CN109082459A - Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法 - Google Patents

Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法。靶序列的两端分别与CdS量子点指示探针和磁珠捕获探针杂交形成“三明治结构”，加入Taq DNA连接酶修补两探针的空隙，退火连接—变性解链的循环，以靶序列为模板引发两探针之间的链式反应，CdS量子点探针与磁珠探针通过共价键连接，方波伏安法测定Cd2+溶出信号，溶出信号与靶序列的浓度的对数值成良好的线性关系；当靶序列存在错配时，连接反应不能进行，检测不到电信号，从而达到了检测单核苷酸多态性的目的。本发明简单快速、灵敏度高、选择性好、仪器成本低，在单核苷酸多态性分析中有着重要的实际意义和发展前景。

Description

Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单 核苷酸多态性的方法
技术领域
本发明涉及一种基于Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法，属于分子生物学和核酸化学领域。
背景技术
核酸作为一种重要的遗传物质，负责遗传信息的储存和发布，在生命过程中扮演着重要的角色，研究发现，生命组织、细菌、病菌和病毒均具有特定的核酸序列，检测这些特定的序列以及对其中单碱基突变的检测在流行病、传染病、肿瘤以及遗传疾病的早期诊断和治疗方面都具有十分深远的意义。
随着分子生物学和生物技术的发展，DNA检测技术日趋完善，为DNA生物传感器的构建创造了条件。在基因分析中，DNA传感器的出现大大缩短了分析时间，灵敏度高，选择性好，不仅可以进行分子识别，而且还可以对基因分离纯化，在DNA检测领域发挥着重要的作用。
DNA连接酶是生物体中重要的分子，在DNA的修复中起着重要的作用，能够催化磷酸二酯键的形成，将两段相分离的核苷酸序列相结合形成一条核苷酸链。其中，Taq DNA连接酶仅当寡核苷酸与互补靶DNA完全配对并且它们之间没有空隙时才会发生连接，可以用来检测SNPs；由于其耐热性好并可在 PCR 和连接酶链式反应过程中掺入磷酸化寡核苷酸的特点，它常被应用在连接酶检测反应（LDR）和连接酶链式反应（LCR）对等位基因特异性检测中。
量子点由于其纳米级尺寸、高表面活性及高比表面积等特性对外界的光、电、温度等物理条件十分敏感，外界环境中的细微变化就会迅速引起其表面或界面粒子价态和电子转移行为的显著变化，基于生物大分子引起的量子点（QDs）表面电化学行为变化而构建的电化学生物传感器，具有响应灵敏度高、速度快且选择性优良的特点。而且，不同的量子点表现出不同的伏安特性，故能应用于同时检测多目标核苷酸混合物。
电化学检测技术具有分析设备简单、检测速度快、目标物质用量少和易于实现自动化等优点，在DNA的检测研究中受到越来越多的关注和应用。同时，由于纳米技术的快速发展，许多纳米粒子和纳米材料与电化学检测技术相结合，建立具有高灵敏度、高选择性的DNA电化学传感器，应用于DNA片段的灵敏测定尤其是单核苷酸多态性的灵敏、快速和准确的识别，成为DNA电化学传感器的发展趋势。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法。
具体步骤为：
（1）CdS量子点的制备：在100 mL分析纯正庚烷和2 mL水的混合液中加入7 g双二乙基琥珀酸钠（AOT），室温下搅拌溶解形成油包水微乳液；将所得混合物分成60 mL和40 mL两份，分别加入240μL 浓度为1 mol/L Cd(NO3)2溶液和160μL浓度为 1 mol/L 的Na2S溶液，室温下分别搅拌1小时后；在氮气保护下将Cd(NO3)2溶液滴加到Na2S溶液中，产生CdS纳米粒子，搅拌反应1小时；在混合物中依次加入170μL浓度为 0.32 mol/L的半胱氨酸溶液和330μL 浓度为0.32 mol/L 2-巯乙基磺酸钠溶液，在氮气保护下搅拌24小时，真空蒸发溶剂，残余物依次用分析纯吡啶、分析纯正己烷、无水丙酮、无水甲醇清洗并离心分离，将所得离心液40℃真空干燥即为CdS量子点。
