CN110297024A - 一种辣根过氧化物酶传感器的制备及其检测槲皮素的方法 - Google Patents

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Abstract

一种辣根过氧化物酶传感器的制备及其检测槲皮素的方法，本发明方法以大比表面积的金属有机框架化合物/金纳米粒子复合材料为增敏材料，利用酶中的氨基、羧基与金纳米粒子之间的配位作用将辣根过氧化物酶修饰到电极表面，构建了测定槲皮素的辣根过氧化物酶电化学传感器。本发明金属有机框架化合物/金纳米粒子复合材料的增敏作用，在过氧化氢存在下被酶催化氧化的槲皮素的还原作用，可以灵敏、准确、特异性地检测槲皮素。本发明适用于基于金属有机框架化合物/金纳米粒子的辣根过氧化物酶电化学传感器检测槲皮素。

Description

一种辣根过氧化物酶传感器的制备及其检测槲皮素的方法
技术领域
本发明涉及一种辣根过氧化物酶传感器的制备及其检测槲皮素的方法，属酶传感和电化学检测技术领域。
背景技术
槲皮素是一种在自然界中广泛存在的黄酮类化合物，具有较好的止咳、平喘、祛痰的作用，同时槲皮素能显著抑制促癌剂的作用、抑制离体恶性细胞的生长、抑制艾氏腹水癌细胞DNA、RNA和蛋白质合成。因此，建立一种简便、快速、灵敏和准确测定槲皮素的分析方法是非常重要的。辣根过氧化物酶在电子受体过氧化氢存在下，易氧化富含酚羟基的槲皮素，被氧化的槲皮素在电极上还原，其还原电流与槲皮素的浓度在一定范围内成线性关系。基于以上原理，辣根过氧化物酶传感器因其具有设备简单、成本低和灵敏度高等优点，在检测槲皮素中有重要的应用价值。
金属有机框架化合物是金属离子或金属簇与多齿有机配体(如羧基类、咪唑类、吡啶类配体)之间通过共价键、氢键等形成从一维到三维的无限网状结构的一类高度结晶化的材料。金属有机框架化合物与其它多孔材料相比，具有许多优点，例如比表面积大、孔径可调、结构均匀等，其在酶传感器中作为负载酶的载体有着广阔的应用前景。
金纳米粒子具有大的比表面积、优异的电子传导性能、催化性能以及良好的生物相容性，这些优点使其在电化学分析传感领域备受关注。
发明内容
本发明的目的是，为了建立一种简便、快速、灵敏和准确测定槲皮素的分析方法，更好地应用槲皮素，本发明提出一种辣根过氧化物酶传感器的制备及其检测槲皮素的方法。
实现本发明的技术方案如下，
一种辣根过氧化物酶传感器的制备方法，所述方法选择金属有机框架化合物和金纳米粒子为酶传感器的增敏材料，利用辣根过氧化物酶中的氨基、羧基与金纳米粒子之间的配位作用，将辣根过氧化物酶固定到电极表面，制备得到辣根过氧化物酶传感器，具体步骤如下：
(1)将Cu(NO3)2·3H2O溶解在二次蒸馏水中，得到溶液A；将配体溶解在无水乙醇中，得到溶液B；
将溶液A和溶液B混合均匀后转移到高压反应釜中，于100～150℃反应15～30h；冷却后，离心，用无水乙醇和二次蒸馏水洗涤数遍，在烘箱中干燥，得到金属有机框架化合物产物；
(2)将0.1～2.0mg的金属有机框架化合物溶于2～20mL水中，超声分散均匀后，取1～50μL滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干，得到金属有机框架化合物修饰玻碳电极；
(3)将金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于0.1-10mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速20～200mV/s，电位范围为-0.5～2.0V，扫描5-50圈，得到金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极；
(4)将金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于浓度为1.0～6.0mg/mL、pH为5.0～7.0的辣根过氧化物酶溶液中，孵育5～15h，得到辣根过氧化物酶/金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极，即为检测槲皮素的酶传感器。
所述Cu(NO3)2·3H2O为0.200～0.800g；所述二次蒸馏水为5.0～15.0mL。
所述配体为0.100～0.600g；所述配体为对苯二甲酸或2-氨基-对苯二甲酸。
所述无水乙醇为5.0～15.0mL。
一种辣根过氧化物酶传感器对槲皮素的检测方法，所述方法利用金属有机框架化合物/金纳米粒子复合的增敏作用，在过氧化氢的存在下，被辣根过氧化物酶催化氧化的槲皮素在电极上的电化学还原作用，将辣根过氧化物酶传感器为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对槲皮素的高灵敏检测。
所述辣根过氧化物酶传感器用于检测槲皮素的线性范围为4.0μmol/L～44μmol/L，检测限为2.3μmol/L。
本发明利用同一根玻碳电极制备的传感器，测定5次对槲皮素的响应电流，其相对标准偏差为4.5％；利用5根玻碳电极平行制备的传感器对槲皮素测定的相对标准偏差为4.2％，说明所述玻碳电极具有良好的重现性。所述传感器置于4℃的环境中考察其稳定性，两周后，仍保留响应电流值的90％以上，表明该玻碳电极具有良好的稳定性。
本发明的有益效果是，本发明辣根过氧化物酶中的氨基、羧基与金纳米粒子之间的配位作用在金属有机框架化合物、金纳米粒子修饰的玻碳电极表面制备辣根过氧化物酶传感器，由于金属有机框架化合物/金纳米粒子复合材料的增敏作用和酶催化氧化槲皮素，提供了一种基于金属有机框架化合物/金纳米粒子的辣根过氧化物酶电化学传感器灵敏地检测槲皮素的方法。
本发明适用于基于金属有机框架化合物/金纳米粒子的辣根过氧化物酶电化学传感器测定槲皮素。
附图说明
图1酶修饰电极在不同溶液中的循环伏安曲线，其中，
a曲线为酶修饰电极在醋酸缓冲溶液(pH 4.5)中的循环伏安曲线，
b曲线为酶修饰电极在含有4μmol/L槲皮素的醋酸缓冲溶液(pH 4.5)中的循环伏安曲线，
c曲线为酶修饰电极在含有4μmol/L槲皮素和20μmol/L过氧化氢的醋酸缓冲溶液(pH 4.5)中的循环伏安曲线；
图2为传感器的计时电流测试曲线；
图3为传感器的响应电流对槲皮素浓度的校准曲线；
图4为金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极的扫描电镜图；
图5为金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极的能谱图；
图6为检测槲皮素的辣根过氧化物酶传感器制备流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但决不限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例基于金属有机框架化合物/金纳米粒子的辣根过氧化物酶电化学传感器的制备如图6所示，其步骤如下：
