CN103616423A - 一种检测土霉素的竞争型适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测食品中土霉素(OTC)的适配体传感器。本发明利用氧化石墨烯-聚苯胺(GO-PANI)和辣根过氧化物酶(HRP)作为放大策略,构建了竞争型适配体传感器用于土霉素(OTC)的超灵敏检测。在构建中,GO-PANI膜滴加到玻碳电极表面,金纳米粒子通过电化学方法沉积到电极表面。OTC连接适配体对OTC具有高的亲和力和特异性,作为捕获探针连接OTC,并同时连接HRP,形成HRP-Apt。完全抗原(OTC-BSA)作为固定抗原连接到电极表面,与后来加入的待测OTC竞争结合HRP-Apt。表面连有HRP的传感器在含HQ和H2O2的工作液中,进行电化学测量。利用电化学信号的改变即可实现对土霉素(OTC)的检测。本发明制备的竞争型适配体传感器选择性强、灵敏度高、操作简单快速,适合食品中土霉素(OTC)的检测。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料和食品抗生素检测领域,提供了一种检测土霉素的竞争型适配体传感器,可用于食品中土霉素的检测。
背景技术
四环素类抗生素是广谱抗生素,已被广泛应用在农业的运作和人类医学中用于治疗传染性疾病。它们在低浓度中操作非常有效,并且仅仅在一个较短的时间后就可以完全从体内代谢出来。然而,过度使用四环素可能导致严重的过敏,在人类安全中的细菌抗性和食品中的安全问题。土霉素(OTC)是四环素中最经常被使用的成员之一。世贸组织(WTO)也对药物和食物中土霉素的最大残留量作了规定。最近报道的检测土霉素(OTC)的方法主要包括高效液相色谱法、荧光法,质谱法和其它方法等。但是这些方法通常比较费时间并且价格相对昂贵。
本文研究了一种竞争型适配体传感器检测食品中土霉素(OTC)的方法,具有灵敏度高、分析速度快、操作简单及成本低廉的优点。我们基于氧化石墨烯-聚苯胺(GO-PANI)的电流放大作用,利用金纳米粒子(AuNPs)的生物相容性,将已知浓度的土霉素完全抗原(OTC-BSA)固定在电极上。待测的土霉素(OTC)和辣根过氧化物酶标记的适配体(HRP-Apt)同时加入到电极表面,使待测土霉素和已标记的土霉素竞争结合适配体,从而固定辣根过氧化物酶。装置完成后在含对苯二酚(HQ)和双氧水(H2O2)的体系中完成反应,至此构建成适配体传感器。待测土霉素与适配体的结合可以导致电极固定的辣根过氧化物酶减少,进一步导致电化学信号减少,利用电化学信号的变化可以达到对待测物进行检测的目的。
发明内容
本发明的内容之一是提供了一种检测食品中土霉素(OTC)的适配体传感器的制备方法。
本发明的内容之二是将所制备的适配体传感器,用于检测食品中的土霉素(OTC)。
本发明的技术方案,包括以下步骤:
1、一种检测食品中土霉素(OTC)的竞争型适体传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)氧化石墨烯(GO)的制备:
氧化石墨烯(GO)的制备是根据经典的方法。简而言之,石墨粉加入到含有硝酸钠(NaNO3)和高锰酸钾(KMnO4)的质量分数98%的浓硫酸(H2SO4)中。然后非常缓慢的加入双氧水(H2O2)。静置几个小时后,过滤混合液。分别用盐酸(HCl)溶液和二次蒸馏水洗涤沉淀。沉淀物在60℃的恒温箱中干燥,最终得到GO。
(2)合成氧化石墨烯-聚苯胺(GO-PANI)复合物
在GO存在下,氧化石墨烯-聚苯胺(GO-PANI)复合物由苯胺单体的原位聚合得到的。25 mg GO溶解在50 mL 浓度为1 M的H2SO4中,超声一小时。目的使氧化石墨剥离成单层的氧化石墨烯。200μL的苯胺单体溶液加入到GO溶液,超声振荡30分钟,形成稳定的氧化石墨烯和苯胺的混合液。接下来,倒入0.2281 g (NH4)2S4O8到混合液,并在20℃下反应2 h。当颜色变为绿色,GO-PANI复合物就成功制备了。使用二次蒸馏水过滤洗涤多次后,得到的复合物在60℃干燥箱中干燥。为了准备进一步的实验,制备的GO-PANI溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中,并超声1 h,得到1 mg/mL的均匀悬浮物。
(3)检测土霉素(OTC)的竞争型适体传感器的制备方法,步骤如下:
玻碳电极(GCE)用氧化铝粉抛光处理,并用酒精和二次水洗涤多次。取20μL GO-PANI复合物滴加到电极表面,室温下干燥。用二次水冲洗后,浸入HAuCl4 (1 mg/mL)中,进行电化学聚合。初始电压为-0.2 V,扫描时间120 S。用二次水冲洗,干燥后,滴加完全抗原OTC-BSA,电极在4℃下过夜保存。接下来用0.1%的BSA封闭电极。最终,加入辣根过氧化物酶标记的适配体(HRP-Apt)和待测OTC混合物。电极上的OTC-BSA和待测OTC竞争结合HRP-Apt。
2、上述构建的传感器用于OTC的检测步骤如下:
(1)采用三电极系统,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,适配体传感器为工作电极。以含对苯二酚(HQ)和双氧水(H2O2)的PBS为工作底液采用循环伏安法检测。电位设置为-0.4到 +0.4 V,扫描速率为50 mV/s。整个检测过程在室温下进行。