（2）量子点指示探针（CdS-RP探针）的制备：取2 mg步骤（1）所得CdS量子点加入到1mL超纯水中超声分散得到CdS量子点饱和溶液，在450 μL pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲溶液)中加入0.0086g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.0052g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再加入50 μL表面修饰羧基的CdS量子点饱和溶液和100 μL浓度为 10μmol/L 的氨基化的DNA（RP）溶液，混合震荡反应24小时；取出混合液，于8000 rpm下离心40分钟，小心去除上层液体，将下层沉淀分散于500 μL pH7.4的PBS缓冲溶液，即制得CdS-RP探针，在4℃低温下保存备用。
（3）磁珠捕获探针（MB-CP）的制备：取50 μL磁珠用100 μL 浓度为0.1 mol/L的咪唑缓冲溶液清洗三次，分散于450 μL PBS缓冲溶液，加入100 μL 浓度为10 μmol/L 的氨基化的DNA（CP）溶液、0.0115g的EDC和0.0069g 的NHS将混合溶液震荡反应24小时；取出混合液，磁性分离，小心吸取上清液，先用pH7，NaCl浓度为0.3 mol/L，柠檬酸钠浓度为30 mmol/L的缓冲液（2×SSC溶液）清洗磁珠三次，后用焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水(DEPC水)清洗两次，将磁珠分散于500 μL pH7.4的PBS缓冲溶液，4℃低温下保存备用。
（4）杂交与Taq DNA 连接酶连接：在几组PCR管中依次加入10 μL 步骤（2）所制备的CdS-RP探针溶液、10μL步骤（3）中所制备的 MB-CP探针溶液、14.5μL DEPC水和5 μL 10×Taq连接酶缓冲溶液以及10 μL不同浓度DNA-7a目标溶液混合，（干扰实验中加入10 μLDNA-7e溶液，空白试验中则加入10 μL TE缓冲溶液），在各组混合液中加入0.5 μL Taq DNA连接酶，用移液枪小心吹打混合均匀；将上述混合液于PCR仪内控制温度在45℃杂交、连接5分钟，85℃下解链30秒，反复循环20次。取出溶液，磁性分离，分别用50 μL 浓度为0.1 mol/L pH 7.0 PBS缓冲溶液（含体积百分比浓度为0.2% 的tween-20）在95℃下清洗和50 μLDEPC水清洗，磁性分离，加入1 mol/L 浓度为HNO3溶液100 μL消解10分钟。
基于Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测SNPs的方法，电化学检测的具体步骤为：用0.05 µm Al2O3抛光粉末，在麂皮上将玻碳电极打磨抛光，分别用无水乙醇和二次水超声清洗5分钟和3分钟，将三电极与电化学工作站相连接，应用循环伏安法检测铁氰化钾溶液，当两峰相距小于100 mV时，工作电极能正常使用，当超出100 mV时重新打磨抛光，直至达到标准。将上述HNO3消解溶液全部转移至3 mL含有5 mg/L Bi3+的醋酸缓冲溶液（pH 4.6）中，应用玻碳电极在-1.1 V电位下搅拌富集400秒，静置30秒，于-1.1 V~ -0.3 V范围内进行方波伏安法扫描，记录电化学响应。应用时间-电流曲线方法将电位加至0.3 V，清洗电极表面400秒，使电极表面膜完全溶出。
本发明方法的优点如下：
将Taq DNA连接酶的选择性以及耐热性和量子点的电信号放大作用相结合，建立一种灵敏度高、特异性好的DNA电化学检测新方法。如果目标DNA存在一个错配的碱基时，就不会和探针互补，连接效率低甚至不能连接，检测不出Cd2+信号，从而达到了检测单核苷酸多态性的目的。因此，本方法简单快速、灵敏度高、选择性好、仪器成本低，在单核苷酸多态性分析中有着重要的实际意义和发展前景。
附图说明
图1为本发明电化学检测单核苷酸多态性的方法原理图。