(1)将0.350g的Cu(NO3)2·3H2O溶解在5.0mL的二次蒸馏水中，得到溶液A；将0.245g的配体(对苯二甲酸)溶解在5.0mL的无水乙醇中，得到溶液B。将溶液A和溶液B混合均匀后转移到高压反应釜中，于100℃反应15h。冷却后，离心，用无水乙醇和二次蒸馏水洗涤数遍，在烘箱中干燥，得到金属有机框架化合物产物。
(2)将0.1mg的金属有机框架化合物溶于3mL水中，超声分散均匀后，取8μL滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干，得到金属有机框架化合物修饰玻碳电极。
(3)将金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于0.3mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速40mV/s，电位范围为-0.2～1.2V，扫描10圈，得到金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极。
(4)金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于浓度为1.0mg/mL辣根过氧化物酶溶液中(pH 5.0)孵育10h，得到辣根过氧化物酶/金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极，即为检测槲皮素的酶传感器。
实施例2
本实施例基于金属有机框架化合物/金纳米粒子的辣根过氧化物酶电化学传感器的制备如图6所示，其步骤如下：
(1)将0.635g的Cu(NO3)2·3H2O溶解在14.0mL的二次蒸馏水中，得到溶液A；将0.540g的配体(2-氨基-对苯二甲酸)溶解在13.0mL的无水乙醇中，得到溶液B。将溶液A和溶液B混合均匀后转移到高压反应釜中，于120℃反应18h。冷却后，离心，用无水乙醇和二次蒸馏水洗涤数遍，在烘箱中干燥，得到金属有机框架化合物产物。
(2)将2.0mg的金属有机框架化合物溶于15mL水中，超声分散均匀后，取5μL滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干，得到金属有机框架化合物修饰玻碳电极。
(3)将金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于0.8mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速100mV/s，电位范围为-0.3～1.1V，扫描20圈，得到金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极。
(4)金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于浓度为5.0mg/mL辣根过氧化物酶溶液中(pH7.0)孵育5h，得到辣根过氧化物酶/金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极，即为检测槲皮素的酶传感器。
实施例3
本实施例基于金属有机框架化合物/金纳米粒子的辣根过氧化物酶电化学传感器的制备如图6所示，其步骤如下：
(1)将0.545g的Cu(NO3)2·3H2O溶解在7.5mL的二次蒸馏水中，得到溶液A；将0.250g的配体(对苯二甲酸)溶解在7.5mL的无水乙醇中，得到溶液B。将溶液A和溶液B混合均匀后转移到高压反应釜中，于110℃反应24h。冷却后，离心，用无水乙醇和二次蒸馏水洗涤数遍，在烘箱中干燥，得到金属有机框架化合物产物。
(2)将1.0mg的金属有机框架化合物溶于5mL水中，超声分散均匀后，取10μL滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干，得到金属有机框架化合物修饰玻碳电极。
(3)将金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于2mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速100mV/s，电位范围为-0.2～1.4V，扫描20圈，得到金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极。
(4)金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于浓度为4mg/mL辣根过氧化物酶溶液中(pH6.5)孵育10h，得到辣根过氧化物酶/金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极，即为检测槲皮素的酶传感器。
实施例4
将实施例3得到的辣根过氧化物酶传感器用于电化学测试：
(1)酶传感器的循环伏安测试。
以酶修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极。分别在醋酸缓冲溶液(pH 4.5)、含有4μmol/L槲皮素的醋酸缓冲溶液(pH4.5)、含有4μmol/L槲皮素和20μmol/L过氧化氢的醋酸缓冲溶液(pH4.5)中进行循环伏安扫描，扫描速度为0.1V/s。
循环伏安图如图1所示，从图1可见，槲皮素出现了一对氧化还原峰；加入过氧化氢后，槲皮素的还原峰明显增大，氧化峰明显减小，说明在过氧化氢存在下辣根过氧化物酶催化氧化槲皮素。
(2)传感器对槲皮素的计时电流测试。
将酶修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极；底液为含有20μmol/L过氧化氢的0.1mol/L醋酸缓冲溶液(pH4.5)；测定电位为0.3V，测定结果如图2所示。
测定槲皮素的线性范围为4.0μmol/L～44μmol/L(如图3所示)，检测限为2.3μmol/L，灵敏度为254.6A·L/mol。
实施例5
将实施例3得到的金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极进行表征。
采用扫描电镜对金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极的形貌(如图4所示)和能谱(如图5所示)进行表征。
从图4可见，在片状的金属有机框架化合物表面覆盖了一层粒径在几十到一百纳米左右的纳米颗粒。从图5可见，出现了Cu、O、Au、C等元素，说明金纳米粒子/金属有机框架化合物成功修饰到玻碳电极表面。

