CN109540869B

CN109540869B - 一种金霉素盐酸盐的sers检测方法

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Publication number: CN109540869B
Application number: CN201811618019.7A
Authority: CN
Inventors: 张芹; 贺路影; 苏文金
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109540869A

Abstract

一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，涉及四环素类抗生素检测。用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶，通过控制反应物的浓度、反应时间、反应温度、搅拌速度，制得粒径均一的金纳米粒子；在一定温度条件下，用金溶胶制备SERS基底，控制金霉素盐酸盐溶液的pH，加入荧光猝灭剂，在SERS基底上对金霉素盐酸盐进行表面增加拉曼检测，随着金霉素盐酸盐浓度的增加，金霉素盐酸盐在特定波长处的拉曼峰逐渐增强，利用金霉素盐酸盐拉曼特征峰的强度与金霉素盐酸盐的量成正比，对金霉素盐酸盐进行定量分析检测。具有检测限低、灵敏度高、检测的重现性好、检测速度快、样品加标回收率高等优点，可以满足快速分析检测的要求。

Description

一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法

技术领域

本发明涉及四环素类抗生素检测，尤其是涉及一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法。

背景技术

四环素类抗生素可结合到细菌核糖体30s亚基RNA转录结合位点上，抑制蛋白质的合成，起到杀菌作用(AP Carter.Functional insights from the structure of the 30Sribosomal subunit and its interactions with antibiotics[J].Nature,2000,407:340–348.)。该类抗生素抗菌活性好、使用成本低，是畜禽、水产养殖中普遍用于治疗动物疾病、预防和促进生长的一类广谱抗生素(F Granados-Chinchilla.Tetracyclines in foodand feedingstuffs:From regulation to analytical methods,bacterial resistance,and environmental and health implications[J].Journal of Analytical Methods inChemistry.2017,(1):1-24.)。其中，金霉素盐酸盐是四环素类家族中使用较普遍的抗生素，但其在水产品中的残留污染，对人体的健康会造成较大的威胁，如肾毒性、胎儿畸形等(X D Gao.Determination of terramyc-in,minocycline and aureomycin inlivestock,poultry meat and salmon by high performance liquid chromatography[J].Journal of Food Safety and Quality,2014,5(2):369–376；J H Zhao.Rapiddetermination of tetracycline content in duck meat using particle swarmoptimization algorithm and synchronous luorescence spectrum[J].Spectroscopyand Spec-tral Analysis,2013,33(11):3050-3054.)。我国规定水产品中四环素类抗生素的最大残留量限量为0.1ppm(General Adminstration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s of China and StandardizationAdministration of the People’s Republic of China,‘Fresh and frozen poultryproduct’,GB16869-2005,2005.)。欧盟规定(Co-uncil Regulation(EU)No 37/2010onpharmacologically active substances and their classification regardingmaximum residue limits in foodstuffs of animal origin)，动物源性食品中四环素类抗生素的最大残留限量为0.1ppm。因此，有必要建立水产品中四环素类抗生素残留快速分析方法。

目前，四环素类抗生素检测常用的方法包括微生物法、高效液相色谱法、液相色谱一串联质谱法、电化学适配体传感器等。微生物法因其检测周期长或稳定性差阻碍了推广应用，色谱法和质谱法较为成熟，检测精确度和灵敏度高，检测限低，但因仪器设备昂贵、样品处理耗时繁琐、基质干扰大等缺点，限制了其现场检测的应用。基于现有检测方法存在的一些不足，需要寻找简单、高效、快速检测和筛查金霉素盐酸盐的方法。