图2为本发明中所用DNA的序列图。
图3为本发明实施例CdS量子点的透射电镜（TEM）表征图。
图4为本发明实施例CdS量子点的红外光谱（IR）图。
图5为本发明实施例CdS-RP，MB-CP探针的紫外光谱（UV）图。
图6本发明实施例中方波伏安法检测单核苷酸多态性表征图。
具体实施方式
以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做详细说明。
实施例：
（1） CdS量子点的制备：在100 mL分析纯正庚烷和2mL水的混合液中加入7 g双二乙基琥珀酸钠（AOT），室温下搅拌溶解形成油包水微乳液。将所得混合物分成60 mL和40 mL两份，分别加入240μL浓度为 1 mol/L Cd(NO3)2溶液和160μL 浓度为1 mol/L 的Na2S溶液，室温下分别搅拌1 小时后；在氮气保护下将Cd(NO3)2溶液滴加到Na2S溶液中，产生CdS纳米粒子，搅拌反应1小时；在混合物中依次加入170μL浓度为 0.32 mol/L的半胱氨酸溶液和330μL浓度为 0.32 mol/L 2-巯乙基磺酸钠溶液，在氮气保护下搅拌24小时，真空蒸发溶剂，残余物依次用分析纯吡啶、分析纯正己烷、无水丙酮、无水甲醇清洗并离心分离，将所得离心液40℃真空干燥即为CdS量子点。
（2）量子点指示探针（CdS-RP）探针的制备：取2 mg步骤（1）所得CdS量子点加入到1mL超纯水中超声分散得到CdS量子点饱和溶液，在450 μL pH7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲溶液)中加入0.0086g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.0052g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再加入50 μL表面修饰羧基的CdS量子点饱和溶液和100 μL 浓度为10 μmol/L 氨基化的DNA溶液（RP溶液），混合震荡反应24小时；取出混合液，于8000 rpm下离心40分钟，小心去除上层液体，将下层沉淀分散于500 μL pH 7.4 PBS缓冲溶液，即制得CdS-RP探针，在4℃低温下保存备用。
（3）磁珠捕获探针（MB-CP）的制备：取50 μL磁珠用100 μL 浓度为0.1 mol/L的咪唑缓冲溶液清洗三次，分散于450 μL PBS缓冲溶液，加入100 μL 浓度为10 μmol/L 的氨基化的DNA（CP）溶液、0.0115g的EDC和0.0069g 的NHS将混合溶液震荡反应24小时；取出混合液，磁性分离，小心吸取上清液，先用pH7，NaCl浓度为0.3 mol/L，柠檬酸钠浓度为30 mmol/L的缓冲液（2×SSC溶液）清洗磁珠三次，后用焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水(DEPC水)清洗两次，将磁珠分散于500 μL pH7.4的PBS缓冲溶液，4℃低温下保存备用。
（4）杂交与Taq DNA 连接酶连接：在七组PCR管中依次加入10 μL 步骤（2）所制备的CdS-RP探针溶液、10μL步骤（3）所制备的 MB-CP探针溶液、14.5μL DEPC水和5 μL 10×连接酶缓冲溶液以及10 μL不同浓度（1 fM～100 nM）DNA-7a目标溶液混合，（干扰实验中加入10 μL DNA-7e溶液，空白试验中则加入10 μL TE缓冲溶液），在各组混合液中加入0.5 μLTaq DNA连接酶，用移液枪小心吹打混合均匀。将上述混合液于PCR仪内控制温度在45℃杂交、连接5分钟，85℃下解链30秒，反复循环20次。取出溶液，磁性分离，分别用50 μL 0.1mol/L pH7.0 PBS缓冲溶液（含体积百分比浓度为0.2% 的tween-20）在95℃下清洗和50 μLDEPC水清洗，磁性分离，加入100 μL浓度为1 mol/L的 HNO3溶液消解10分钟。