Claims (6)

1.一种辣根过氧化物酶传感器的制备方法，其特征在于，所述方法选择金属有机框架化合物和金纳米粒子为酶传感器的增敏材料，利用辣根过氧化物酶中的氨基、羧基与金纳米粒子之间的配位作用，将辣根过氧化物酶固定到电极表面，制备得到辣根过氧化物酶传感器，具体步骤如下：
(1)将Cu(NO3)2·3H2O溶解在二次蒸馏水中，得到溶液A；将配体溶解在无水乙醇中，得到溶液B；
将溶液A和溶液B混合均匀后转移到高压反应釜中，于100～150℃反应15～30h；冷却后，离心，用无水乙醇和二次蒸馏水洗涤数遍，在烘箱中干燥，得到金属有机框架化合物产物；
(2)将0.1～2.0mg的金属有机框架化合物溶于2～20mL水中，超声分散均匀后，取1～50μL滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干，得到金属有机框架化合物修饰玻碳电极；
(3)将金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于0.1-10mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速20～200mV/s，电位范围为-0.5～2.0V，扫描5-50圈，得到金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极；
(4)将金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极置于浓度为1.0～6.0mg/mL、pH为5.0～7.0的辣根过氧化物酶溶液中，孵育5～15h，得到辣根过氧化物酶/金纳米粒子/金属有机框架化合物修饰玻碳电极，即为检测槲皮素的酶传感器。
2.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶传感器的制备方法，其特征在于，所述Cu(NO3)2·3H2O为0.200～0.800g；所述二次蒸馏水为5.0～15.0mL。
3.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶传感器的制备方法，其特征在于，所述配体为0.100～0.600g；所述配体为对苯二甲酸或2-氨基-对苯二甲酸。
4.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶传感器的制备方法，其特征在于，所述无水乙醇为5.0～15.0mL。
5.一种辣根过氧化物酶传感器对槲皮素的检测方法，其特征在于，所述方法利用金属有机框架化合物/金纳米粒子复合的增敏作用，在过氧化氢的存在下，被辣根过氧化物酶催化氧化的槲皮素在电极上的电化学还原作用，将辣根过氧化物酶传感器为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对槲皮素的高灵敏检测。
6.根据权利要求5所述一种辣根过氧化物酶传感器对槲皮素的检测方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶传感器用于检测槲皮素的线性范围为4.0μmol/L～44μmol/L，检测限为2.3μmol/L。
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