沙门氏菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液中提取到的基因组混合(按照体积比1:1进行混合，即各取1uL)后作为模板，按照上述步骤(三)所述的双重超快速PCR反应进行双重超快速PCR反应。将完成反应后的反应体系(10微升)平均分成2份，其中一份加入上述制备的Hairpin 1、Hairpin 2的超纯水溶液，另一份中加入上述制备的Hairpin3、Hairpin4的超纯水溶液；然后再分别在两份体系中加入自组装缓冲液(8mM Na2HPO4,2.5mMNaH2PO4,0.15M NaCl,2mM MgCl2,pH 7.4)，并使每份中每一种发夹探针(HairpinProbe)的终浓度为2μM，且两份体系均为10微升；均于37℃孵育20min，得核酸自组装产物；
建立核酸自组装显色体系，体系包括：取10μL核酸自组装反应产物，加入1μL氯高铁血红素(hemin)储液(10μM)，32μL G-四链体诱导缓冲液(100mM 2-(4-morpholine)ethanesulfonic acid(MES),40mMKCl,与体积百分数为0.05％Triton X-100,pH 5.5)，23μL超纯水；于37℃孵育20min；加入8μL ABTS2-储液(20mM)与8μL过氧化氢(H2O2)储液(20mM)于室温避光孵育5min。
反应完成后利用分光光度计检测反应液在415nm的OD值，绘制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌各自的标准曲线图，绘制结果如图3和图4所示。
根据绘制的标准曲线与3σ原则，确定沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的检测限分别为：10cfu/mL，10cfu/mL，说明本发明所建立的检测新方法灵敏度高。
标准曲线的绘制和检测限的确定方法按照文献Macdougall,D.,Crummett,W.B.,1980.Anal.Chem.52(14),2242-2249.所记载的方法进行。
2)准确度实验
加标回收检测实验：
将浓度为10cfu/mL的沙门氏菌菌液与10cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液分别用传统的平板检测法和本发明建立的新方法进行检测，检测结果如表5所示，本发明所建立的检测新方法(检测过程同上述灵敏度实验过程一致，不同的地方只是提取的是浓度均为10cfu/mL的沙门氏菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液的基因组DNA，提取后，各取1μL混合后作为模板)所检测出的平均菌落数接近于传统平板检测法检测出的平均菌落数，说明本发明所建立的检测新方法准确度高。
表5
3)特异性实验
将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌与大肠杆菌在LB培养基中过夜培养活化，制备成10cfu/mL的沙门氏菌菌液、10cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液、100cfu/mL的志贺氏杆菌菌液、100cfu/mL的大肠杆菌菌液，采用New Industry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取不同菌液中的基因组DNA。将从沙门氏菌菌液与志贺氏杆菌菌液中提取的基因组各取1μL混合作为模板,计为反应体系1；将从大肠杆菌菌液与金黄色葡萄球菌菌液中提取的基因组各取1μL混合作为模板,计为反应体系2；将从沙门氏菌菌液与金黄色葡萄球菌菌液中提取的基因组各取1μL混合作为模板,计为反应体系3，按照上述步骤(三)所述的双重超快速PCR反应(除模板做相应的替换外，其它均一致)进行3组反应体系的双重超快速PCR反应。
将上述表2所列的4条发夹探针(HairpinProbe)：Hairpin 1，Hairpin 2，Hairpin3，Hairpin 4分别用超纯水溶解至100μM，于95℃加热5min，后缓慢降至室温备用。
分别将完成反应后的3组反应体系(10微升)平均分成4份，每组反应体系的第一份分别加入到3个编号均为1的微孔1中(Hairpin 1与Hairpin 2的超纯水溶液提前溶解在微孔1中)，每组反应体系的第二份分别加入到3个编号均为2的微孔2中(Hairpin 3与Hairpin4的超纯水溶液提前溶解在微孔2中)，每组反应体系的其余两份分别添加到3个微孔3与3个微孔4中(微孔3与微孔4则不放置任何Hairpin作为阴性对照)，再分别在每个微孔中加入自组装缓冲液(8mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,0.15M NaCl,2mM MgCl2,pH 7.4)，并使每一种发夹探针(HairpinProbe)的终浓度为2μM，每个微孔均为10微升，均于37℃孵育20min，得核酸自组装产物；
在每个微孔中加入1μLhemin储液(10μM)，32μL G-四链体诱导缓冲液(100mM 2-(4-morpholine)ethanesulfonic acid(MES),40mMKCl,与体积百分数为0.05％Triton X-100,pH 5.5)，23μL超纯水；于37℃孵育20min；加入8μL ABTS2-储液(20mM)与8μL过氧化氢(H2O2)储液(20mM)于室温避光孵育5min。
实验结果如图5所示，本发明所建立的检测方法对志贺氏杆菌、大肠杆菌无交叉反应，可同时实现沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的双重特异性检测
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种双重致病菌的比色传感新方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagagagag agggaaagag agag 24
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctctcttt ccctctctct ctcttttttg tgaaattatc gccacgttcg ggcaa 55
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatcgcacc gtcaaaggaa cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaggtagta ggttgtatag tt 22
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aactatacaa cctactacct caaaaaaaaa aaagcacata acaagcg 47
