CN106066358A - 一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于链霉素检测的电化学适配体传感器的制备，将多孔碳纳米球(PCNS)、聚苯胺‑氧化铜‑金笼子(PANI‑CuO‑GM)复合物逐层修饰电极表面常温下静置至干燥，然后将链霉素适配体固定到经上述纳米材料修饰的电极表面，用牛血清蛋白作为封闭剂阻塞非特异性结合位点。将制备好的链霉素适配体传感器进行电化学测试,链霉素的浓度可通过适配体与链霉素结合前后导致适配体传感器电流变化量进行测量。本发明的链霉素适配体传感器制备及检测方法，很好地解决了当前传感器制备的繁琐程序，而且采用碳材料作为信号放大材料极大的降低了传感器制造成本，且同批次电极具有很好的同一性，可以批量生产，实现商品化。

Description

一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及链霉素痕量分析检测领域，更具体的说是一种基于碳材料电化学适配体传感器的制备与应用。
背景技术
链霉素是一种由灰色链霉菌生产得到的氨基糖苷类抗生素，是继青霉素后第2个生产并用于临床的抗生素。由于链霉素具有性质稳定、抗菌谱广、生产工艺简单、疗效好、尤其对结
对革兰氏阴性菌有独特的抑制作用，因此，得到了广泛的应用，如在人类疾病治疗中作为一种抗菌药，在动物饲养中作为一种兽药，在农作物维护中作为一种农药以及在养蜂业中作为一种治疗蜜蜂细菌性疾病的抗菌药等。
但是，使用链霉素也会引起一些严重的副作用，主要包括过敏反应，听觉神经丧失以及肾毒性反应等。当链霉素使用过量时，它会残留在肉、鸡蛋以及奶制品等食物产品中，从而对人类的身体健康造成极大的伤害。控制链霉素残留对人体的危害，最为有效的方法之一是加强对食品中链霉素残留检测的力度。因此，建立有效的、精确的以及经济实用的检测链霉素残留的方法对于食品安全的控制有着重要的作用。
目前，链霉素常用检测方法主要为高效液相色谱法(HPLG)、色谱-质谱串联(LG-MS)和免疫检测法。在上述仪器检测法中，HPLC法检测链霉素残留的准确性以及灵敏性较好。但由于链霉素缺少发色团，因此常常要用到柱后衍生法以及荧光检测法等对链霉素含量进行检测。LC-MS法能够很好地对链霉素及其他氨基糖苷类抗生素做出精密检测但检测前要对样品进行较为复杂的前处理，而且花费较大，这就大大限制了该种检测方法的大规模实际应用。免疫检测法是建立在抗原-抗体特异性结合的基础上，非常适合高特异性、高灵敏度地检测低浓度目标物质，由于一些实际样品如蜂蜜中存在的复杂化合物会发生交叉反应，会影响免疫层析的反应结果，这就限制了该方法在实际样品中的应用范围。因此迫切需要开发一种特异性强、灵敏度高、速度快、成本低、检测范围广的电化学分析检测方法来适应形势的发展。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种操作简单、检测速度快、成本低廉、高选择性的检测链霉素残留的方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的电化学适配体传感器来实现高灵敏检测链霉素残留，该高灵敏电化学适配体传感器的制备方法为：
(1) 用氧化铝泥浆对玻碳电极进行抛光。
(2) 分别用乙醇与去离子水清洗抛光后的玻碳电极。
(3) 将5 μL的多孔碳纳米球悬浮液滴在玻碳电极表面，在空气中自然风干。
(4) 将5 μL的聚苯胺-氧化铜-金笼子复合物滴加在多孔碳纳米球修饰的电极上。
(5) 用pH=7.4的缓冲溶液冲洗修饰后的电极。
(6) 将5μL的链霉素适配体滴加在冲洗后的电极上。
(7) 用牛血清蛋白进行封端，阻塞其非特异性结合位点。
(8) 将制备好的电极浸泡在含有链霉素的溶液中。
(9) 连接好电化学工作站。
(10) 将制备好的链霉素适配体传感器进行电化学测试,链霉素的浓度可通过适配体与链霉素结合前后导致适配体传感器电流变化量进行测量。
本发明所述制备合成多孔碳纳米球PCNS，包括以下步骤：首先以纤维素为碳源，以FeSO4-(NH4)2SO4·6H2O为催化剂，利用水热合成法制备碳纳米球。然后利用MgCl2溶液进行活化最后得到多孔碳纳米球。
