CN108982605A - 一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器及其检测内毒素的方法 - Google Patents

一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器及其检测内毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器及其检测内毒素的方法。所述传感器由适配体修饰电极和富铜离子标记物构成。适配体与内毒素分子发生特异性结合后，进行铜离子标记。通过对富铜离子材料中铜离子含量的电化学分析，实现内毒素含量的间接测定。本发明所述基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器可以实现对内毒素的强特异性、高灵敏、低检测限的快速检测，有助于实现内毒素电化学适配体传感器的低成本、稳定、批量的制备，推动生物化学检测的精准化和高效化。

Description

一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器及其检测 内毒素的方法
技术领域
本发明涉及内毒素的检测技术领域，特别涉及基于信号放大策略的内毒素电化学分析方法。
背景技术
内毒素是革兰氏阴性菌细胞外壁层上的特有结构。细菌破裂后，内毒素分子被释放，微量内毒素分子进入体内即可引起发热、头痛、腹泻、血管扩张、中性粒细胞增多、机体血压下降及血管通透性增强等一系列症状，严重时可以导致血管凝血及多器官衰竭。因此，痕量内毒素的检测在医学、药理学及医疗热原监测等领域至关重要。
利用与内毒素产生凝集反应的原理，鲎试剂被广泛应用于内毒素含量的检测。常用的方法有凝胶法和光度法。鲎试剂是一种酶，酶的活性对反应环境及条件要求较为苛刻。如果样品中含有蛋白酶等成分会对鲎试剂的活性产生影响，从而导致测试结果不准确。因此，开发一种检测速度快、检测限低、灵敏度高、抗干扰能力强的内毒素检测技术成为亟待解决的技术问题。
采用SPR技术检测内毒素也是一种可行的方法，例如：中国专利文件CN103267745A公开了一种内毒素MIP-SPR芯片、制备方法及其用途，SPR芯片的金膜表面具有一层以多巴胺为功能单体、以内毒素为模板分子的MIP膜，将所制备的MIP-SPR芯片代替传统SPR芯片，应用于SPR仪，可实时监测生物和环境样品中的痕量内毒素。但是SPR检测所需设备较为昂贵，维护成本较高，一定程度上限制了该方法的推广及应用。
目前，一些生物传感器如抗体生物传感器、多肽生物传感器、蛋白生物传感器及适配体生物传感器初步应用于内毒素的检测，该类方法主要是基于生物活性分子特异性识别内毒素分子的原理。但是抗体、多肽、蛋白生物传感器同样存在一些缺点，如抗体的制备需要通过长时间的动物实验；多肽存在较复杂的检测过程；蛋白与内毒素分子的特异性结合不强，抗干扰性差等。
适配体是具有特定结构能够特异性结合内毒素分子的单链DNA序列，其具有亲和性高、特异性强、制备及合成方便等优点，近年来在医疗诊断、疾病治疗等领域越来越受关注。
目前，基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于富铜离子材料信号放大策略的内毒素适配体传感器及其制备方法与应用，通过电化学信号来定量检测内毒素，此方法特异性强、灵敏度高、检测速度快、检测限低。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，所述传感器由适配体修饰电极及富铜离子材料标记物构成。通过对富铜离子材料标记物中铜离子含量的电化学分析，实现内毒素含量的测定。
根据本发明，优选的，所述的富铜离子材料为铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体或铜金属有机框架材料。
根据本发明，优选的，所述的铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体按如下方法制备得到：
首先通过晶种生长法制备金纳米粒子，然后将半胱氨酸分子自组装到金纳米粒子表面，加入可溶性铜盐溶液，使金纳米粒子团聚，得到铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体。优选的，金纳米粒子、半胱氨酸、铜离子的摩尔比为600：1：75。
所述的铜金属有机框架材料按如下方法制备得到：
利用离子热法将硝酸铜、均苯三酸、氯化胆碱及尿素的混合溶液升温晶化，得到铜金属有机框架材料。优选的，硝酸铜、均苯三酸、氯化胆碱及尿素的摩尔比为0.2：0.2：1：2，将反应温度由室温升温到100℃，升温速率5℃/min，晶化时间为3天。
根据本发明，优选的，所述的适配体修饰电极是通过羧酸化的导电聚合物和/或金纳米粒子修饰电极利用EDC/NHS酰胺化反应将内毒素核酸适配体共价结合于电极表面。优选的，所述的内毒素核酸适配体序列为：5'-CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAGCCGGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-3'。
根据本发明，将所述的适配体传感器浸泡于含有内毒素的待测样品中，待适配体与内毒素分子发生特异性结合后，将其转移至富铜离子材料标记物溶液中进行标记。
