CN106525943B - 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用 - Google Patents

一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106525943B
CN106525943B CN201610927223.1A CN201610927223A CN106525943B CN 106525943 B CN106525943 B CN 106525943B CN 201610927223 A CN201610927223 A CN 201610927223A CN 106525943 B CN106525943 B CN 106525943B
Authority
CN
China
Prior art keywords
biological
fuel cell
solution
surface protein
biological fuel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610927223.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106525943A (zh
Inventor
邓留
欧阳江
韩雅静
刘又年
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University
Original Assignee
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University filed Critical Central South University
Priority to CN201610927223.1A priority Critical patent/CN106525943B/zh
Publication of CN106525943A publication Critical patent/CN106525943A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106525943B publication Critical patent/CN106525943B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Inert Electrodes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用，该方法是在碳电极表面包覆分子印迹聚合物，将特异性蛋白吸附在分子印迹聚合物表面后，采用氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物标记特异性蛋白，即得表面蛋白压印生物阴极；将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物修饰在碳电极表面，即得生物阳极；将所述表面蛋白压印生物阴极和所述生物阳极与包括PMDS电解池和外部电阻在内的部件组装，得到生物燃料电池传感器；该传感器实现了在存在多种蛋白干扰的复合体系下对特异性糖蛋白的高选择性和灵敏度，且在分子识别时不需外部供能，满足大规模生产与应用要求。

Description

一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及 其应用
技术领域
本发明涉及一种构建自供能生物燃料电池传感器的方法，具体涉及一种构建表面蛋白压印的自供能的生物燃料电池传感器的方法，以及表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器用应用于特异性检测追踪复杂体系中的糖蛋白；属于生物传感器技术领域。
背景技术
糖蛋白在调节细菌致病机制，炎症反应和癌细胞转移等生物过程中扮演着重要的角色。对于临床诊断从而传输细胞的生理状态的信息来说，他们是具有重要意义的肿瘤生物标记物。目前，各种方法包括质谱分析，免疫分析，电泳以及亲和色谱法被开发用于检测和定量糖蛋白。但是绝大多数上述方法需要昂贵的试剂，复杂的操作以及外接能源，使得它们并不是很适合用于实际样品的测试。
最近，自供电的生物燃料电池传感器由于结合了生物催化剂的生物催化活性而大幅提高了电化学能量的转换，从而受到广泛的关注。同时，由于其检测时不需要额外的能源，简单的制备过程，极小的尺寸以及低廉的价格，使得小型化的生物燃料电池传感器在定点检测以及将来的长远应用中具有巨大的优势。另外自供电的生物燃料电池传感器作为一种高灵敏度的以及高选择性的检测手段已经被用于检测半胱氨酸，氰化物，乙醛以及爆炸物等等，此外抗体-抗原，DNA以及适配体-蛋白也被用于与这类传感器结合来提高它的性能，这些先前的研究预示着自供电的生物燃料电池传感器在分析领域具有巨大的应用前景。但是其附加的昂贵费用以及复杂的操作严重限制了这种新理念的自供能生物传感器的定点检测和长远应用。
发明内容
为解决现有检测糖蛋白的分析方法存在灵敏度低、选择性差、费用昂贵、操作复杂、稳定性差等问题，本发明的目的是在于提供一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，该方法简单、成本低，构建的生物燃料电池传感器对糖蛋白具有高选择性识别，且在实现在分子识别时不需外部供能。
