CN204330668U - 用于卡那霉素检测的电化学适体电极 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及检测用传感器技术领域,特别涉及一种用于卡那霉素检测的电化学适体电极,在玻碳电极上自下而上依次修饰有石墨烯-聚苯胺复合物、聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物、卡那霉素抗体,最后封闭电极表面的为BSA和10个腺嘌呤碱基的单链DNA。制备方法简单,性能稳定,电极的重复性好,适用于食品安全中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。制作电极的工艺成本低,适用于产业化中价廉的要求。以玻碳电极为固定载体固定基于核酸适配体的夹心型电化学传感系统,可实现对食品中卡那霉素的快速在线检测,检出限为4.6×10-6 μg mL-1。
Description
技术领域
本发明涉及检测用传感器技术领域,特别涉及一种用于卡那霉素检测的电化学适体电极。
背景技术
卡那霉素(Ka)是一种氨基糖苷类抗生素,是由链霉菌的发酵产生的,被广泛用于治疗误译诱导的感染和间接抑制蛋白质合成期间易位。和其他氨基糖甙类一致,Ka可以在动物体中累积并且转移到食物链中,这可能对人类健康引起潜在的危险,比如出现失去听力,肾脏毒性和药物过敏反应。欧盟组织已经确定了可食用组织和牛奶中Ka的最大残留量。在这方面,确立一个灵敏的高选择性的方法临床诊断和在食品安全分析中检测Ka是至关重要的。目前报道的检测Ka的方法包括高效液相色谱法,毛细管电泳法,表面等离子体共振方法和荧光共振方法。这些方法有检测成本高,仪器操作复杂,需要专业操作人员等缺点。
发明内容
为了解决以上现有技术中针对现有检测方法中检测成本高,仪器操作复杂,需要专业操作人员的缺点,设计了基于核酸适配子的新型夹心构型的用于卡那霉素检测的电化学适体电极。
本发明还提供了所述电化学适体电极的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的:
一种用于卡那霉素检测的电化学适体电极,在玻碳电极上自下而上依次修饰有石墨烯-聚苯胺复合物层、聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物层、卡那霉素抗体层,最后封闭电极表面的BSA和10个腺嘌呤碱基的单链DNA的封闭层。
所述的电化学适体电极,优选石墨烯-聚苯胺复合物层的厚度在100 ±10nm,聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物层的厚度为100-200 nm,卡那霉素抗体层的厚度为1±0.1μm,BSA和10个腺嘌呤碱基的单链DNA的封闭层的厚度为500±20nm。
所述的电化学适体电极,优选石墨烯-聚苯胺复合物中石墨烯与苯胺的质量比为3.3:100。
所述的电化学适体电极,优选聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物中聚酰胺-胺型树枝状高分子与金的摩尔比为1:3。
所述的电化学适体电极的制备方法,优选包括以下步骤:
(1)对玻碳电极进行处理洗涤,将石墨烯-聚苯胺纳米复合物滴加到电极表面,室温下干燥,用二次水冲洗;
(2)浸入聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物中3小时,用二次水冲洗,干燥;
(3)在表面滴加卡那霉素抗体的PBS缓冲液,室温下过夜;
(4)用0.1%的牛血清白蛋白和10个腺嘌呤碱基的单链DNA封闭电极2 h,即得。
所述的制备方法,优选石墨烯-聚苯胺纳米复合物是通过以下步骤得到的:
(1)石墨粉经过氧化得到氧化石墨烯,
(2)氧化石墨烯同苯胺按照质量比3.3:100制备石墨烯-聚苯胺纳米复合物。
所述的制备方法,优选聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物中聚酰胺-胺型树枝状高分子与金的摩尔比为1:3。
所述的制备方法,优选步骤(3)中在表面滴加10 μL 溶解有5 μmol L-1 卡那霉素抗体(KAb)的PBS缓冲液,室温下过夜。
所述的制备方法,优选石墨烯-聚苯胺纳米复合物是通过以下步骤得到的:2.75 mL 苯胺溶解在100 mL 1 mol L-1的HCl中得到苯胺的浓度为0.3 mol L-1,加入100 mg 氧化石墨烯,超声1 h后,0.17g (NH4)2S4O8和10 mL 1 mol L-1 HCl快速加入混合液并剧烈搅动,颜色变为深绿色时,聚合开始,使用二次蒸馏水过滤洗涤若干次后,得到石墨烯-聚苯胺复合物;称量0.1 g 石墨烯-聚苯胺复合物溶解在50 mL的超纯水中,用0.1 mL80%的水合肼在95 ℃下还原1 h,洗涤除去过量的水合肼;复合物分散在10 mL含有1 mol L-1 HCl和0.06 g (NH4)2S4O8 ,室温下搅动过夜。用二次水,乙醇,甲醇逐步洗涤聚合物,过滤收集,并在60 ℃的干燥箱中干燥,溶解在二甲基甲酰胺中,得到1 mg mL-1的均匀悬浮物。