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gataaagaag aaaccagcag 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agggcgggtg ggtggg 16
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgggtgggta gggcggg 17
<210> 9
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agggcgggtg ggtctctctc tttccctctc tctctctcgg cagagagaga gagggaaagt 60
gggt 64
<210> 10
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggtagaga gagagaggga aagagagagc tttccctctc tctctctgcc gtgggtaggg 60
cggg 64
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agggcgggtg ggtagtaggt tgtatagttc aaagtaacta tacaacctac tacctcatgg 60
gt 62
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggtacttt gaactataca acctacttga ggtagtaggt tgtatagttt gggtagggcg 60
gg 62

Claims (10)

1.一种检测方法，所述方法包括体外核酸扩增技术,所述体外核酸扩增技术的反应体系包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物包括：互补序列A、连接臂、互补序列B和可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述连接臂位于所述互补序列A和互补序列B之间，所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列位于所述上游引物的5’端或3’端；所述互补序列A和所述互补序列B的核苷酸序列互补和/或反向互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构；所述下游引物包括可特异性扩增待测目标的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-2)中的至少一种：
1)所述体外核酸扩增技术包括超快速PCR反应，所述超快速PCR反应的反应过程包括：90-98℃，2-6s；50-60℃，2-8s；共20-40个循环
2)所述连接臂包括具长链结构的化合物。
3.根据权利要求1和/或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-8)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
2)所述下游引物包括序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID№：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
4)所述下游引物包括将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
5)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：5所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
6)所述下游引物包括序列表中SEQ ID №：6所示的核苷酸序列；
7)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：4和/或SEQ ID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：4和/或SEQ ID№：5所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；
8)所述下游引物包括将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
4.一种检测方法，所述方法包括核酸自组装显色反应,所述核酸自组装显色反应的反应体系包括发卡序列，其特征在于，所述发卡序列包括：构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列、互补序列C和互补序列D；所述构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列位于所述发卡序列的5’端和/或3’端；所述互补序列C与另一个发卡序列的互补序列C互补和/或反向互补；所述互补序列D与待测目标或与待测目标连接的核苷酸序列互补和/或反向互补。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发卡序列包括下述1)-4)中的至少一种：
1)序列表中SEQ ID №：9所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：9所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
2)序列表中SEQ ID №：10所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：10所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
3)序列表中SEQ ID №：11所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：11所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
4)序列表中SEQ ID №：12所示的核苷酸序列和/或SEQ ID №：12所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
6.根据权利要求4和/或5所述的方法，其特征在于，所述核酸自组装显色反应还包括下述1)-2)中所述的至少一种：
1)所述核酸自组装显色反应的反应条件包括于37℃孵育20min；
2)所述核酸自组装显色反应的反应体系中，所述发夹序列的终浓度为2μM。
7.一种检测方法，其特征在于，所述方法包括先通过权利要求1、2和/或3所述方法扩增待测目标，然后再通过权利要求4、5和/或6所述方法检测待测目标；具体的，其中，权利要求4所述互补序列D与权利要求1所述的互补序列A和/或互补序列B互补或反向互补。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-4)中至少一种：
1)通过最终反应体系的颜色变化判断待测物中是否含有待测目标；