（5）电化学检测的具体步骤为：用0.05 µm Al2O3抛光粉末，在麂皮上将玻碳电极打磨抛光，分别用无水乙醇溶液和二次水超声清洗5分钟和3分钟，将三电极与电化学工作站相连接，应用循环伏安法检测铁氰化钾溶液，当两峰相距小于100 mV时，工作电极可正常使用，当超出100 mV时重新打磨抛光，直至达到标准。将上述HNO3消解溶液全部转移至3 mL含有5 mg/L Bi3+的醋酸缓冲溶液（pH 4.6）中，应用玻碳电极在-1.1 V电位下搅拌富集400秒，静置30秒，于-1.1 V ~ -0.3 V范围内进行方波伏安法扫描，记录电化学响应。应用时间-电流曲线方法将电位加至0.3 V，清洗电极表面400秒，使电极表面膜完全溶出。
通过分析电化学检测SNPs的原理，如图1所示，首先设计指示探针RP和捕获探针CP分别与DNA-7a两端互补，RP探针修饰CdS量子点，捕获探针CP修饰在磁珠上，把修饰有指示探针的量子点和修饰有捕获探针的磁珠与待测DNA混合，高温使双链DNA解链，降温后，如果溶液中存在靶序列DNA-7a，CdS-RP和MB-CP与DNA-7a完全互补杂交形成三明治结构，加入Taq DNA连接酶，在合适的条件下修补其缺口，从而把两段相邻的DNA链（RP和CP）通过磷酸二酯键连成完整的链。当温度升高时，双链DNA变性成为单链，DNA-7a和Taq DNA连接酶被释放下来，当温度再次降低时，DNA-7a继续作为模板引发Taq DNA连接酶连接两个探针，如此经过多次热循环，溶液中大量的CdS-RP与MB-CP相连接，磁性分离后，加入硝酸使连接在磁珠上的CdS量子点探针溶出为Cd2+，采用方波溶出法对Cd2+进行检测，溶出信号随着DNA-7a浓度的增大而增大。Taq DNA连接酶具有很强的区分单碱基错配的能力，如果目标DNA存在一个错配序列（DNA-7e）时，形成的三明治结构就会存在碱基错配，连接效率低甚至不能连接，经过磁性分离，高温清洗后，CdS-RP探针被分离出去而检测不出Cd2+信号，从而达到了检测SNPs的目的。
图2为本发明所用的DNA序列图。
通过透射电镜分析研究CdS量子点的粒径分布和分散性，从图3的透射电镜照片可以看出，微乳液法合成的CdS量子点粒径较为均一，且分散性很好，没有形成大颗粒的团聚。经粒径统计结果分析，平均粒径为4.39 nm左右。
通过红外表征研究CdS量子点表面修饰情况，从图4红外谱图可以看出，在1602cm-1附近有窄、强吸收峰，是C=O的伸缩振动峰，在3426 cm-1处宽而散的峰是-OH的伸缩振动峰，1398 cm-1是-OH的剪式振动峰，说明有-COOH存在；2933 cm-1处有两个中强度吸收峰，是-NH2的不对称振动和伸缩振动峰，说明存在-NH2，在2600 - 2550 cm-1没有出现-SH的特征峰，说明-SH已经解离，并与量子点上的Cd配位。
通过紫外光谱测定分析CdS量子点、磁珠与RP、CP探针的偶联情况。从图5(a)可以看出，CdS量子点与指示探针RP偶联后在260nm处出现了一个新的DNA吸收峰，证明量子点和RP探针偶联成功；从图5(b)可以看出，磁珠和捕获探针CP偶联后在260nm出现一个新的DNA吸收峰，证明磁珠和量子点偶联成功。
通过使用方波溶出伏安法对方法进行表征，由图6可以看出，当存在目标DNA-7a时，可与 MB-CP探针和CdS-RP探针对应互补杂交，以其为模板触发连接酶的连接，MB-CP探针将电化学探针CdS-RP探针捕获，因而在-0.8 V左右有一个形态良好的Cd2+还原峰（a）。而当溶液中不存在任何目标物时，只在-0.8 V左右出现一个很小的信号峰（c），说明上述高温洗涤分离过程很好地去除了量子点在磁珠表面的吸附。当溶液中加入相同浓度的干扰DNA-7e时，由于干扰DNA-7e与捕获探针和指示探针不互补，杂交效率低，不能够有效地触发连接酶的连接反应，在磁性分离和高温洗涤后，原溶液中CdS-RP探针被大部分除去，只出现一个很小的背景信号峰，其大小与空白溶液（c）峰高相近。实验结果表明，方法具有很高的选择性，可以很好地区分目标DNA和存在错配的DNA。
以上仅是本发明的优选实施方案，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于具体步骤为：