本发明的另一个目的是在于提供所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器在检测糖蛋白中的应用，表现出高选择性和灵敏度，稳定性好，且操作简单，不需要外部供能，符合绿色化学的理念，有利于推广应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，该方法包括以下步骤：
1)在碳电极表面包覆分子印迹聚合物(MIP)，得到分子印迹聚合物修饰的电极；将特异性蛋白吸附在所述分子印迹聚合物修饰的电极表面后，采用氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物标记所述特异性蛋白，即得表面蛋白压印生物阴极；
2)将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物修饰在碳电极表面，即得生物阳极；
3)将所述表面蛋白压印生物阴极和所述生物阳极与包括PMDS电解池和外部电阻在内的部件组装，得到生物燃料电池传感器。
优选的方案，将乙烯基苯硼酸溶解在含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液中，超声处理后，依次加入模板特异性蛋白溶液、安息香二甲醚、聚乙二醇及聚乙二醇二丙烯酸酯，搅拌反应，得到分子印迹预聚物溶液；将所述分子印迹预聚物溶液滴加在γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的碳电极表面，干燥，脱除模板特异性蛋白，即得分子印迹聚合物修饰的电极。
较优选的方案，所述含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液的pH为7～10；最佳为pH为9.3。
较优选的方案，所述超声处理采用的超声频率为20～40kHz，超声功率为150～300W。
较优选的方案，所述超声处理的时间为不小于5min，最佳为5min。
较优选的方案，搅拌反应的时间为不小于10min，最佳为10min。
较优选的方案，所述特异性蛋白或模板特异性蛋白为糖蛋白；如甲胎蛋白(HRP)、甲胎蛋白(AFP)、辣根过氧化酶(HRP)等。
较优选的方案，干燥过程采用紫外线进行干燥至少20s；更优选为20s。
较优选的方案，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的碳电极通过如下方法制备得到：将碳电极采用NaOH和二次蒸馏水反复交替洗涤后，置于含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中浸泡，洗涤，干燥，即得。
进一步优选的方案，所述含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液温度为40℃～80℃，最佳为60℃。
进一步优选的方案，所述含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲醇的体积比为1:1～1:10。
进一步优选的方案，所述浸泡的时间不小于8h。
优选的方案，氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物通过如下方法制备得到：在碳纳米管溶液中依次加入羟基琥珀酼亚胺、碳化二亚胺盐酸盐、氨基苯硼酸及胆红素氧化酶溶液，在室温条件下搅拌反应后，离心分离，即得。
优选的方案，将石墨烯分散液与硫堇溶液混合，剧烈震荡或搅拌后，离心收集沉淀；将所述沉淀分散在水中后，与含葡萄糖脱氢酶(GDH)的PBS溶液混合，搅拌，得到硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物溶液；将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物溶液滴加到碳电极表面，即得生物阳极。
优选的方案，采用的外部电阻约为50Ω。
优选的方案，将特异性蛋白吸附在所述分子印迹聚合物修饰的电极的表面后，与氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物共培养，即得表面蛋白压印生物阴极。制备的表面蛋白压印生物阴极不仅可以作为自供能生物燃料电池的阴极，且由于其良好的生物催化活性，对糖蛋白具有高选择性识别，可以构建检测特异性糖蛋白的生物传感器，以解决一般检测糖蛋白的方法存在灵敏度低、选择性差等问题。
本发明的分子印迹预聚物溶液的制备方法：将乙烯基苯硼酸(VPBA)溶解在聚乙二醇(优选为PEG200)以及弱碱性的,Na2HPO4(0.2M)混合溶液(pH为7～10)中，在频率为20～40kHz、功率为150～300W的超声条件下，处理至少5min(优选5min)，再将模板特异性蛋白(优选糖蛋白，如辣根过氧化酶HRP)水溶液、安息香二甲醚、PEG200以及聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)依次加入到上述混合溶液中，并常温搅拌至少10min(优选10min)，得到分子印迹预聚物溶液。