2)通过最终反应体系的颜色来制作标准曲线的方法来计算待测物中的待测目标的浓度；
3)通过增加反应体系中的发夹序列的种类来放大待测目标的检测信号；
4)通过增加反应体系中的上游引物或下游引物的种类，和同时增加发夹序列的种类来实现双重或多重检测。
9.一种试剂盒和/或生物传感器，其特征在于，所述试剂盒和/或生物传感器包括下述1)-2)所述中的至少一种：
1)上游引物和下游引物，所述上游引物包括：互补序列A、连接臂、互补序列B和可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述连接臂位于所述互补序列A和互补序列B之间，所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列位于所述上游引物的5’端或3’端；所述互补序列A和所述互补序列B的核苷酸序列互补和/或反向互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增过程中新链延伸的结构；所述下游引物包括可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；
2)发卡序列，所述发卡序列包括：构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列、互补序列C和互补序列D；所述构成G-四链体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列位于所述发卡序列的5’端和/或3’端；所述互补序列C与另一个发卡序列的互补序列C互补和/或反向互补；所述互补序列D与待测目标或与待测目标连接的核苷酸序列互补和/或反向互补。
10.权利要求1、2和/或3所述方法、权利要求4和/或5所述方法、权利要求6和/或7所述方法、权利要求8和/或9所述试剂盒和/或生物传感器的应用。
CN201810128946.4A 2018-02-08 2018-02-08 一种双重致病菌的比色传感新方法 Pending CN108251514A (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810128946.4A CN108251514A (zh) 2018-02-08 2018-02-08 一种双重致病菌的比色传感新方法
PCT/CN2018/099324 WO2019153675A1 (zh) 2018-02-08 2018-08-08 一种双重致病菌的比色传感新方法
CA3059288A CA3059288C (en) 2018-02-08 2018-08-08 Novel colorimetric sensing method for dual pathogen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810128946.4A CN108251514A (zh) 2018-02-08 2018-02-08 一种双重致病菌的比色传感新方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108251514A true CN108251514A (zh) 2018-07-06

Family

ID=62744310

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810128946.4A Pending CN108251514A (zh) 2018-02-08 2018-02-08 一种双重致病菌的比色传感新方法

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN108251514A (zh)
CA (1) CA3059288C (zh)
WO (1) WO2019153675A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109082459A (zh) * 2018-07-18 2018-12-25 桂林理工大学 Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法
CN109207615A (zh) * 2018-10-12 2019-01-15 广东省生态环境技术研究所 一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒
WO2019153675A1 (zh) * 2018-02-08 2019-08-15 中国农业大学 一种双重致病菌的比色传感新方法
CN111154843A (zh) * 2020-04-07 2020-05-15 中国农业大学 一种基于超速pcr与功能核酸显色的定量检测方法
CN111154844A (zh) * 2020-04-07 2020-05-15 中国农业大学 一种基于超速pcr与功能核酸的可视化检测方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114214392A (zh) * 2021-11-17 2022-03-22 广东省科学院生态环境与土壤研究所 一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1274847A (zh) * 2000-06-02 2000-11-29 上海长征医院 标记信号放大探针的制备方法
CN102827836B (zh) * 2012-06-11 2014-03-12 中国科学院成都生物研究所 一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法
CN103993100B (zh) * 2014-06-17 2017-02-15 东南大学 一种提高基因连接测序准确性的方法
CN105018474A (zh) * 2014-08-22 2015-11-04 江苏省原子医学研究所 一种基于g-四链体-氯血红素dna酶的探针及其应用
CN108251514A (zh) * 2018-02-08 2018-07-06 中国农业大学 一种双重致病菌的比色传感新方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIAN ET AL.: "Visual single cell detection of dual-pathogens based on multiplexsuper PCR (MS-PCR) and asymmetric tailing HCR (AT-HCR)", 《SENSORS AND ACTUATORS B》 *
陈东梅: "DNA电化学生物传感器在汞和凝血酶分析检测中的应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019153675A1 (zh) * 2018-02-08 2019-08-15 中国农业大学 一种双重致病菌的比色传感新方法