根据本发明，利用上述基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器检测内毒素的方法，包括步骤如下：
(1)制备富铜离子材料标记物；
(2)构建适配体修饰电极；
(3)将适配体修饰电极浸泡于不同浓度的内毒素标准液中；
(4)将步骤(3)中得到的电极置于富铜离子材料标记物溶液中，实现铜离子的标记；
(5)测试不同浓度内毒素的电化学响应曲线，并绘制标准曲线；
(6)检测实际样品中内毒素含量的电化学响应电流，对照标准曲线计算得到待测样品中内毒素的含量。
根据本发明，优选的，电化学响应曲线测定方法为采用三电极体系，利用循环伏安法、差分脉冲法或交流阻抗法等电化学检测方法，绘制样品中内毒素检测标准曲线。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明以电化学为主要分析测试手段，通过对富集材料中富含的铜离子进行分析，实现对内毒素的定量检测；
2、本发明的适配体传感器可以实现内毒素的强特异性、高灵敏、低检测限的快速检测；
3、本发明的适配体传感器制备方法简单，可以实现低成本、稳定、批量的制备。
附图说明
图1是本发明以铜离子诱导组装的金纳米粒子标记的内毒素电化学检测差分脉冲伏安曲线。
图2是本发明以铜离子诱导组装的金纳米粒子标记的内毒素电化学检测差分脉冲伏安曲线对应的标准曲线。
图3是本发明以铜金属有机框架材料标记的内毒素电化学检测差分脉冲伏安曲线。
图4是本发明以铜金属有机框架材料标记的内毒素电化学检测差分脉冲伏安曲线对应的标准曲线。
具体实施方式
以下对本发明做进一步详细说明，但不限于此。
在本发明的具体实施中，所述的富铜离子材料为铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体或铜金属有机框架材料。铜离子诱导组装的金纳米粒子首先通过晶种生长法制备金纳米粒子，通过将半胱氨酸分子自组装到金纳米粒子表面后，加入铜离子使金纳米粒子团聚，得到铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体。铜金属有机框架材料则利用离子热法将硝酸铜、均苯三酸、氯化胆碱及尿素等的混合溶液加入反应釜中，控制升温速率及晶化时间，得到铜金属有机框架材料。
所述的内毒素适配体修饰电极通过羧酸化的导电聚合物和/或金纳米粒子修饰电极利用EDC/NHS酰胺化反应将内毒素核酸适配体(序列为：5'-CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAGCCGGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-3'，购自上海生工生物工程股份有限公司)共价结合于电极表面。
所述的铜离子标记则利用内毒素分子与铜离子间的特异性吸附特性，实现富铜离子聚集体与内毒素分子的结合，采用三电极体系，利用循环伏安法、差分脉冲法、交流阻抗法等电化学检测手段，通过对标记物中铜离子的检测，实现内毒素的电化学分析。
实施例1
一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器检测内毒素的方法，包括步骤如下：
(1)制备富铜离子材料标记物，铜离子诱导组装的金纳米粒子；
a.溶液配制
氯金酸溶液：1.0g氯金酸溶于100mL蒸馏水。
柠檬酸钠溶液：2.85g柠檬酸钠转移至250mL容量瓶中，并用去离子水定容。
半胱氨酸溶液：称取半胱氨酸0.121g转移至100mL的容量瓶中定容后，稀释为0.10mM的半胱氨酸溶液。
b.柠檬酸根包裹的金纳米粒子的合成
移取6.2mL氯金酸溶液于盛有150mL去离子水的单口烧瓶中，搅拌加热，待HAuCl4溶液沸腾之后，快速加入15mL柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟后，得到酒红色金纳米粒子溶液。移去热源，持续搅拌冷却至室温。
c.铜离子诱导组装的金纳米粒子
移取金纳米粒子溶液5.0mL，加入半胱氨酸溶液使其终浓度为0.4μM，反应4小时。离心洗涤后，分散到pH＝5.5的磷酸缓冲溶液中。随后加入终浓度为30μM的铜离子，反应结束后，溶液由酒红色变为蓝紫色。
(2)构建适配体修饰电极；
将羧酸化的电极置于50mM EDC/NHS溶液中，活化1小时。随后，将其转移至0.2μM适配体溶液中，反应过夜后，用磷酸缓冲溶液冲洗备用。
(3)将适配体修饰电极浸泡于浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、7.0、10.0pg/mL的内毒素标准液中进行孵育；
(4)将步骤(3)中得到的电极置于富铜离子材料标记物溶液中，实现铜离子的标记；
(5)测试不同浓度内毒素的差分脉冲伏安曲线，并绘制标准曲线；如图1、2所示；
(6)检测实际样品中内毒素含量的电化学响应电流，对照标准曲线计算得到待测样品中内毒素的含量。
实施例2
一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器检测内毒素的方法，包括步骤如下：
(1)制备富铜离子材料标记物，铜金属有机框架材料；
将摩尔比为0.2：0.2：1：2的硝酸铜、均苯三酸、氯化胆碱及尿素的混合溶液加入反应釜中，控制升温速率5℃/min，将反应温度由室温升温到100℃。晶化3天后，自然冷却至室温，得到具有晶体结构的铜金属有机框架材料。经离心、洗涤后，超声分散备用。