本发明的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)修饰的碳电极通过如下方法制备得到：将碳电极采用NaOH(优选0.1M)和二次蒸馏水反复交替洗涤至少三次后，置于含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液(γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲醇体积比为1:1～10；优选为1:9)中，在40～80℃温度(优选60℃)下，浸泡至少8h(优选8h)，采用甲醇和二次蒸馏水洗涤，干燥，即得。
本发明的氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物的制备过程：在500μL 1mg/mL的碳纳米管溶液中依次加入50μL 0.5M的羟基琥珀酼亚胺(NHS)，50μL 1M的碳化二亚胺盐酸盐(EDC)，50μL浓度为2μM～20μM(优选为6μM)的氨基苯硼酸(APBA)以及10μL浓度为1mg/mL～18mg/mL(优选为12mg/mL)的胆红素氧化酶(BOD)溶液，随后混合溶液在室温下搅拌过夜(至少为12h，优选为12h)；然后反应混合溶液在0～10℃(优选为4℃)条件下10000rmp离心至少15min(优选为15min)，去除上清液，洗涤几次除去游离的BOD和APBA；得沉淀分散在pH为7.0的PBS溶液中，4℃冰箱储存。
本发明的表面蛋白压印生物阴极的制备方法：将分子印迹聚合物修饰的电极置于特异性蛋白中至少20min(优选20min)，得到特异性蛋白捕获的MIP修饰的电极，采用乙腈-水溶液(v/v＝3:7)冲洗1～10次(优选3次)，随后附着在MIPMIP修饰的电极上的特异性蛋白再与APBA/BOD/CNT纳米复合物培养0.5min～4min(优选为2min)，以进一步标记HRP得到的生物阴极用体积比为3:7的乙腈-PBS(10mM，pH＝9.0)冲洗三次并用氮气吹干；随后，HRP压印的MIP电极的氧还原的测试是在含饱和空气的静态的10mM还原型辅酶(NAD+)，15mM葡萄糖以及0.2M磷酸缓冲液(PBS)的混合溶液(pH＝7.5)中进行的。
本发明的硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶的生物阳极的制备：将均匀分散的石墨烯与的硫堇水溶液混合后，剧烈震荡或搅拌至少30min(优选30min)后，以10000rpm的转速离心20min收集稳定的黑绿色物质；得到的硫堇/石墨烯用二次水至少洗涤三次以除去松动的硫堇分子，然后溶解在pH＝7.4的PBS溶液中的(葡萄糖脱氢酶)GDH与上述硫堇/石墨烯悬浮液混合并搅拌1～10min(优选为5min)，随后取5μL上述混合溶液滴在碳电极表面从而组装形成生物阳极。
本发明还提供了所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的应用，将表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器应用于糖蛋白的特异性检测。
本发明提供的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器特别适用于复杂体系中糖蛋白的特异性检测。
本发明的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器作为识别糖蛋白的传感器对糖蛋白进行检测的方法：以辣根过氧化酶为例进行具体说明。测定实验在尺寸与3mm×3mm×60mm PDMS电解池相同的生物阴极表面进行。在湿度箱里面将表面蛋白压印生物阴极暴露在20μL糖蛋白样品中20min，然后用乙腈-水(v/v＝3:7)溶液清洗5min，MIP生物阴极上捕获的蛋白再与5μL APBA/BOD/CNT纳米复合物培育2min用于进一步标记糖蛋白，得到的生物阴极进一步用体积比为3:7的乙腈-10mM PBS(pH为9.0)清洗5min，并用氮气吹干；然后电解液(10mM NAD+，15mM葡萄糖以及0.2M pH为7.5的PBS空气饱和的静态溶液)加入到PDMS电解池中，每个浓度测试三次，观察其电信号来确定浓度。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
1)本发明的技术方案提供的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器实现了对糖蛋白的特异性识别检测，且不需外部提供能量，实现了在分子识别时不需外部供能。
2)本发明的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器尺寸小型化，操作简单，价格低廉，有利于大规模生产和应用。
3)本发明的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器在存在多种蛋白干扰的复合体系下实现了对特异性糖蛋白的高选择性和灵敏度，可以广泛应用于糖蛋白的分析检测。
4)本发明基于表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器检测糖蛋白的方法，相较于传统的糖蛋白的检测方法，具有成本低廉、稳定、简单、快速等特点，且不需要外部供能，符合绿色化学的理念。
5)本发明的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器将分子印迹聚合物与生物受体绑定结合，如采用硼酸绑定的分子印迹聚合物相较于传统的生物受体(例如：抗体和适配体)来说，具有更好的稳定性，更低的费用以及更大的构建几率。
附图说明
【图1】