CN109082459A (zh) * 2018-07-18 2018-12-25 桂林理工大学 Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法
CN109207615A (zh) * 2018-10-12 2019-01-15 广东省生态环境技术研究所 一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒
CN109207615B (zh) * 2018-10-12 2021-06-29 广东省生态环境技术研究所 一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒
CN111154843A (zh) * 2020-04-07 2020-05-15 中国农业大学 一种基于超速pcr与功能核酸显色的定量检测方法
CN111154844A (zh) * 2020-04-07 2020-05-15 中国农业大学 一种基于超速pcr与功能核酸的可视化检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3059288A1 (en) 2019-08-15
WO2019153675A1 (zh) 2019-08-15
CA3059288C (en) 2022-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108251514A (zh) 一种双重致病菌的比色传感新方法
Zhang et al. Visual detection for nucleic acid-based techniques as potential on-site detection methods. A review
CN109207567B (zh) 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法
CN111187804A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a的肺炎支原体核酸快速检测试剂盒及其检测方法
CN108796131A (zh) 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用
JP2017136086A (ja) 標的核酸の検出方法及びキット
CN110592187A (zh) 基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法
CN102827929A (zh) 一种核酸检测方法
Shin et al. Sensitive and simultaneous detection of hygiene indicator bacteria using an enhanced CRISPR/Cas system in combination with a portable fluorescence detector
CN107236795A (zh) 一种磁分离rca合成dna酶检测金黄色葡萄球菌的方法
Hu et al. Rapid and visual detection of Vibrio parahaemolyticus in aquatic foods using blaCARB-17 gene-based loop-mediated isothermal amplification with lateral flow dipstick (LAMP-LFD)
Tian et al. dsDNA/ssDNA-switchable isothermal colorimetric biosensor based on a universal primer and λ exonuclease
US20220098645A1 (en) Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella&#39;s classical culture method
Zhang et al. Self-assembly of multivalent aptamer-tethered DNA monolayers dedicated to a fluorescence polarization-responsive circular isothermal strand displacement amplification for Salmonella Assay
Lu et al. Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP)
De Falco et al. Next-generation diagnostics: Augmented sensitivity in amplification-powered biosensing
CN103421897B (zh) 针对志贺氏菌(sh)的rna恒温扩增核酸检测试剂盒
AU2020101818A4 (en) A novel LAMP method, primer set and kit for SNP detection
Wang et al. Amine-functionalized quantum dots as a universal fluorescent nanoprobe for a one-step loop-mediated isothermal amplification assay with single-copy sensitivity
Wang et al. Graphene-oxide-based bioassay for the fluorometric determination of agrC gene transcription in methicillin-resistant Staphylococcus aureus that uses nicking-enzyme-assisted target recycling and a hybridization chain reaction
CN102936625B (zh) 一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒
Yang et al. Ultrasensitive detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using a T7 exonuclease-assisted PAM-free dual CRISPR-Cas12a biosensor
CN111154844B (zh) 一种基于超速pcr与功能核酸的可视化检测方法
CN110387429B (zh) 用于大肠杆菌o157:h7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用
CN103571942A (zh) 一种副溶血弧菌vp核酸恒温扩增方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180706