所述的制备方法,优选聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物是通过以下步骤得到的:
将2.5 mL浓度为0.3 mmol L-1的HAuCl4 溶液添加到2.5 mL 0.1 mmol L-1 的聚酰胺-胺树形分子水溶液中,搅拌20 min得混合溶液;将2.5 mL的0.1 mmol L-1的柠檬酸钠逐滴加入上述混合溶液中,反应4 h,溶液颜色变为深红色,即得。
本发明的工作原理:
在玻碳电极上首先修饰增效物质GR-PANI和PAMAM-Au,不但能促进电极表面电子转移,而且增效物质之间的特殊基团的连接能保证它们的层层组装。金纳米粒子与卡那霉素抗体(KAb)的氨基,通过Au-NH2的作用,把抗体修饰到电极上。然后,抗体(KAb)与卡那霉素有专一的识别能力,卡那霉素就能成功修饰到电极上。在卡那霉素的另一端,生物素标记的核酸适体(Bio-Apt)通过核酸适体与目标物的特异性识别能力,也被成功修饰。最后,标记有链霉亲和素的辣根过氧化物酶(SA-HRP)通过Bio-SA之间的强作用力被连接到电极上。在检测过程中,通过电极上的HRP催化检测底液中的对苯二酚(HQ)和双氧水(H2O2)的氧化还原产生电信号,连接电化学工作站,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为-0.2到0.6 V,脉冲宽度0.05V,脉冲宽度扫描为0.06 S,采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化,根据电极表面产生的电流的大小起到对目标物检测的作用。电极上固定的HRP的量与修饰的被检测物卡那霉素的量有直接关系,被检测物越多,固定的HRP的量也越多,催化产生的电信号也越强。
本发明采用的GR-PANI和PAMAM-Au复合物导电性强,成为构建传感器的优良材料;使用辣根过氧化物酶(HRP),通过与H2O2和HQ的反应,放大信号;采用了夹心型的检测模型,分别在检测物Ka的两端引入抗体和适配体,检测更为灵敏;制备的传感器灵敏度高,检测速度快;检测Ka的方法,操作简单、快速、灵敏,便于现场检测。
本发明的有益效果:
1、由于使用玻碳电极,其电极简便、小型化、易携带、可多次使用。
2、反应层是使用表面修饰技术固定在工作电极上,优化使用材料的用量与浓度,制得的夹心型电极对环境温度的要求不明显,室温下使用即可。
3、制备方法简单,性能稳定,电极的重复性好,适用于食品安全中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。
4、制作电极的工艺成本低,适用于产业化中价廉的要求。
5、以玻碳电极为固定载体固定基于核酸适配体的夹心型电化学传感系统,可实现对食品中卡那霉素的快速在线检测,检出限为4.6×10-6 μg mL-1。
附图说明
图1为电化学适体电极的制备工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明,下述说明仅是实例性的,不限定本发明的保护范围。
首先制备石墨烯-聚苯胺纳米复合物和聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物
1、石墨烯-聚苯胺(GR-PANI)纳米复合物的制备:
(1)氧化石墨烯(GO)的制备:
氧化石墨烯(GO)的制备是根据经典的方法。简而言之,1.0 g石墨粉加入到含有0.5 g 硝酸钠(NaNO3)和3.0 g 高锰酸钾(KMnO4)的质量分数98%的50 mL 浓硫酸(H2SO4)中。温度低于20 ℃下,反应1 h,升温到35℃,继续搅拌30 min。然后缓慢加入约100 mL的离子水,持续搅拌20 min 后,加入50 mL H2O2(30%),来还原残留的氧化剂,溶液渐渐变成亮黄色;趁热过滤,用HCl 溶液和去离子水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止。沉淀物在60 ℃的恒温箱中干燥,最终得到GO。
(2)合成石墨烯-聚苯胺(GR-PANI)复合物
2.75 mL 苯胺(99%)溶解在100 mL 1 mol L-1的HCl中得到苯胺的浓度为0.3 mol L-1,加入100 mg 已制备的GO。超声1 h后,0.17g (NH4)2S4O8和10 mL 1 mol L-1 HCl快速加入混合液并剧烈搅动。颜色变为深绿色时,聚合开始。使用二次蒸馏水过滤洗涤多次后,得到石墨烯-聚苯胺(GO-PANI)复合物。称量0.1 g GO-PANI溶解在50 mL的超纯水中,用0.1 mL水合肼(80%)在95 ℃下还原1 h。用二次水洗涤复合物通过过滤除去过量的水合肼。