表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)作为一种物质分析技术，由于操作简单、检测速度快、需要的样品量少、样品前处理简单，被广泛应用于食品安全、化学、生物科学、微生物、药学、环境科学等有关物质的检测中，与普通拉曼相比，表面增强拉曼散射(SERS)效应可以增强吸附在金属纳米结构上的分子的拉曼信号，增强因子可以达到10¹¹，具有高度的特异性和灵敏度。而且以金溶胶作为增强基底，制备简单，易于表征，纳米粒子形状与大小可控，稳定性好，进一步增加了金溶胶纳米粒子在SERS检测中的应用。已有的利用表面增强拉曼散射检测四环素类抗生素的报道较少，其中，Zhao等人(J HZhao.Rapid Detection of Tetracycline Residues in Duck Meat Using SurfaceEnhanced Raman Spectroscopy[J].Journal of Spectroscopy,2016,2016:1-6.)利用SERS检测鸭肉中的四环素，但所用方法的检测限较高(1.12mg/L)，不能满足痕量检测的要求。Chao等人(K L Chao.A Simple Surface-Enhanced Raman Spectroscopic Method foron-Site Screening of Tetracycline Residue in Whole Milk[J].sensors,2018,18:424.)利用SERS检测了牛奶和水中的四环素，其相关系数分别为0.88和0.92，实现了现场检测，但检测结果存在较大偏差，有待优化。

发明内容

本发明的目的在于提供加标回收率高、结果可靠的一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法。

本发明包括以下步骤：

1)用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶(AuNPs溶胶)，通过控制反应物的浓度、反应时间、反应温度、搅拌速度，制得粒径均一的金纳米粒子；

在步骤1)中，所述反应物柠檬酸钠的质量浓度分数可为0.8％～1.5％，体积比可为120～150；所述氯金酸的质量浓度分数可为0.01％～0.05％，反应时间为30～50min、反应温度90～100℃、搅拌速度可为2000～3000r/min；所述金纳米粒子可为球形金纳米粒子或椭圆形金纳米粒子，所述球形金纳米粒子的粒径可为50±10nm；所述用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶的反应条件可为：在磁力搅拌下加热回流至沸腾，然后迅速加柠檬酸三钠，继续加热回流30～50min，反应后自然冷却至室温。

2)在一定温度条件下，用金溶胶制备SERS基底，控制金霉素盐酸盐溶液的pH，加入荧光猝灭剂，在SERS基底上对金霉素盐酸盐进行表面增加拉曼检测，随着金霉素盐酸盐浓度的增加，金霉素盐酸盐在特定波长处的拉曼峰逐渐增强，利用金霉素盐酸盐拉曼特征峰的强度与金霉素盐酸盐的量成正比，对金霉素盐酸盐进行定量分析检测。

在步骤2)中，所述一定温度下是将基底放置于加热板上，控制加热板的温度在50～60℃；所述SERS基底是指取合成的金纳米粒子溶胶1～1.5mL，6000～8000r/min离心，弃去上清后，加200～500μL超纯水清洗一次，浓缩至10～20μL；再取2～4μL浓缩金溶胶于加热板上，滴加于石英样品槽，制备SERS基底。

在步骤2)中，若SERS检测信号较弱，可重复步骤4～5次：取2～4μL浓缩金溶胶，加于石英样品槽内，再加入5～8μL金霉素盐酸盐水溶液，重复上述操作4～5次；所述基底是指将浓缩金溶胶与金霉素盐酸盐(在加热板上)分别加于石英基底、镀金玻片、普通载玻片、硅片基底上，制备SERS基底，进行拉曼检测，确定最佳基底；所述最佳基底为石英样品基底，为了限定加入样品的范围，在石英基底上刻一个样品槽，所述样品槽的直径可为0.2～0.5cm，深度可为0.2～0.4cm；

在步骤2)中，所述控制金溶胶与金霉素盐酸盐溶液的pH是将浓缩金溶胶与不同pH值的金霉素盐酸盐溶液(在加热板上)分别重复滴加在石英样品槽中，进行拉曼检测；所述pH值可为2～13，优选2～6；