a为实施例1中制得的MIP/HRP/ABPA/BOD/CNT电极在pH为7.0存在10μg/mL的HRP的饱和氮气(1号线)和空气(2号线)条件下的PBS溶液中的伏安曲线图；从图中可以看出生物阴极在0.54V对氧气表现出了良好的生物电催化活性，与电子受体BOD氧化还原的氧化还原电位值是一致的，表明BOD固定在了MIP电极上，并且能够有效的催化氧还原。
b是制得的MIP/HRP/ABPA/BOD/CNT电极在pH为7.0分别存在10ng/mL(3号线)，1μg/mL(2号线)，100μg/mL(1号线)的HRP的饱和空气条件下的PBS溶液中的伏安极化曲线图；从图中可以看出，随着HRP浓度的增加，催化电流峰是逐渐增加的，说明MIP生物阴极可以作为一个很好的自供能MIP传感器。
c是MIP/HRP/ABPA/CNT电极在pH为7.0存在10μg/mL的HRP的饱和氮气(1号线)和空气(2号线)条件下的PBS溶液中的伏安曲线图；在不存在BOD的MIP/HRP/ABPA/CNT电极中没有明显的催化电流峰出现，说明BOD能有效的催化氧还原。
【图2】
a是实施例2制得的硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶(GDH)电极在PBS溶液(1号线)，PBS中包含10mM NAD+以及15mM葡萄糖溶液(3号线)，PBS中包含15mM葡萄糖溶液(2号线)中的伏安曲线图；从图中可以看出硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶电极在存在NAD+的时候对葡萄糖氧化展现了良好的电催化性能；随着葡萄糖的加入，阳极电流在0V左右出现了大幅增加；可能是由于组装在石墨烯表面的硫堇必要的中介和传导途径，促进了NAD+与电极表面的电子流通。
b是硫堇/石墨烯电极PBS溶液(1号线)，PBS中包含10mM NAD+以及15mM葡萄糖溶液(2号线)，PBS中包含15mM葡萄糖溶液(3号线)中的伏安曲线图；从图中可以看出在不存在GDH的电极在同样的条件下在0V左右没有电流的上升，说明电极不能有效的催化葡萄糖的氧化。
c是石墨烯电极PBS溶液(1号线)，PBS中包含10mM NAD+以及15mM葡萄糖溶液(2号线)，PBS中包含15mM葡萄糖溶液(3号线)中的伏安曲线图；从图中可以看出在不存在硫堇的电极在同样的条件下在0V左右同样没有电流的上升，说明电极不能有效的催化葡萄糖的氧化。
d是制得的硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶(GDH)电极在包含20mM葡萄糖，5mM NAD+的饱和空气条件下的PBS溶液(pH＝7.0)中的伏安极化曲线图；从图中可以看出氧化电位的电流从刚开始的-0.10V的位置逐渐增加到最大值的位置0.10V(电流最大值为161μA)，证明硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶(GDH)电极对葡萄糖氧化表现了良好的催化；所有的实验是在含饱和空气的pH为7.0的PBS溶液里面进行的。
【图3】
a是实施例1制备的硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶(GDH)修饰的阳极(1号线)以及MIP/HRP/ABPA/BOD/CNT阴极(2号线)在pH为7.5存在100μg/mL的HRP并包含的10mM NAD+，15mM葡萄糖以及饱和空气(2号线)条件下的0.2M的PBS溶液中的伏安极化曲线；从图中可以看出葡萄糖氧化的起始电位大约在-0.1V，在0.2V左右达到最大值为140μAcm–2；氧还原的起始电位大约在0.51V，在0.1V时达到最大值为125μA cm–2；可以从中得出生物阳极和生物阴极展现了良好的催化活性，可以作为高性能原料电池的一部分。
b是上述两种电极组装成小型化的葡萄糖/氧气生物燃料电池的能量输出曲线；电池的能量输出测试是在存在100μg/mL HRP，10mM NAD+以及15mM葡萄糖溶液的浓度为0.2M的PBS(pH7.5)空气饱和静态溶液中进行的；从图中可以看出电压为400mV时能量达到最大为400μW cm–2，说明我们的电极可以很好的构建生物燃料电池。
【图4】
a构建的小型化的HRP生物燃料电池的最大输出能量与不同浓度的HRP(对数)之间的相关关系(3号线)与线性关系(2号线)，其中3号线为MIP-生物燃料电池，1号线为NIP-生物燃料电池；从图中可以看出MIP-生物燃料电池的最大输出功率Pmax与HRP浓度(1ng/mL到10μg/mL)展现了良好的线性关系(R2＝0.999)，同时通过计算得到MIP-生物燃料电池对糖蛋白的绑定能力值可以达到10.9，而NIP-生物燃料电池对糖蛋白的识别绑定能力基本为零。
b是制备的小型自供能的MIP-生物燃料电池对存在1μg/mL HRP或1mg/mL干涉蛋白(包括BSA，RNaseB，TRF)或10mg/mL葡萄糖的0.2M PBS溶液中HRP的选择性；空白样品中不包含蛋白和葡萄糖；从图中可以看出不论是空白对照，葡萄糖溶液(10mg/mL)或别的蛋白(1mg/mL)信号都比HRP(1μg/mL)弱很多，说明HRP压印的自供能的MIP-生物燃料电池对HRP拥有极高的选择性。
【图5】
