CN105301085A - 一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素氯霉素四环素三种抗生素残留的方法 - Google Patents

一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素氯霉素四环素三种抗生素残留的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素氯霉素四环素三种抗生素残留的方法，属于分析化学技术领域。本发明设计合成了三段互补cDNA1序列，分别与三种抗生素适配体DNA序列互补，同时还与三种抗生素各自的捕获探针DNA序列和互补cDNA2序列部分互补。三种cDNA1首先和各自互补的适配体DNA杂交形成双链DNA，当样品中存在目标抗生素时，适配体DNA优先与其对应的抗生素结合使双链DNA去杂交并释放出cDNA1。游离cDNA1与修饰在金电极表面的捕获探针DNA结合，三种量子点修饰的cDNA2与cDNA1的另一端杂交。金电极表面的三种量子点经酸溶后会产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰。利用峰电流值的变化和抗生素浓度之间的关系实现对三种抗生素的检测。该方法具有良好的重复性、稳定性和高灵敏度，可用于对牛奶等样品中的三种抗生素残留进行直接测定。

Description

一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素氯霉素四环素三种抗生素残留的方法
技术领域
本发明涉及一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素、氯霉素、四环素三种抗生素残留的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
抗生素的科学合理使用可以造福人类，但不恰当的使用则会危害人类的健康。随着人们发现抗生素对禽畜生长有促进作用，各种抗生素便在很多国家的畜牧业中得到广泛应用。我国的饲料业也将抗生素用作添加剂，其在动物疾病防治方面起到十分显著的作用，取得了显著的经济效益。但是抗生素的滥用也同样给畜牧业造成不良影响，近年来多种食品被屡次曝光含有抗生素残留，存在安全隐患，人们对动物源性食品的安全问题也日益关注。因此，应尽快建立能够用于动物源性食品中抗生素残留检测的有效方法，提高动物源性食品的安全性。
传统的抗生素残留检测方法有微生物检测法和仪器检测法。微生物检测法应用较为广泛，其优点是费用低，一般实验室都能操作，但测定时间长，结果误差较大，操作复杂，因此不能适应高通量、高灵敏定量检测的需求。仪器检测法包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、液-质联用法（HPLC-MS）、液相色谱-串极质谱法（HPLC-MS/MS）、紫外分光光度计法（UV）、酶联免疫分析法（ELISA）等，是利用抗生素分子结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，其灵敏度高，准确性好，但往往设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高，分析费时而不易推广。而抗生素的滥用还会造成动物源性食品中多种抗生素残留物同时存在，因此建立高效、高灵敏度的针对多种抗生素残留同时检测的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是拟将生物传感技术，纳米生物器件构建技术及通过SELEX技术筛选出的具有特定序列的，能分别与链霉素、氯霉素、四环素特异性结合的适配体分子联合应用于动物源性食品中抗生素残留的同时检测。
本发明的技术方案：一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素，氯霉素，四环素三种抗生素残留的方法，其设计合成了三段互补DNA1序列（cDNA1s），分别与链霉素(STR)，氯霉素(CHL)，四环素(TET)这三种抗生素特异性的适配体DNA序列（Ap-DNAs）相互补，同时还与三种抗生素各自的捕获探针DNA序列（Cap-DNAs）和互补DNA2序列（cDNA2s）部分互补；三种cDNA1首先和各自互补的适配体DNA杂交形成各自的双链DNA，当样品中存在链霉素，氯霉素及四环素时，适配体DNA会优先与其对应的抗生素结合从而使得双链DNA去杂交并释放出cDNA1；游离的cDNA1与修饰在金电极表面的捕获探针DNA结合；随后PbS、CdS及ZnS三种量子点修饰的cDNA2序列进一步与cDNA1的另一端杂交；间接固定在金电极表面的三种量子点经酸溶后产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰（图1）。