在步骤2)中，所述荧光猝灭剂包括NaCl、KI，所述NaCl的摩尔浓度范围为1～1.2mol/L，KI的摩尔浓度范围为0.25～1.00mol/L。

在步骤2)中，所述加入荧光猝灭剂是指加入优化后的KI，其最佳摩尔浓度可为0.25～0.5mol/L。

在步骤2)中，所述金霉素盐酸盐在特定波长处的拉曼峰是指金霉素盐酸盐在1282cm^-1处的特征拉曼峰。

在步骤2)中，所述定量分析检测，是指以浓度的负对数值为横坐标，即以金霉素盐酸盐浓度的负对数为横坐标，以金霉素盐酸盐在最强特征峰1282cm^-1处的峰强为纵坐标，建立标准曲线，对金霉素盐酸盐进行定量检测，检测范围10^-4～10^-8mol/L，线性相关系数0.968，检测限2.6×10^-10mol/L。

本发明在一定温度条件下，通过优化检测基底，控制溶液的pH，加入一定量的荧光猝灭剂，通过对基底进行限域及反复滴加金纳米粒子与样液，达到对金霉素盐酸盐浓缩富集的目的，增加金霉素盐酸盐化合物通过中间环的羰基与金纳米粒子相互结合的机会，利用金霉素盐酸盐在1282cm^-1处拉曼特征峰的强度与浓度的关系，以波长1282cm^-1处的拉曼信号强度实现了对金霉素盐酸盐的低浓度、高灵敏度、可靠的快速定量分析检测。本发明检测金霉素盐酸盐的线性范围10^-4～10^-8mol/L，相关系数0.968，检测限2.6×10^-10mol/L。将该方法应用到罗非鱼中金霉素盐酸盐的加标检测中，加标回收率79.07％～86.49％，相对标准偏差1.54％～14.57％。本发明具有检测限低、灵敏度高、检测的重现性好、检测速度快、样品加标回收率高等优点，可以满足快速分析检测的要求。本发明应用到罗非鱼中金霉素盐酸盐的加标检测中，加标回收率高，结果可靠。

附图说明

图1为本发明实施例制备的金纳米粒子的扫描电子显微镜图。

图2为本发明实施例制备的石英样品槽。

图3为金霉素盐酸盐固体粉末的拉曼谱图。

图4为10^-5mol/L金霉素盐酸盐在不同基底上的SERS谱图。

图5为不同pH条件下0.1mol/L金霉素盐酸盐水溶液的紫外吸收光谱。

图6为不同pH条件下10^-5mol/L金霉素盐酸盐水溶液SERS谱图。

图7为含有不同荧光猝灭剂的10^-5mol/L金霉素盐酸盐的SERS谱图。

图8为含有不同浓度KI的10^-5mol/L金霉素盐酸盐的SERS谱图。

图9为10^-5mol/L金霉素盐酸盐在SERS基底上随机采集10个不同位置的SERS峰强的谱图。

图10为10^-5mol/L金霉素盐酸盐在SERS基底上随机采集10个不同位置的SERS峰强的柱状图。

图11为不同浓度金霉素盐酸盐的SERS信号。

图12为选定1282cm^-1最强拉曼峰的强度与金霉素盐酸盐浓度负对数的线性关系图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

2)定制石英样品槽:

定制直径0.4cm，厚度0.2cm的石英样品槽(参见图2)。

图1为步骤1)制备的Au纳米粒子的扫描电子显微镜图。在图1中，标尺为0.2μm(图1中的A图)和20nm(图1中的B图)。从图1中可以看出Au纳米粒子大小较为均一，近似球形。

图2为步骤2)中制备的直径0.4cm，厚度0.2cm的石英样品槽。将浓缩金溶胶与金霉素盐酸盐分别滴加于样品槽中，由图2可以看出，该样品槽可以起到盛放微量样品，将样品限定在特定区域的作用。