(2)构建适配体修饰电极；
将羧酸化的电极置于50mM EDC/NHS溶液中，活化1小时。随后，将其转移至0.2μM适配体溶液中，反应过夜后，用磷酸缓冲溶液冲洗备用。
(3)将适配体修饰电极浸泡于浓度分别为0、5、10、20、40、60、100、200pg/mL的内毒素标准液中进行孵育；
(4)将步骤(3)中得到的电极置于富铜离子材料标记物溶液中，实现铜离子的标记；
(5)测试不同浓度内毒素的差分脉冲伏安曲线，并绘制标准曲线；如图3、4所示；
(6)检测实际样品中内毒素含量的电化学响应电流，对照标准曲线计算得到待测样品中内毒素的含量。
试验例1
按实施例1建立的基于铜离子诱导组装金纳米粒子信号放大策略的方法对人体血清样品进行内毒素含量测定。首先将血液样品进行离心，收集上清液后分散于30mL磷酸盐缓冲液中(10mM，pH＝7.4)。采用加标法配置终含量为1.0、5.0、10.0pg/mL的内毒素样品进行测试。该发明方法的检测结果为0.98±0.17、5.09±0.59、10.57±0.92pg/mL，表明该方法可以准确测定血液样品中的内毒素含量。
试验例2
按实施例2建立的方法进行氯化钠注射液中内毒素含量的测定。采用加标法配置终含量为10、50、100pg/mL的内毒素样品。该发明方法的检测结果为9.61±1.23、50.2±1.95、102.7±4.36pg/mL，表明该方法可以准确测定氯化钠注射液中的内毒素含量。
本发明的上述试验例仅为清楚地说明本发明所作的举例，并非是对本发明实施方式的限制。凡是局部变更或修饰而源于本发明的技术思想仍处于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，所述传感器由适配体修饰电极及富铜离子材料标记物构成。
2.根据权利要求1所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，所述的富铜离子材料为铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体或铜金属有机框架材料。
3.根据权利要求2所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，所述的铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体按如下方法制备得到：
首先通过晶种生长法制备金纳米粒子，将半胱氨酸分子自组装到金纳米粒子表面后，加入可溶性铜盐溶液，使金纳米粒子团聚，得到铜离子诱导组装的金纳米粒子聚集体。
4.根据权利要求3所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，金纳米粒子、半胱氨酸、铜离子的摩尔比为600：1：75。
5.根据权利要求2所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，所述的铜金属有机框架材料按如下方法制备得到：
利用离子热法将硝酸铜、均苯三酸、氯化胆碱及尿素的混合溶液升温晶化，得到铜金属有机框架材料。
6.根据权利要求5所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，硝酸铜、均苯三酸、氯化胆碱及尿素的摩尔比为0.2：0.2：1：2，将反应温度由室温升温到100℃，升温速率5℃/min，晶化时间为3天。
7.根据权利要求1所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，所述的适配体修饰电极是通过羧酸化的导电聚合物和/或金纳米粒子修饰电极利用EDC/NHS酰胺化反应将内毒素核酸适配体共价结合于电极表面。
8.根据权利要求7所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器，其特征在于，
所述的内毒素核酸适配体序列为：5'-CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAGCCGGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-3'。
9.权利要求1-8任一项所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器检测内毒素的方法，包括步骤如下：
(1)制备富铜离子材料标记物；
(2)构建适配体修饰电极；
(3)将适配体修饰电极浸泡于不同浓度的内毒素标准液中进行孵育；
(4)将步骤(3)中得到的电极置于富铜离子材料标记物溶液中，实现铜离子的标记；
(5)测试不同浓度内毒素的电化学响应曲线，并绘制标准曲线；
(6)检测实际样品中内毒素含量的电化学响应电流，对照标准曲线计算得到待测样品中内毒素的含量。
10.根据权利要求9所述的基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器检测内毒素的方法，特征在于，电化学响应曲线测定方法为采用三电极体系，利用循环伏安法、差分脉冲法或交流阻抗法等电化学检测方法，通过对标记物中铜离子的检测，绘制样品中内毒素检测标准曲线。
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