本方法包括以下步骤：PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备；将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上；将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上；在金电极表面修饰三种捕获探针DNA序列；三种cDNA1序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成三种双链DNA；含有三种目标抗生素的样品与三种双链DNA混合，适配体DNA会优先与其对应的抗生素结合从而使得双链DNA去杂交并释放出cDNA1；游离cDNA1序列与对应的捕获探针DNA序列结合；加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNA1序列另一端结合；酸溶量子点；检测三种抗生素对应的溶出伏安峰电流。具体步骤为：
1、PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备
将9.22μL的巯基乙酸加入到50mL0.4mM的Pb(NO3)2溶液中，用0.5M的NaOH调pH至7，随后通氮气30min，将37.3mL1.34mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24h后即得直径在10nm左右的棕色PbS量子点，于4℃黑暗保存；
将7.68μL的巯基乙酸加入到100mL1mM的CdCl2溶液中，用0.5M的NaOH调pH至11，随后通氮气30min，将50mL1.34mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24h后即得直径在10nm左右的黄绿色CdS量子点，于4℃黑暗保存；
将38.4μL的巯基乙酸加入到50mL5mM的ZnCl2溶液中，用0.5M的NaOH调pH至8，随后通氮气30min，将50mL5mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24小时后即得直径在10nm左右的微白色ZnS量子点，于4℃黑暗保存；
2、将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上
将步骤1中配制好的三种量子点溶液各取2mL后分别用4mL10mM、pH7.4的PBS缓冲溶液悬浮，形成3份6mL的混合溶液，向每份混合溶液中加入20μL新鲜配制的10mg/mLEDC[1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]溶液活化10min，随后迅速加入30μL新鲜配制的10mg/mLsulfo-NHS[N-羟基硫代琥珀酰亚胺]溶液，10min后加入100μL1mg/mL链霉亲和素溶液并将pH调至7，将上述溶液黑暗震荡2h后用0.22μm的滤膜过滤，随后在4℃下10000r/min离心20min，去上清，水洗三次，最后重悬于2mL10mM、pH7.4的PBS溶液中于4℃黑暗保存，得链霉亲和素标记的三种量子点；
3、将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上
将三种带有生物素的cDNA2序列分别与200μL链霉亲和素标记的对应的三种量子点于37℃孵育1.5h，随后在4℃下10000r/min离心20min去上清，水洗三次，最后重悬于200μL10mM、pH7.4的PBS溶液中于4℃黑暗保存；
链霉素cDNA2浓度为1.5μM，序列为：
5’-TTCTGTCTCTCG-Biotin-3’
氯霉素cDNA2浓度为1.4μM，序列为：
5’-ACGGTCGGTTACA-Biotin-3’
四环素cDNA2浓度为1.8μM，序列为：
5’-GCTACACGCCTTT-Biotin-3’
(此处及下文所述的所有DNA序列皆用超纯水作为溶剂，不再重述)；
4、在金电极表面修饰捕获探针DNA序列
用0.5μm及0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上先后打磨金电极表面。然后对金电极进行超声清洗，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声处理5min，用超纯水清洗后，氮气吹干金电极表面。将金电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中在-0.2V～1.6V电位范围内以100mV/s的扫描速度循环扫描，于0.8V左右的出峰不再增加即可认为清洗完成。用超纯水冲洗金电极表面3次，氮气吹干，使金电极表面光滑干净。将金电极倒立放置，将三种捕获探针DNA溶液同时覆盖在金电极表面，用小离心管盖在金电极表面防止溶液过快蒸发，室温下放置过夜，使捕获探针DNA一端的巯基与金电极表面之间进行共价结合；
链霉素捕获探针DNA浓度为1μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-CGTGTTGGTGTT-3’
氯霉素捕获探针DNA浓度为1.2μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-GAGGATTCAGTGA-3’
四环素捕获探针DNA浓度为1.5μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-ATGTAGCTAGGTG-3’；
5、三种cDNA1序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成双链DNA；