最后,上述合成的复合物分散在10 mL含有1 mol L-1 HCl和0.06 g (NH4)2S4O8 ,室温下搅动过夜。用二次水,乙醇,甲醇逐步洗涤聚合物,过滤收集,并在60 ℃的干燥箱中干燥。
为了准备进一步的实验,制备的GR-PANI溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中,并超声1 h,得到1 mg mL-1的均匀悬浮物。
2、聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物(PAMAM-Au)的制备:
将2.5 mL HAuCl4 溶液(0.3 mmol L-1)添加到2.5 mL 0.1 mmol L-1 聚酰胺-胺树形分子(PAMAM)(取0.15 μL树状分子加2.5 mL水)溶液中,搅拌20 min;将2.5 mL柠檬酸钠(0.1 mmol L-1)逐滴加入上述溶液中,反应时间为4 h后,溶液颜色变为深红色,形成零价金配合物,即得。
实施例1
一种本发明所述夹心型电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
a、玻碳电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用二次水冲洗;
b、10 μL 已经制备的GR-PANI滴加在电极表面,在室温下干燥过夜;修饰好的电极浸入在制备的PAMAM-Au溶液中,保持3 h;
c、待用二次水冲洗几次之后,10 μL溶解5 μmol L-1卡那霉素抗体(KAb)的PBS溶液滴加在电极表面,室温下保持90 min,用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的KAb;
d、10 μL BSA (0.1%)和聚(A)10链(10个腺嘌呤碱基的单链DNA ,5 μmol L-1)被用来封闭电极表面没有被结合的位点,即得夹心型电化学传感器。
检测方法如下:
e、所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后,在不同浓度待检测卡那霉素(Ka)溶液中孵育,并用PBS缓冲液冲洗;
f、10 μL 5.5×10-10 mol L-1生物素标记的核酸适体(Bio-KBA)通过与目标物之间的强识别能力,被修饰在电极表面,孵育4 h;
g、PBS冲洗之后,10 μL 0.96 μmol L-1链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)通过SA与Bio之间强的作用力修饰在电极上;
h、以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为-0.2到0.6 V,脉冲宽度0.05V,脉冲宽度扫描为0.06 S,采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化,检测目标物。
上述方法中所用的PBS缓冲液是由方法配制:称取Na2HPO4 7.1 g,KCl 0.2 g和KH2PO4 6.8 g,KCl 0.2 g分别溶于500 mL二次水中,得到两种溶液用pH计混合调整,得到pH值为7.4,浓度为0.01 mol L-1的PBS缓冲液。
实施例2
以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为-0.2到0.6 V,脉冲宽度0.05V,脉冲宽度扫描为0.06 S,采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化,检测目标物。选择不同的Ka浓度(5×10-6, 4×10-5, 4×10-4, 4×10-3, 4×10-2 μg mL-1),其他同实施例1,得出不同的检出电流,说明本发明制备的电极,检测速度快、检出限低,可以达到4.6×10-6μg mL-1。检测出的信号如下表所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受实施例的限制,其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种用于卡那霉素检测的电化学适体电极,其特征在于在玻碳电极上自下而上依次修饰有石墨烯-聚苯胺复合物层、聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物层、卡那霉素抗体层,最后封闭电极表面的BSA和10个腺嘌呤碱基的单链DNA的封闭层。
2.根据权利要求1所述的电化学适体电极,其特征在于石墨烯-聚苯胺复合物层的厚度在100 ±10nm,聚酰胺-胺型树枝状高分子-金纳米复合物层的厚度为100-200 nm,卡那霉素抗体层的厚度为1±0.1μm,BSA和10个腺嘌呤碱基的单链DNA的封闭层的厚度为500±20nm。
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