构建的小型化的AFP生物燃料电池的最大输出能量与不同浓度的AFP(对数)之间的相关关系，其中2号线为MIP-生物燃料电池，1号线为NIP-生物燃料电池；从图中可以看出MIP-生物燃料电池的最大输出功率Pmax与AFP浓度(1ng/mL到1mg/mL)展现了良好的线性关系，同时通过计算得到MIP-生物燃料电池对糖蛋白的绑定能力值可以达到9.7，而NIP-生物燃料电池对糖蛋白的识别绑定能力基本为零。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定的范围
实施例1
步骤(1)蛋白质压印大孔单层分子印迹聚合物(MIP)电极的制备：
首先，碳电极用0.1M的NaOH和二次水分别清洗三次，然后将电极浸没在60℃的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)以及甲醇混合溶液(体积比1:9)中8h。最后，将电极用甲醇和二次水分别冲洗以去除残余的试剂。1mg乙烯基苯硼酸(VPBA)先溶解在100μL聚乙二醇200(PEG200)以及94μL pH＝9.3的0.2M Na2HPO4混合溶液中并超声5min。然后，将6μL10mg/mL的辣根过氧化酶(HRP)水溶液，1mg安息香二甲醚，300μL PEG200以及100μL聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)依次加入到上述混合溶液中并常温搅拌10min，得预聚物溶液。预处理的电极用所得的预聚物溶液(0.1mg/mL的模板溶液，V交联剂：V致孔剂＝1:4)包覆，同时用一个适当的光罩覆盖，并用紫外线干燥20s。得到的MIP电极用体积比为3:7的乙腈-水溶液清洗30min以除去未反应的物质。最后，电极浸没在0.2M含有30％乙腈(体积比)的磷酸溶液中，震荡2h以提取出压印模板。
步骤(2)氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物的合成：
向500μL1mg/mL的碳纳米管溶液中依次加入50μL0.5M的NHS，50μL1M的EDC，50μL6μM APBA以及10μL 12mg/mL的BOD溶液，随后混合溶液在室温下搅拌过夜。然后反应混合液在4℃条件下离心(10000rmp)15min，去除上清液，洗涤4次以除去游离的BOD和APBA。最后，得到的沉淀分散在100μL0.01M的pH＝7.0的PBS溶液中，然后储存在4℃冰箱中，使用前用PBS稀释到所需浓度。
步骤(3)制备HRP-压印的MIP生物阴极的制备：
MIP生物阴极的获得首先用HRP捕获MIP修饰后的碳电极，先在湿度箱中将电极暴露在20μL不同浓度的HRP样品中20min，然后用乙腈-水溶液(v/v＝3:7)冲洗5min，随后附着在MIP电极上的HRP再与5μL APBA/BOD/CNT纳米复合物培养2min以进一步标记HRP。得到的生物阴极用体积比为3:7的乙腈-PBS(10mM,pH＝9.0)冲洗5min并用氮气吹干。随后，HRP压印的MIP电极的氧还原的测试是在含饱和空气的静态的10mM还原型辅酶(NADH)，15mM葡萄糖以及0.2M磷酸缓冲液(PBS)的混合溶液(pH＝7.5)中进行的。
步骤(4)制备硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶的生物阳极的制备：
20mL0.5mg/mL均匀分散的石墨烯与20mL0.2mM的硫堇水溶液混合，剧烈震荡或搅拌30min后，以10000rpm的转速离心20min收集稳定的黑绿色物质。得到的硫堇/石墨烯用二次水至少洗涤三次以除去松动的硫堇分子，然后100μL5mg/mL溶解在pH＝7.4的PBS溶液中的(葡萄糖脱氢酶)GDH与100μL0.25mg/mL的硫堇/石墨烯悬浮液混合并搅拌5min，随后取5μL上述混合溶液滴在碳电极表面从而组装形成生物阳极。生物电极的电化学性能的测试是通过EG&G 273A电化学系统测试的。盘绕的铂丝以及Ag/AgCl(浸泡在饱和KCl)电极分别作为对电极和参比电极。
步骤(5)生物燃料电池小型压印碳电极的制备：
小型压印碳电极芯片的制备是在塑料基板上通过使用标准的精密加工技术制备而成。生物阴极以及生物阳极的构建如上所述。所有的电极修饰过程是在与电极表面积大小一样的PDMS电解池里进行的然后，上述两种修饰后的电极插入到尺寸为Φ＝5mm高60mm的PDMS电解池中。一个电阻大约50Ω的外部电阻将两个电极连接起来用于评估生物燃料电池的性能。在电解液(10mM NAD+，15mM葡萄糖以及0.2M pH为7.5的PBS空气饱和的静态溶液)加入到PDMS电解池中后，生物燃料电池系统的电流和电压的输出是通过同一个数字万用表测试的。所有的测试是在30℃完成的。
基于分子印迹聚合物-生物燃料电池构建的自供能传感器对糖蛋白的测试：
辣根过氧化酶(HRP)的捕获实验首先是在尺寸与3mm×3mm×60mm PDMS电解池相同的生物阴极表面进行的。在湿度箱里面将分子印迹聚合物生物阴极暴露在20μL糖蛋白样品中20min，然后用乙腈-水(v/v＝3:7)溶液清洗5min，MIP生物阴极上捕获的蛋白再与5μLAPBA/BOD/CNT纳米复合物培育2min用于进一步标记糖蛋白。得到的生物阴极进一步用体积比为3:7的乙腈-10mM PBS(pH 9.0)清洗5min，并用氮气吹干。然后电解液(10mM NAD+，15mM葡萄糖以及0.2M pH为7.5的PBS空气饱和的静态溶液)加入到PDMS电解池中，每个浓度测试三次。
基于分子印迹聚合物-生物燃料电池构建的自供能传感器的选择性：