将cDNA1序列与对应的适配体DNA序列两段序列于95℃加热3min，于37℃孵育1.5h；
链霉素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为0.8μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’
cDNA1：5’-GACAGAACAAAGCAGAACACCA-3’
氯霉素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为1μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’
cDNA1：5’-CCGACCGTGGGACAACTCACTGAA-3’
四环素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为1μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-CGTACGGAATTCGCTAGCGGGCGGACGCTAGGTGGTGATGCTGTGCTACACGTGTTGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’
cDNA1：5’-CGTGTAGCACAGCATCACCACCTACC-3’；
6、加入含有三种目标抗生素链霉素、氯霉素及四环素的样品
向步骤5中所述的含对应的cDNA1序列与对应的适配体DNA序列的混合溶液中同时加入含有每种抗生素链霉素、氯霉素及四环素的样品各20μL，于室温孵育1h；
7、游离cDNA1序列与捕获探针DNA序列的结合
由于适配体会优先与其对应的抗生素结合从而会使得双链DNA解旋并释放出cDNA1序列，将释放出游离cDNA1序列的溶液覆盖于修饰有捕获探针DNA序列的金电极之上，于37℃孵育1.5h；
8、加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNA1序列另一端结合
将步骤3制备的修饰有量子点的cDNA2序列的溶液覆盖于修饰cDNA1序列的金电极之上，于37℃孵育1.5h；
9、酸溶量子点
用1M的硝酸溶解间接固定在金电极上的量子点45min；
10、三种抗生素残留的检测
将酸溶后的量子点溶液加入含500μg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，随后通过玻碳电极用方波溶出伏安法进行检测，间接固定至金电极表面的三种量子点经酸溶后会产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰。检测条件如下：首先在0.6V预处理60s，随后在搅拌条件下于-1.4V沉积120s，最后用方波伏安法在-1.4V～-0.5V扫描，其中跨步电压为5mV，频率为20Hz，振幅为25mV。
本发明的有益效果：①高灵敏度、高特异性、多种靶标残留物同时检测，对动物源性食品中抗生素残留检测具有重要意义；②利用纳米颗粒易于制备、修饰，能起到很好的信号放大作用以及适配体的构象变化等实现信号转换和放大，通过合理的设计，将纳米生物技术、电化学检测等多领域的优势联合起来，可广泛应用于多领域样品的检测。
附图说明
图1：基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素，氯霉素，四环素三种抗生素残留的原理图。
图2：不同浓度链霉素存在下，峰电流值与链霉素浓度关系标准曲线图。
图3：不同浓度氯霉素存在下，峰电流值与氯霉素浓度关系标准曲线图。
图4：不同浓度四环素存在下，峰电流值与四环素浓度关系标准曲线图。
图5：标准样品中不同浓度链霉素，氯霉素及四环素存在下的方波溶出伏安图。
图6：牛奶样品中不同浓度链霉素，氯霉素及四环素存在下的方波溶出伏安图。
具体实施方式
实施例1.链霉素标准溶液峰电流值-浓度标准曲线的测定
将酸溶后含PbS量子点的溶液加入到含500μg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，用方波溶出伏安法测定，得到如图2所示峰电流值与链霉素浓度的变化关系曲线，在链霉素浓度为10-5000nM范围内，峰电流值随链霉素浓度而变化，在50-1000nM范围内，峰电流值与浓度存在线性关系，线性回归方程为y=3.849+0.0054x，R2=0.99223，式中y为峰电流值，x为链霉素浓度(nM)。
实施例2.氯霉素标准溶液峰电流值-浓度标准曲线的测定
将酸溶后含CdS量子点的溶液加入到含500μg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，用方波溶出伏安法测定，得到如图3所示峰电流值与氯霉素浓度的变化关系曲线，在氯霉素浓度为5-3000nM范围内，峰电流值随氯霉素浓度而变化，在40-1000nM范围内，峰电流值与浓度存在线性关系，线性回归方程为y=2.88834+0.00763x，R2=0.99273，式中y为峰电流值，x为氯霉素浓度(nM)。
实施例3.四环素标准溶液峰电流值-浓度标准曲线的测定