本发明所述制备合成聚苯胺-氧化铜-金笼子(PANI-CuO-GM)，包括以下步骤：首先合成聚苯胺-氧化铜，然后再反应生成聚苯胺-氧化铜-金笼子。
本发明所用到的链霉素是在NaH2PO4与Na2HPO4缓冲溶液（pH=7.4）中配制的。
本发明所制备的电化学传感器在实际检测中以铂丝为对电极，以银ǀ氯化银电极为参比电极，并与工作电极组成回路以通过电流,同时降低传统二电极体系中溶液电阻对工作电极的影响。
本发明所制备的电化学传感器在实际检测中，以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1)与0.2 mol/L的KCl溶液为电解液进行检测。
本发明所制备的导电材料都是在壳聚糖溶液中溶解的。
本发明的有益效果：
（1）利用多孔碳纳米球作为信号放大材料极大的降低了传感器的制造成本。
（2）本发明采用水热法制备多孔碳纳米球，与传统的模板法相比具有无毒，操作简单的优点。
（3）利用金笼子固定适配体，增加了适配体的固定量与稳定性。
（4）目标分析物与传感器能特异性识别与结合，极大的提高了传感器的灵敏度与特异性。
（5）相比于金属电极,玻碳电极不仅具有电位窗宽,背景电流低等优点,而且具有较好的化学惰性和对各种传感和检测的普适性。
说明书附图
下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细描述 ：
图1不同浓度(0.01-200ng/mL)链霉素的DPV电流信号；
图2适配体对链霉素的线性检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
(1) 多孔碳纳米球PCNS的制备，首先合成碳纳米球，将8.0g纤维素与2.4g FeSO4-(NH4)2SO4·6H2O溶于60mL去离子水中，然后将该溶液放入高压反应釜中，180 ◦C的条件下反应24h，离心洗涤，60 ◦C的条件下真空干燥备用；将干燥后的样品溶于40mL MgCl2(0.25M)溶液中，在120◦C的条件下反应12h,洗涤干燥，将干燥好的样品在通氮气的条件下，800◦C活化2h,将活化后的样品用盐酸(0.2M)和去离子水洗涤，干燥研磨得到多孔碳纳米球。
(2) 聚苯胺-氧化铜-金笼子（PANI-CuO-GM）的制备：将0.2g CuSO4·5H2O与0.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解在80mL去离子水中，然后加入0.12g过硫酸铵，磁力搅拌，待混合均匀后向其加入2.5mL的C6H5NH2，在室温的条件下反应4h,然后向该混合液中滴加20mL的NaOH(0.2M)的溶液，室温条件下反应6h,分离出棕色沉淀，并用无水乙醇与去离子水洗涤，然后真空80◦C条件下干燥备用；配制18mL的CuSO(0.038M)溶液,然后向其加入2mL柠檬酸三钠(0.5M)与碳酸钠(1.0M)混合溶液，磁力搅拌半小时后向该溶液中加入4.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，继续搅拌直至溶解，然后将共混液在90◦C的条件下反应4h，离心洗涤备用；将上述得到的粉末溶解到25mL质量分数为0.2%的PVP溶液中，然后向该溶液中加入2.4mL的HAuCl4(10mM)溶液，磁力搅拌6h,洗涤离心干燥备用；将20mg上述制得的黑色固体与40mg聚苯胺-氧化铜溶解在40mL PVP(0.04%)与氨水(1%)的混合液中，室温条件下反应24h，离心洗涤并在真空条件下干燥。
(3) 壳聚糖溶液的配制：将1mL的冰乙酸加入到99mL的去离子水中，然后将0.5g壳聚糖加入到冰乙酸与去离子水的溶液中，超声10min，得到质量分数为0.5%的壳聚糖溶液。
(4) 传感器的制备：将5 μL的PCNS悬浮液滴在玻碳电极表面，在空气中自然风干，然后，将5 μL的PANI-CuO-GM复合物滴加在PCNS修饰的电极上，用pH=7.4的缓冲溶液冲洗修饰后的电极，将5μL的链霉素适配体滴加在冲洗后的电极上，并用牛血清蛋白进行封端，阻塞其非特异性结合位点，将制备好的电极孵化在含有链霉素的溶液中，120 min后，利用二次水冲洗未吸附的链霉素等待检测。