实施例2

1)合成Au纳米粒子：

2)不同基底对金霉素盐酸盐表面增强拉曼检测的影响：

取金霉素盐酸盐固体粉末，置于干净的载玻片上，盖上盖玻片，压平样品，利用Witec拉曼光谱仪，采用633nm激发波长测得金霉素盐酸盐固体粉末的常规拉曼谱图。每次测试前，均用硅片在520.6cm^-1处的峰对仪器进行校准，测试条件：功率1mW，采谱时间10s，3次平均，采谱范围600～1800cm^-1。

取步骤1)合成的Au纳米粒子1mL，7000r/min、5min浓缩清洗一次后，定容至20μL，取2μL滴加于不同基底上(样品槽，镀金玻片、普通载玻片、硅片，于55℃加热板上，以加快样品干燥的时间)，加入5μL 10^-5mol/L金霉素盐酸盐水溶液,重复上述步骤4次，共加入8μL浓缩AuNPs和20μL 10^-5mol/L，干燥后利用witec检测。

图3为实施例2金霉素盐酸盐固体粉末的拉曼谱图，图4为实施例2不同基底拉曼检测实验结果谱图。由图3金霉素盐酸盐固体粉末的拉曼谱图可知，在446cm^-1、492cm^-1、528cm^-1、1147cm^-1、1285cm^-1、1311cm^-1、1611cm^-1为金霉素盐酸盐的主要拉曼特征峰，这些峰位置与有关文献报道的金霉素盐酸盐拉曼特征峰的位置一致，其中492cm^-1归因于芳香环的弯曲振动，1285cm^-1归因于酰胺N-H与羰基C＝O振动，1311cm^-1归因于O-H、C-C伸缩弯曲振动，1611cm^-1归因于C-C、C-O、C-Cl伸缩振动。在图4中，曲线a～e分别为金霉素盐酸盐固体粉末、样品槽、镀金玻片、普通载玻片、硅片。从图中可以看出，石英样品槽(图4中的b图)得到的拉曼检测信号在1285cm^-1处最强，信号峰明显，并且可以检测到1311cm^-1处的拉曼特征峰。在1285cm^-1处，金霉素盐酸盐在不同基底上的峰强为石英样品槽(图4中的b图)>镀金玻片(图4中的c图)>载玻片(图4中的d图)>硅片(图4中的e图)，这是基于石英样品槽的样品孔可以将检测体系限定于特定的区域，达到将金霉素盐酸盐分子浓缩富集在一定的区域，增加金霉素盐酸盐分子与金纳米粒子结合的机会的目的。另外，通过测石英样品槽的接触角，发现该材质具有疏水作用，进一步为该样品槽的浓缩富集作用提供了支持。

实施例3

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(Au NPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4m L 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

2)不同pH值对金霉素盐酸盐紫外吸收光谱及表面增强拉曼检测的影响：

用HCl和NaOH调节0.1mol/L金霉素盐酸盐水溶液的pH值分别为2、6、13，紫外-可见光谱仪检测不同pH条件下的，金霉素盐酸盐水溶液的紫外吸收。

取步骤1)中合成的Au纳米粒子1mL，7000r/min、5min浓缩清洗一次后，定容至20μL，取2μL滴加于石英样品槽中(样品槽至于55℃加热板上，以加快样品干燥的时间)，加入5μL不同pH的10^-5mol/L金霉素盐酸盐水溶液，重复上述步骤4次，共加入8μL浓缩AuNPs和20μL10^-5mol/L，干燥后利用witec检测。