(2)将各已知浓度的待测OTC滴加到电极,检测电化学信号变化,绘制与浓度的工作曲线。
所述一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器,所用原材料均在化学试剂公司购买。
本发明体现的优势和特点是:
(1)本发明采用的GO-PANI复合物导电性强,成为构建传感器的优良材料;
(2)本发明使用辣根过氧化物酶(HRP),通过与H2O2和HQ的反应,放大信号;
(3)本发明采用了竞争型的检测模型,并引入了完全抗原(OTC-BSA)在适配体传感器中设计较为独特;
(4)本发明制备的传感器灵敏度高,检测速度快;
(5)本发明检测土霉素(OTC)的方法,操作简单、快速、灵敏,便于现场检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外,还应理解,在阅读了本发明所讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器的制备方法,步骤如下:
(1)滴加20μL GO-PANI纳米复合物溶液到玻碳电极工作表面,室温下干燥;
(2)将(1)电极浸入HAuCl4 (1 mg/mL)的工作液中,采用电还原方式将金纳米粒子还原到(1)电极表面,初始电位为-0.2 V,还原时间分别为20、40、60、80、100、120、140、160、180 S,室温晾干。
(3)以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,以(2)所得传感器平台为工作电极,以K3[Fe(CN)6]为工作底液,连接电化学工作站,采用循环伏安法检测电流响应。电位设置为-0.2到 +0.6 V,扫描速率为50 mV/s。
实施例2
一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器的制备方法,步骤如下:
(1)滴加20μL GO-PANI纳米复合物溶液到玻碳电极工作表面,室温下干燥;
(2)将(1)电极分别浸入不同浓度(1×10-4、1×10-3、1×10-2 、1×10-1、1、10 mg/mL)的HAuCl4工作液中,采用电还原方式将金纳米粒子还原到(1)电极表面,初始电位为-0.2 V,还原时间分别为120 S,室温晾干。
(3)以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,以(2)所得传感器平台为工作电极,以K3[Fe(CN)6]为工作底液,连接电化学工作站,采用循环伏安法检测电流响应。电位设置为-0.2到 +0.6 V,扫描速率为50 mV/s。
实施例3
一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器的制备方法,步骤如下:
(1)滴加20μL GO-PANI纳米复合物溶液到玻碳电极工作表面,室温下干燥;
(2)将(1)电极浸入HAuCl4 (1 mg/mL)的工作液中,采用电还原方式将金纳米粒子还原到(1)电极表面,初始电位为-0.2 V,还原时间为120 S,室温晾干。
(3)滴加20μL 不同浓度(1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1 mg/L)OTC-BSA到电极表面,干燥之后,滴加BSA封闭非特异性结合位点;
(4)滴加20μL HRP-Apt和待测OTC的混合液到电极表面,在30分钟后冲洗并干燥;
(5)以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,以(4)所得传感器平台为工作电极,以含HQ和H2O2的PBS(pH=7.0)为工作底液,连接电化学工作站,采用循环伏安法检测电流响应。电位设置为-0.4到 +0.4 V,扫描速率为50 mV/s。
实施例4
一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器的制备方法,步骤如下:
(1)滴加20μL GO-PANI纳米复合物溶液到玻碳电极工作表面,室温下干燥;
(2)将(1)电极浸入HAuCl4 (1 mg/mL)的工作液中,采用电还原方式将金纳米粒子还原到(1)电极表面,初始电位为-0.2 V,还原时间为120 S,室温晾干。
(3)滴加20μL OTC-BSA(0.01 mg/L)到电极表面,干燥之后,滴加BSA封闭非特异性结合位点;
(4)滴加20μL HRP-Apt和待测OTC的混合液到电极表面,分别在10、20、30、40、50、60、70、80分钟后冲洗并干燥;
(5)以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,以(4)所得传感器平台为工作电极,以含HQ和H2O2的PBS(pH=7.0)为工作底液,连接电化学工作站,采用循环伏安法检测电流响应。电位设置为-0.4到 +0.4 V,扫描速率为50 mV/s。
实施例5
一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器的制备方法,步骤如下:
(1)滴加20μL GO-PANI纳米复合物溶液到玻碳电极工作表面,室温下干燥;