选择性实验是以HRP为模板的MIP-BFCs对核糖核酸酶B，人载脂蛋白转铁蛋白(TRF)，牛血清蛋白(BSA)以及辣根过氧化物酶(HRP)的选择性。20μL1μg/mL溶解在0.1M的PBS(pH 7.4)溶液中的特异性蛋白滴加到PDMS电池上，并且在湿度箱里面培育20min，再用乙腈-水(v/v＝3:7)溶液清洗5min后，糖蛋白修饰后的生物阴极进一步APBA/CNT/BOD纳米复合物交联通过将电极与5μL APBA/CNT/BOD纳米复合物培育2min。选择性实验是通过比较各种干扰蛋白信号强度的百分比与同浓度下的HRP信号强度的百分比。另外高浓度的葡萄糖也被来干扰HRP的检测，主要是通过将1μg/mL HRP的样品与1g/L葡萄糖混合后检测HRP，每次实验进行三次平行实验。
实施例2
步骤(1)蛋白质压印大孔单层分子印迹聚合物(MIP)电极的制备：
为了制备甲胎蛋白(AFP)压印的大孔单层MIP电极，在制备模板溶液时，16μL溶解在pH＝7.5的PBS溶液中的AFP溶液(1mg/mL)用以替代HRP加入到上述要制备的模板溶液中，其它步骤一样
步骤(2)氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物的合成：
与实施例1步骤(2)相同。
步骤(3)制备AFP-压印的MIP生物阴极的制备：
与实施例1步骤(2)相同，只是将HRP替换成等浓度的AFP。
步骤(4)制备硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶的生物阳极的制备：
与实施例1步骤(4)相同。
步骤(5)生物燃料电池小型压印碳电极的制备：
与实施例1步骤(5)相同。
基于分子印迹聚合物-生物燃料电池构建的自供能传感器对糖蛋白的测试：
将实施例1中基于分子印迹聚合物-生物燃料电池构建的自供能传感器对糖蛋白的测试步骤中的HRP替换成同浓度的AFP，其余步骤相同。
基于分子印迹聚合物-生物燃料电池构建的自供能传感器的选择性：
将实施例1中基于分子印迹聚合物-生物燃料电池构建的自供能传感器的选择性的测试步骤中的HRP替换成同浓度的AFP，其余步骤相同。
对比实施例1
步骤(1)蛋白质压印大孔单层分子印迹聚合物(NIP)电极的制备：
将实施例一中的预聚物换成等体积的二次水，其余步骤相同。
步骤(2)氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物的合成：
与实施例一步骤(2)相同。
步骤(3)HRP-压印的NIP生物阴极的制备：
NIP生物阴极与实施例一中MIP生物阴极的制备方法相同。
发现NIP生物阴极对糖蛋白没有特异性识别作用。可能是由于MIP生物阴极中的硼酸盐能够特异性识别糖蛋白中的糖基成分。
对比实施例2
步骤(1)蛋白质压印大孔单层分子印迹聚合物(MIP)电极的制备：
与实施例一步骤(1)相同。
步骤(2)氨基苯硼酸(APBA)/碳纳米管(CNT)纳米复合物的合成：
APBA/CNT制备的方式与与实施例一步骤(2)方法相同，只是在第一步中不加入BOD。
步骤(3)MIP/HRP/APBA/CNT生物阴极的制备：
MIP/HRP/APBA/CNT生物阴极的构建是通过将附着在MIP电极上的HRP于5μL APBA/CNT溶液中孵育2min，其余步骤与实施例步骤(3)相同。
发现对糖蛋白检测中，被MIP基底捕获的糖蛋白是由BOD/CNT的负载量决定的，直接影响到生物燃料电池的性能。所以这种未加入BOD的电极性能相较于MIP/HRP/APBA/BOD/CNT电极性能极差。
对比实施例3
步骤(1)蛋白质压印大孔单层分子印迹聚合物(MIP)电极的制备：
与实施例一步骤(1)相同。
步骤(2)氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物的合成：
与实施例一步骤(2)相同。
步骤(3)制备HRP-压印的MIP生物阴极的制备：
与实施例1步骤(3)相同。
步骤(4)制备石墨烯/葡萄糖脱氢酶的生物阳极的制备：
石墨烯电极的构建是通过直接将石墨烯悬浮液滴到碳电极表面。将100μL5mg/mL溶解在pH＝7.4的PBS溶液中的GDH与100μL 0.25mg/mL的石墨烯悬浮液混合以获取石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物，然后将5μL石墨烯/葡萄糖脱氢酶混合物滴到碳电极表面作为石墨烯/葡萄糖脱氢酶修饰的阳极。其余步骤与实施例1相同。
发现石墨烯/葡萄糖脱氢酶的生物阳极性能相较于硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶的生物阳极来说性能较差，其中硫堇在此处起到了电子传递的作用。

Claims (8)

1.一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将乙烯基苯硼酸溶解在含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液中，超声处理后，依次加入模板特异性蛋白溶液、安息香二甲醚、聚乙二醇及聚乙二醇二丙烯酸酯，搅拌反应，得到分子印迹预聚物溶液；将所述分子印迹预聚物溶液滴加在γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的碳电极表面，干燥，脱除模板特异性蛋白，即得分子印迹聚合物修饰的电极；将特异性蛋白吸附在所述分子印迹聚合物修饰的电极表面后，采用氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物标记所述特异性蛋白，即得表面蛋白压印生物阴极；