图5为实施例3不同pH条件下金霉素盐酸盐水溶液的紫外吸收光谱，图6为实施例2不同pH条件下金霉素盐酸盐水溶液的SERS谱图。图5不同pH条件下金霉素盐酸盐水溶液的紫外吸收光谱图中，曲线a、b、c的pH分别为2、6、13，由图5可知，在酸性条件下(pH<6，见图5曲线a和b)，金霉素盐酸盐水溶液在367nm处的紫外吸收几乎不发生变化，在碱性条件下(pH>7，见图5曲线c)金霉素盐酸盐水溶液的紫外吸收峰由367nm蓝移到347nm处，且紫外吸收峰强度降低，这主要是因为金霉素盐酸盐是酸碱两性化合物，在碱性条件下，金霉素结构发生内酯化，生成具有内脂结构的异构体，降低紫外吸收强度。由图6不同pH条件下金霉素盐酸盐水溶液SERS谱图可知，在不同pH条件下，金霉素盐酸盐其SERS检测结果也存在较大差异，pH＝2时(图6曲线b)可以看到金霉素盐酸盐在1285cm^-1处的特征峰明显，强度大，发生了3个波数的位移(位移到1282cm^-1处)，比pH＝6(图6曲线c)在1282cm^-1处的拉曼特征峰更加明显，且在pH＝2时能够检测到金霉素盐酸盐在1311cm^-1处的特征峰。而当pH＝12时(图6曲线d)，在1285cm^-1、1311cm^-1处仅有荧光包，并没有出现金霉素盐酸盐的特征拉曼峰，推测是由于金霉素盐酸盐在碱性条件下会发生内脂化，使中间环的羰基内脂化，改变了其存在形式，影响了金霉素盐酸盐中的羰基氧原子与金纳米粒子结合形成Au-O的机会，即降低了金霉素盐酸盐结合到SERS基底上的机会，而在酸性条件下(pH<6)，体系中含有较多的H⁺，金霉素盐酸盐中的二甲氨基发生差向异构化，生成差向异构体，或脱水转化成脱水金霉素，增加金霉素盐酸盐与金纳米粒子结合的机会，产生更强的拉曼信号，因此后续检测需要控制检测体系的pH在酸性条件下，以达到最佳的检测效果。

实施例4

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200mL质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4mL 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

2)不同种类及不同浓度的荧光猝灭剂对金霉素盐酸盐表面增强拉曼检测的影响：

分别用1mol/L Nacl、不同浓度的KI(1mol/L、0.75mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L)稀释10^-3mol/L金霉素盐酸盐标准溶液至10^-5mol/L，与浓缩金纳米粒子结合，进行拉曼检测。

图7和8为实施例4的实验结果谱图。由图7可知，加入1mol/L Nacl、1mol/L KI对于金霉素盐酸盐在1282cm^-1处的荧光包与未加荧光猝灭剂的检测结果相比，没有进一步改善。当加入0.1mol/L KI时金霉素盐酸盐SERS结果显示，在1282cm^-1处的峰强度显著增强，荧光包减弱，且特征峰明显。同时，可以检测到1311cm^-1处的特征峰，这说明0.1mol/L荧光猝灭剂可以降低金霉素盐酸盐在1282cm^-1处的荧光包，增加其拉曼峰的强度，因此接下来进一步探究不同浓度的KI对金霉素盐酸盐荧光猝灭的影响，寻找KI的最佳浓度，以获得最佳的检测效果，结果如图8所示。从图8可以看出，随着KI浓度的增大，金霉素盐酸盐在1282cm^-1处的峰强，呈现出先增大后减小的趋势。当KI的浓度为0.5mol/L时，1282cm^-1处的特征峰明显，强度最大，且荧光包减弱。当KI的浓度大于0.5mol/L时，1282cm^-1处的特征峰信号强度逐渐降低，这可能是由于适量的KI会改变金溶胶纳米粒子表面的电荷及表面离子的吸附，适当增加金溶胶纳米粒子的凝聚，增强金溶胶纳米粒子的局域电磁场以及金霉素盐酸盐在其表面的吸附，增强其拉曼信号。当KI过量时，则会使金溶胶纳米粒子团聚严重，降低其表面等离子体共振吸收以及局域电磁场的强度，减少金纳米子表面“hotspots”点，导致拉曼检测信号的减弱，因此接下来的实验选择加入0.5mol/L KI。