将酸溶后含ZnS量子点的溶液加入到含500μg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，用方波溶出伏安法测定，得到如图4所示峰电流值与四环素浓度的变化关系曲线，在四环素浓度为20-8000nM范围内，峰电流值随四环素浓度而变化，在100-2000nM范围内，峰电流值与浓度存在线性关系，线性回归方程为y=4.8476+0.003x，R2=0.99384，式中y为峰电流值，x为四环素浓度(nM)。
实施例4.标准样品中三种抗生素残留的同时测定
在250μL含三种双链DNA的混合溶液中加入一定浓度(空白/100nM/1μM/10μM)的三种标准抗生素溶液各20μL，于室温孵化1小时。随后按前述实验步骤操作，最后将三种量子点酸溶后的溶液加入到含500μg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中形成待检测液，用方波溶出伏安法测定，得到如图5所示的溶出伏安曲线，在-0.6V，-0.8V和-1.1V所出峰位对应的抗生素分别为链霉素，氯霉素和四环素，峰电流随抗生素浓度增大而增大。
实施例5.牛奶样品中三种抗生素残留的同时测定
此处采用往牛奶中添加与标准样品相同浓度的抗生素制备人工污染牛奶的方式获得含三种抗生素残留的牛奶样品。往牛奶样品中逐滴加入20%乙酸，调节pH到4.6，45℃水浴10min沉淀酪蛋白，然后10000r/min离心25min除去凝结的蛋白质和脂肪，最后用0.22μm的滤膜过滤，过滤后的样品再调pH到中性，得到经预处理后的牛奶样品。其他条件和步骤与实施例4相同。如图6所示，从溶出伏安曲线中峰电流值可知，经过预处理后，牛奶中基质及其预处理过程对三种抗生素的检测影响较小。

Claims (1)

1.一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素STR，氯霉素CHL，四环素TET三种抗生素残留的方法，其特征在于包括以下步骤：PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备；将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上；将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上；在金电极表面修饰三种捕获探针DNA序列；三种cDNA1序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成三种双链DNA；含有三种目标抗生素的样品与三种双链DNA混合，适配体DNA会优先与其对应的抗生素结合从而使得双链DNA去杂交并释放出cDNA1；游离cDNA1序列与对应的捕获探针DNA序列结合；加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNA1序列另一端结合；酸溶量子点；检测三种抗生素对应的溶出伏安峰电流；具体步骤为：
（1）PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备
将9.22μL的巯基乙酸加入到50mL0.4mM的Pb(NO3)2溶液中，用0.5M的NaOH调pH至7，随后通氮气30min，将37.3mL1.34mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24h后即得直径在10nm的棕色PbS量子点，于4℃黑暗保存；
将7.68μL的巯基乙酸加入到100mL1mM的CdCl2溶液中，用0.5M的NaOH调pH至11，随后通氮气30min，将50mL1.34mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24h后即得直径在10nm的黄绿色CdS量子点，于4℃黑暗保存；
将38.4μL的巯基乙酸加入到50mL5mM的ZnCl2溶液中，用0.5M的NaOH调pH至8，随后通氮气30min，将50mL5mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24小时后即得直径在10nm的微白色ZnS量子点，于4℃黑暗保存；
（2）将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上
将步骤（1）中配制好的三种量子点溶液各取2mL后分别用4mL10mM、pH7.4的PBS缓冲溶液悬浮，形成3份6mL的混合溶液，向每份混合溶液中加入20μL新鲜配制的10mg/mLEDC溶液活化10min，随后迅速加入30μL新鲜配制的10mg/mLsulfo-NHS溶液，10min后加入100μL1mg/mL链霉亲和素溶液并将pH调至7，将上述溶液黑暗震荡2h后用0.22μm的滤膜过滤，随后在4℃下10000r/min离心20min，去上清，水洗三次，最后重悬于2mL10mM、pH7.4的PBS溶液中于4℃黑暗保存，得链霉亲和素标记的三种量子点；
（3）将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上
将三种带有生物素的cDNA2序列分别与200μL链霉亲和素标记的对应的三种量子点于37℃孵育1.5h，随后在4℃下10000r/min离心20min去上清，水洗三次，最后重悬于200μL10mM、pH7.4的PBS溶液中于4℃黑暗保存；