（1） CdS量子点的制备：在100 mL分析纯正庚烷和2mL水的混合液中加入7 g双二乙基琥珀酸钠即AOT，室温下搅拌溶解形成油包水微乳液；将所得混合物分成60 mL和40 mL两份，分别加入240μL浓度为 1 mol/L Cd(NO3)2溶液和160μL 1 mol/L Na2S溶液，室温下分别搅拌1 小时后；在氮气保护下将Cd(NO3)2溶液滴加到Na2S溶液中，产生CdS纳米粒子，搅拌反应1小时；在混合物中依次加入170μL浓度为 0.32 mol/L的半胱氨酸溶液和330μL浓度为0.32 mol/L 2-巯乙基磺酸钠溶液，在氮气保护下搅拌24小时，真空蒸发溶剂，残余物依次用分析纯吡啶、分析纯正己烷、无水丙酮、无水甲醇清洗并离心分离，将所得离心液40℃真空干燥即为CdS量子点；
（2）量子点指示探针即CdS-RP探针的制备：取2 mg步骤（1）所得CdS量子点加入到1 mL超纯水中超声分散得到CdS量子点饱和溶液，在450 μL pH7.4磷酸缓冲盐溶液即PBS缓冲溶液中加入0.0086g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐即EDC和0.0052g的N-羟基琥珀酰亚胺即NHS，再加入50 μL表面修饰羧基的CdS量子点饱和溶液和100 μL 浓度为10μmol/L 氨基化的DNA溶液即RP溶液，混合震荡反应24小时；取出混合液，于8000 rpm下离心40分钟，小心去除上层液体，将下层沉淀分散于500 μL pH 7.4 PBS缓冲溶液，即制得CdS-RP探针，在4℃低温下保存备用；
（3）磁珠捕获探针即MB-CP探针的制备：取50 μL磁珠用100 μL 浓度为0.1 mol/L的咪唑缓冲溶液清洗三次，分散于450 μL PBS缓冲溶液，加入100 μL 浓度为10 μmol/L 的氨基化的DNA溶液即CP溶液，0.0115g的EDC和0.0069g 的NHS将混合溶液震荡反应24小时；取出混合液，磁性分离，小心吸取上清液，先用pH7，NaCl浓度为0.3 mol/L，柠檬酸钠浓度为30mmol/L的缓冲液即2×SSC溶液清洗磁珠三次，后用焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水即DEPC水清洗两次，将磁珠分散于500 μL pH7.4的PBS缓冲溶液，4℃低温下保存备用；
（4）杂交与Taq DNA 连接酶连接：在七组PCR管中依次加入10 μL 步骤（2）所制备的CdS-RP探针溶液、10μL步骤（3）所制备的 MB-CP探针溶液、14.5μL DEPC水和5 μL 10×连接酶缓冲溶液，以及10 μL浓度范围在1 fM～100 nM的DNA-7a目标溶液混合，干扰实验中加入10 μL DNA-7e溶液，空白试验中则加入10 μL TE缓冲溶液，在各组混合液中加入0.5 μLTaq DNA连接酶，用移液枪小心吹打混合均匀；将上述混合液于PCR仪内控制温度在45℃杂交、连接5分钟，85℃下解链30秒，反复循环20次；取出溶液，磁性分离，分别用50 μL 0.1mol/L pH7.0且含体积百分比浓度为0.2% 的tween-20的PBS缓冲溶液在95℃下清洗和50 μL DEPC水清洗，磁性分离，加入100 μL浓度为1 mol/L的 HNO3溶液消解10分钟；
（5）电化学检测：用0.05 µm Al2O3抛光粉末，在麂皮上将玻碳电极打磨抛光，分别用无水乙醇溶液和二次水超声清洗5分钟和3分钟，将三电极与电化学工作站相连接，应用循环伏安法检测铁氰化钾溶液，当两峰相距小于100 mV时，工作电极可正常使用，当超出100 mV时重新打磨抛光，直至达到标准；将上述HNO3消解溶液全部转移至3 mL pH 4.6含有5 mg/LBi3+的醋酸缓冲溶液中，应用玻碳电极在-1.1 V电位下搅拌富集400秒，静置30秒，于-1.1 V~ -0.3 V范围内进行方波伏安法扫描，记录电化学响应；应用时间-电流曲线方法将电位加至0.3 V，清洗电极表面400秒，使电极表面膜完全溶出。
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