实施例5

1)合成Au纳米粒子：

用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子(AuNPs)。在沸腾条件下，向200m L质量浓度0.01％的氯金酸溶液中迅速加入1.4mL 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变成酒红色后，持续反应30min，自然冷却至室温，制备粒径约为55nm的Au纳米粒子溶胶(参见图1)。

2)SERS基底的均一性及金霉素盐酸盐的定量SERS检测：

用0.5mol/L KI将10^-3mol/L金霉盐酸盐标准溶液稀释至10^-5mol/L，将溶液的pH值调节为2，与浓缩金纳米子结合，制备SERS样，随机采点测拉曼信号，得到10个不同点对应的金霉素盐酸盐的表面增强拉曼光谱，对比不同点的拉曼强度，确定基底的均一性。

用0.5mol/L KI将10^-3mol/L金霉盐酸盐标准溶液稀释至的不同浓度(10^-4～10^- ⁸mol/L)，将溶液的pH值调节为2，与浓缩金纳米粒子结合，制备SERS样，表面增强拉曼对金霉素盐酸盐定量检测。

图9～12为实施例5的实验结果谱图。随机采点测拉曼信号，得到10个不同的点对应的金霉素盐酸盐的表面增强拉曼光谱如图9所示，通过拉曼峰的强度可以计算出在1282cm^-1处10个不同点峰强的相对标准偏差(见图10)，其值为6.47％，小于20％，说明该基底具有较好的均一性，可以作为SERS基底，用来检测金霉素盐酸盐。利用上述基底，测定10^-4～10^-8mol/L金霉素盐酸盐，结果如图11，选定1282cm^-1最强拉曼峰，以浓度的负对数为横坐标，峰强度为纵坐标绘制标准曲线(见图12)，可以看出浓度的负对数与拉曼峰强度具有一定的线性关系，线性相关系数R²＝0.97，线性范围10^-4～10^-8mol/L，可以满足国标对水产品中金霉素盐酸盐检测限量的要求，该方法检测速度快、简单、成本低。

实施例6

1)合成Au纳米粒子：

2)罗非鱼鱼肉样品的加标检测：

样品提取：

罗非鱼鱼肉样品加标提取：对国标方法适当改进后提取加标样，取研磨后的2.000g罗非鱼鱼肉样品，置于50mL具塞聚丙烯离心管中，加入8mL含有不同浓度(0mol/L、10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L)金霉素盐酸盐的Mcllvaine缓冲液(pH＝4)，加入2mL乙酸铅(浓度为20g/L)，振荡2min，10000r/min离心10min，转移上清液至另一离心管中，向残渣中继续加入8mL、6mL Mcllvaine缓冲液(不含金霉素盐酸盐)，按照上述步骤提取两次。合并上清液与50mL具塞聚丙烯离心管中，加入10mL正己烷除脂，振荡后，10000r/min离心10min，除去正己烷，收集下层液，过0.45μm微孔滤膜，收集过滤液，待净化。

净化：

5mL甲醇、5mL水活化Inert Sep HLB固相萃取小柱，弃去流出液；待净化液上样，弃去流出液；5mL水、5mL 20％甲醇水淋洗萃取柱，弃去流出液；5mL甲醇-乙酸乙酯-氨水(50︰50︰2)洗脱，收集洗脱液；将洗脱液蒸干后，加入8mL KI(0.5mol/L)溶液溶解，过0.22μm微孔滤膜，收集滤液，调节滤液pH值为2；将含不同浓度金霉素盐酸滤液，分别与浓缩金纳米粒子结合，制备SERS样，拉曼检测。

以图12中标准曲线为工作曲线，测得不同浓度金霉素盐酸盐在罗非鱼鱼肉中的加标回收结果如表1所示。由表1可知，样品的加标回收率在79.07％～86.49％，相对标准偏差1.54％～14.57％。加标回收结果表明，罗非鱼鱼肉中金霉素盐酸盐的测定回收率较高、精密度好、结果可靠。