链霉素cDNA2浓度为1.5μM，序列为：
5’-TTCTGTCTCTCG-Biotin-3’；
氯霉素cDNA2浓度为1.4μM，序列为：
5’-ACGGTCGGTTACA-Biotin-3’；
四环素cDNA2浓度为1.8μM，序列为：
5’-GCTACACGCCTTT-Biotin-3’；
所述的所有DNA序列皆用超纯水作为溶剂；
（4）在金电极表面修饰三种捕获探针DNA序列
用0.5μm及0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上先后打磨金电极表面；然后对金电极进行超声清洗，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声处理5min，用超纯水清洗后，氮气吹干金电极表面；将金电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中在-0.2V～1.6V电位范围内以100mV/s的扫描速度循环扫描，于0.8V的出峰不再增加即为清洗完成；用超纯水冲洗金电极表面3次，氮气吹干，使金电极表面光滑干净；将金电极倒立放置，将三种捕获探针DNA溶液同时覆盖在金电极表面，用小离心管盖在金电极表面防止溶液过快蒸发，室温下放置过夜，使捕获探针DNA一端的巯基与金电极表面之间进行共价结合；
链霉素捕获探针DNA浓度为1μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-CGTGTTGGTGTT-3’；
氯霉素捕获探针DNA浓度为1.2μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-GAGGATTCAGTGA-3’；
四环素捕获探针DNA浓度为1.5μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-ATGTAGCTAGGTG-3’；
（5）三种cDNA1序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成三种双链DNA；
将cDNA1序列与对应的适配体DNA序列两段序列于95℃加热3min，于37℃孵育1.5h；
链霉素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为0.8μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；
cDNA1：5’-GACAGAACAAAGCAGAACACCA-3’；
氯霉素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为1μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；
cDNA1：5’-CCGACCGTGGGACAACTCACTGAA-3’；
四环素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为1μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-CGTACGGAATTCGCTAGCGGGCGGACGCTAGGTGGTGATGCTGTGCTACACGTGTTGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’；
cDNA1：5’-CGTGTAGCACAGCATCACCACCTACC-3’；
（6）加入含有三种目标抗生素链霉素、氯霉素及四环素的样品
向步骤（5）中所述的含对应的cDNA1序列与对应的适配体DNA序列的混合溶液中同时加入含有链霉素、氯霉素及四环素的样品各20μL，于室温孵育1h；
（7）游离cDNA1序列与对应的捕获探针DNA序列结合
由于适配体会优先与其对应的抗生素结合从而会使得双链DNA解旋并释放出cDNA1序列，将释放出游离cDNA1序列的溶液覆盖于修饰有捕获探针DNA序列的金电极之上，于37℃孵育1.5h；
（8）加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNA1序列另一端结合
将步骤（3）制备的修饰有量子点的cDNA2序列的溶液覆盖于修饰cDNA1序列的金电极之上，于37℃孵育1.5h；
（9）酸溶量子点
用1M的硝酸溶解间接固定在金电极上的量子点45min；
（10）检测三种抗生素对应的溶出伏安峰电流
将酸溶后的量子点溶液加入含500μg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，随后通过玻碳电极用方波溶出伏安法进行检测，间接固定至金电极表面的三种量子点经酸溶后会产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰；检测条件如下：首先在0.6V预处理60s，随后在搅拌条件下于-1.4V沉积120s，最后用方波伏安法在-1.4V～-0.5V扫描，其中跨步电压为5mV，频率为20Hz，振幅为25mV。
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