2)将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物修饰在碳电极表面，即得生物阳极；
3)将所述表面蛋白压印生物阴极和所述生物阳极与包括PMDS电解池和外部电阻在内的部件组装，得到生物燃料电池传感器。
2.根据权利要求1所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：
所述含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液的pH为7～10；
所述超声处理采用的超声频率为20～40kHz，超声功率为150～300W；
所述超声处理的时间为不小于5min。
3.根据权利要求1所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：所述特异性蛋白为糖蛋白。
4.根据权利要求1所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的碳电极通过如下方法制备得到：将碳电极采用NaOH和二次蒸馏水反复交替洗涤后，置于含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中浸泡，洗涤，干燥，即得。
5.根据权利要求4所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：
所述含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液温度为40℃～80℃；
所述含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲醇的体积比为1:1～1:10。
所述浸泡的时间不小于8h。
6.根据权利要求1所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：所述的氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物通过如下方法制备得到：在碳纳米管溶液中依次加入羟基琥珀酼亚胺、碳化二亚胺盐酸盐、氨基苯硼酸及胆红素氧化酶溶液，在室温条件下搅拌反应后，离心分离，即得。
7.根据权利要求1所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：将石墨烯分散液与硫堇溶液混合，震荡或搅拌后，离心收集沉淀；将所述沉淀分散在水中后，与含葡萄糖脱氢酶的PBS溶液混合，搅拌，得到硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物溶液；将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物溶液滴加到碳电极表面，即得生物阳极。
8.权利要求1～7任一项所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的应用，其特征在于：应用于糖蛋白的特异性检测。
CN201610927223.1A 2016-10-31 2016-10-31 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用 Expired - Fee Related CN106525943B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610927223.1A CN106525943B (zh) 2016-10-31 2016-10-31 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610927223.1A CN106525943B (zh) 2016-10-31 2016-10-31 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106525943A CN106525943A (zh) 2017-03-22
CN106525943B true CN106525943B (zh) 2018-10-19

Family

ID=58293117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610927223.1A Expired - Fee Related CN106525943B (zh) 2016-10-31 2016-10-31 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106525943B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108722369B (zh) * 2017-12-15 2020-12-25 南京大学 一种通用便捷的表位印迹方法及所得分子印迹聚合物的应用
CN109254038B (zh) * 2018-09-14 2020-08-07 青岛农业大学 基于pbfc的自供能细胞传感器及其应用
CN110898032B (zh) * 2018-09-17 2021-09-14 天津大学 一种近红外光致异构纳米药物传递体系的制备方法
CN109765279B (zh) * 2019-01-14 2020-12-01 安徽师范大学 基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器及其制备方法和应用