(2)将(1)电极浸入HAuCl4 (1 mg/mL)的工作液中,采用电还原方式将金纳米粒子还原到(1)电极表面,初始电位为-0.2 V,还原时间为120 S,室温晾干。
(3)滴加20μL OTC-BSA(0.01 mg/L)到电极表面,干燥之后,滴加BSA封闭非特异性结合位点;
(4)滴加20μL HRP-Apt和待测OTC的混合液到电极表面,分别在30分钟后冲洗并干燥;
(5)以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,以(4)所得传感器平台为工作电极,以含HQ和H2O2的不同pH(60.、6.5、7.0、7.5、8.0)值的PBS为工作底液,连接电化学工作站,采用循环伏安法检测电流响应。电位设置为-0.4到 +0.4 V,扫描速率为50 mV/s。
实施例6
一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器用于食品中土霉素(OTC)的检测,步骤如下:
(1)滴加20μL GO-PANI纳米复合物溶液到玻碳电极工作表面,室温下干燥;
(2)将(1)电极浸入HAuCl4 (1 mg/mL)的工作液中,采用电还原方式将金纳米粒子还原到(1)电极表面,初始电位为-0.2 V,还原时间为120 S,室温晾干。
(3)滴加20μL OTC-BSA(0.01 mg/L)到电极表面,干燥之后,滴加BSA封闭非特异性结合位点;
(4)滴加20μL HRP-Apt和待测OTC的混合液到电极表面,分别在30分钟后冲洗并干燥;
(5)以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,以(4)所得传感器平台为工作电极,以含HQ和H2O2的PBS(pH=7.0)为工作底液,连接电化学工作站,采用循环伏安法检测电流响应。电位设置为-0.4到 +0.4 V,扫描速率为50 mV/s。
(6)以不同的标准浓度的OTC样品作为待测OTC,检测CV电流信号,绘制土霉素(OTC)的工作曲线。
(7)采用制备的竞争型适配体传感器用于检测蜂蜜样品,未检测出土霉素(OTC),属于合格样品;加标回收实验,平行检测3次,其回收率为别为98.3%、97.2%、101%。
Claims (2)
1.一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器,其特征在于,包括以下步骤:
(1)氧化石墨烯-聚苯胺(GO-PANI)纳米复合物的制备:
25 mg GO溶解在50 mL 浓度为1 M的H2SO4中,超声一小时,目的使氧化石墨剥离成单层的氧化石墨烯;200μL的苯胺单体溶液加入到GO溶液,超声振荡30分钟,形成稳定的氧化石墨烯和苯胺的混合液;接下来,倒入0.2281 g (NH4)2S4O8到混合液,并在20℃下反应2 h,当颜色变为绿色,GO-PANI复合物就成功制备了;使用二次蒸馏水过滤洗涤多次后,得到的复合物在60℃干燥箱中干燥;为了准备进一步的实验,制备的GO-PANI溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中,并超声1 h,得到1 mg/mL的均匀悬浮物;
(2)检测土霉素(OTC)的竞争型适体传感器的制备方法,步骤如下:
玻碳电极(GCE)用氧化铝粉抛光处理,并用酒精和二次水洗涤多次;取20μL GO-PANI复合物滴加到电极表面,室温下干燥;用二次水冲洗后,浸入HAuCl4 (1 mg/mL)中,进行电化学聚合,初始电压为-0.2 V,扫描时间120 S;用二次水冲洗,干燥后,滴加完全抗原OTC-BSA,电极在4℃下过夜保存;接下来用0.1%的BSA封闭电极;最终,加入辣根过氧化物酶标记的适配体(HRP-Apt)和待测OTC混合物,电极上的OTC-BSA和待测OTC竞争结合HRP-Apt;
(3)一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器,其基本设计思路如下:
以牛血清白蛋白(BSA)为载体,引入完全抗原(OTC-BSA)固定到电极上,滴加辣根过氧化物酶标记的适配体(HRP-Apt)和待测OTC混合液,通过适配体与OTC的特异性识别作用,一方面引入HRP作为放大策略修饰到电极上,另一方面使OTC-BSA与待测OTC和适配体完成竞争反应。
2.如权利要求1所述的制备一种检测土霉素(OTC)的竞争型适配体传感器,用于如霉素(OTC)的检测步骤如下:
(1)以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,适配体传感器为工作电极,以含HQ和H2O2的PBS(pH=7.0)为工作底液,连接电化学工作站,采用循环伏安法检测电流响应;电位设置为-0.4到 +0.4 V,扫描速率为50 mV/s;以不同的标准浓度的OTC样品作为待测OTC,检测CV电流信号,绘制土霉素(OTC)的工作曲线;
(2)将待测样品溶液代替土霉素(OTC)标准溶液,按照工作曲线的绘制方法进行检测。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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