(5) 实施检测：先将铂丝电极用酒精灯內焰烧1min，去除表面的氧化物与其它杂质，然后用去离子水冲洗银ǀ氯化银电极，连接好工作电极、对电极、参比电极，以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1)与0.2 mol/L的KCl溶液为电解液进行检测，如图1所示，测得不同浓度链霉素的DPV信号，通过适配体与链霉素结合前后导致适配体传感器DPV电流变化量进行线性拟合，得到链霉素线性检测范围与最低检测线，如图2所示，本发明对链霉素测定的线性范围为0.01-200ng/mL，最低检测线为0.38pg/mL,可以用于实际样品的测定。
(6) 本发明的适配体传感器，成本低，操作简单，灵敏度高，稳定性好，重现性好等优点，符合我国抗生素残留快速检测技术发展与国际化要求。

Claims (3)

1.一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用，其特征是包括以下步骤：
(1) 用氧化铝泥浆对玻碳电极进行抛光；
(2) 分别用乙醇与去离子水清洗抛光后的玻碳电极；
(3) 将5 μL的多孔碳纳米球悬浮液滴在玻碳电极表面，在空气中自然风干；
(4) 将5 μL的聚苯胺-氧化铜-金笼子复合物滴加在多孔碳纳米球修饰的电极上；
(5) 用pH=7.4的缓冲溶液冲洗修饰后的电极；
(6) 将5μL的链霉素适配体滴加在冲洗后的电极上；
(7) 用牛血清蛋白进行封端，阻塞其非特异性结合位点；
(8) 将制备好的电极浸泡在含有链霉素的溶液中；
(9) 连接好电化学工作站；
(10) 将制备好的链霉素适配体传感器进行电化学测试，测得不同浓度链霉素的DPV信号，通过适配体与链霉素结合前后导致适配体传感器DPV电流变化量进行线性拟合，得到链霉素线性检测范围与最低检测线。
2.根据权利要求1所述一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用,制备合成多孔碳纳米球PCNS，其特征是：首先合成碳纳米球，将8.0g纤维素与2.4g FeSO4-(NH4)2SO4·6H2O溶于60 mL去离子水中，然后将该溶液放入高压反应釜中，180 ◦C的条件下反应24h，离心洗涤，60 ◦C的条件下真空干燥备用；将干燥后的样品溶于40mL MgCl2(0.25M) 溶液中，在120 ◦C的条件下反应12 h,洗涤干燥，将干燥好的样品在通氮气的条件下，800◦C活化2h,将活化后的样品用盐酸(0.2M) 和去离子水洗涤，干燥研磨得到多孔碳纳米球。
3.根据权利要求1所述一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用，制备合成聚苯胺-氧化铜-金笼子(PANI-CuO-GM)，其特征是：将0.2g CuSO4·5H2O与0.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解在80mL去离子水中，然后加入0.12g过硫酸铵，磁力搅拌，待混合均匀后向其加入2.5mL的C6H5NH2，在室温的条件下反应4h,然后向该混合液中滴加20mL的NaOH(0.2M)的溶液，室温条件下反应6h,分离出棕色沉淀，并用无水乙醇与去离子水洗涤，然后真空80◦C条件下干燥备用；配制18mL的CuSO(0.038M)溶液,然后向其加入2mL柠檬酸三钠(0.5M)与碳酸钠(1.0M)混合溶液，磁力搅拌半小时后向该溶液中加入4.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，继续搅拌直至溶解，然后将共混液在90◦C的条件下反应4h，离心洗涤备用；将上述得到的粉末溶解到25mL质量分数为0.2%的PVP溶液中，然后向该溶液中加入2.4mL的HAuCl4(10mM)溶液，磁力搅拌6h,洗涤离心干燥备用；将20mg上述制得的黑色固体与40mg聚苯胺-氧化铜溶解在40mL PVP(0.04%)与氨水(1%)的混合液中，室温条件下反应24h，离心洗涤并在真空条件下干燥。
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