表1

在一定的温度下，通过优化检测基底、pH值、荧光猝灭剂，检测罗非鱼样品中金霉素盐酸盐的加标回收结果见表1。

Claims

1.一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶，通过控制反应物的浓度、反应时间、反应温度、搅拌速度，制得粒径均一的金纳米粒子；

2）在50～60℃温度的条件下，用金溶胶制备SERS基底，加入荧光猝灭剂KI，所述KI摩尔浓度为0.25～0.5mol/L，控制金霉素盐酸盐溶液的pH，通过反复滴加金纳米粒子与样液对样液制备SERS基底，在SERS基底上对金霉素盐酸盐进行表面增加拉曼检测，随着金霉素盐酸盐浓度的增加，金霉素盐酸盐在特征波长1282cm^-1处的拉曼峰逐渐增强，利用金霉素盐酸盐拉曼特征峰的强度与金霉素盐酸盐的浓度负对数成正比，对金霉素盐酸盐进行定量分析检测；

所述金霉素盐酸盐在特定波长处的拉曼峰是指金霉素盐酸盐在1282cm^-1处的特征拉曼峰。

2.如权利要求1所述一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于在步骤1）中，所述柠檬酸钠的质量浓度分数为0.8%～1.5%，所述氯金酸的质量浓度分数为0.01%～0.05%，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为120～150，反应时间为30～50min、反应温度为90～100 ℃、搅拌速度为2000～3000r/min；所述金纳米粒子为球形金纳米粒子或椭圆形金纳米粒子，所述球形金纳米粒子的粒径为50±10nm。

3.如权利要求1所述一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于在步骤1）中，所述用柠檬酸钠还原氯金酸制备Au纳米粒子溶胶的反应条件为：在磁力搅拌下加热回流至沸腾，然后迅速加柠檬酸三钠，继续加热回流30～50min，反应后自然冷却至室温。

4.如权利要求1所述一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于在步骤2）中，所述在50～60℃温度的条件下是将基底放置于加热板上，控制加热板的温度在50～60 ℃；所述SERS基底是指取合成的金纳米粒子溶胶1～1.5mL，6000～8000 r/min离心，弃去上清后，加200~500µL超纯水清洗一次，浓缩至10～20µL；再取2～4 µL浓缩金溶胶于加热板上，加于样品槽内，制备SERS基底；所述样品槽采用石英样品槽。

5.如权利要求1所述一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于在步骤2）中，若SERS检测信号较弱，重复步骤4～5次，具体方法为：取2～4 µL浓缩金溶胶，加于样品槽内，再加入5～8µL金霉素盐酸盐水溶液，重复上述操作4～5次；所述基底是指将浓缩金溶胶与金霉素盐酸盐分别加于石英基底、镀金玻片、普通载玻片、硅片基底上，制备SERS基底，进行拉曼检测，确定最佳基底；所述最佳基底为石英样品基底，为了限定加入样品的范围，在石英基底上刻一个样品槽，所述样品槽的直径为0.2～0.5cm，深度为0.2～0.4cm。

6.如权利要求1所述一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于在步骤2）中，所述控制金溶胶与金霉素盐酸盐溶液的pH是将浓缩金溶胶与不同pH值的金霉素盐酸盐溶液分别重复加在样品槽中，进行拉曼检测；所述pH值为2～13。

7.如权利要求6所述一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于所述pH值为2～6。

8.如权利要求1所述一种金霉素盐酸盐的SERS检测方法，其特征在于在步骤2）中，所述定量分析检测，是指以浓度的负对数值为横坐标，即以金霉素盐酸盐浓度的负对数为横坐标，以金霉素盐酸盐在最强特征峰1282cm^-1处的峰强为纵坐标，建立标准曲线，对金霉素盐酸盐进行定量检测，检测范围10^-4～10^-8mol/L，线性相关系数0.968，检测限2.6×10^-10mol/L。