CN110470716A (zh) * 2019-09-11 2019-11-19 江南大学 一种复合纳米材料修饰的丝网印刷电极的制备方法
CN113571812B (zh) * 2021-07-23 2022-12-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于光/化学一体化能量转换的生物光电化学电池
CN114354696B (zh) * 2021-11-25 2023-05-16 中国科学院海洋研究所 一种摩擦纳米发电机驱动的dna生物传感器及其应用
CN116124351B (zh) * 2023-03-02 2024-07-05 厦门大学 一种可植入式全蛋白lc无线无源压力传感器及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101151764A (zh) * 2003-11-05 2008-03-26 圣路易斯大学 生物阴极中的固定化酶
CN101351913A (zh) * 2005-11-02 2009-01-21 圣路易斯大学 在生物阳极、生物阴极、和生物燃料电池中使用酶的直接电子转移
WO2011084540A1 (en) * 2009-12-15 2011-07-14 Heliotronic Energy Systems, Llc Bubble architectures and methods of making and using thereof
CN102569861A (zh) * 2012-01-13 2012-07-11 南京大学 一种酶生物燃料电池及其制法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101151764A (zh) * 2003-11-05 2008-03-26 圣路易斯大学 生物阴极中的固定化酶
CN101351913A (zh) * 2005-11-02 2009-01-21 圣路易斯大学 在生物阳极、生物阴极、和生物燃料电池中使用酶的直接电子转移
WO2011084540A1 (en) * 2009-12-15 2011-07-14 Heliotronic Energy Systems, Llc Bubble architectures and methods of making and using thereof
CN102569861A (zh) * 2012-01-13 2012-07-11 南京大学 一种酶生物燃料电池及其制法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Fluorescence Nanosensor for Glycoproteins with Activity Based on the Molecularly Imprinted Spatial Structure of the Target and Boronate Affinity;Zhang Wei等;《Angewandte Chemie International Edition 》;20140911;第53卷(第46期);第12697-12701页 *
壳聚糖/葡萄糖氧化酶-聚氨基苯硼酸-纳米金/镀金金电极用于生物传感和生物燃料电池研究;黄毅等;《化学传感器》;20120331;第32卷(第1期) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106525943A (zh) 2017-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106525943B (zh) 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用
Dai et al. Reagentless amperometric immunosensors based on direct electrochemistry of horseradish peroxidase for determination of carcinoma antigen-125
Lapierre-Devlin et al. Amplified electrocatalysis at DNA-modified nanowires
Dhawan et al. Recent developments in urea biosensors
Wang et al. Acetylcholinesterase electrochemical biosensors with graphene-transition metal carbides nanocomposites modified for detection of organophosphate pesticides
Zhang et al. A glucose biosensor based on immobilization of glucose oxidase in electropolymerized o-aminophenol film on platinized glassy carbon electrode
Li et al. Simultaneous determination of dopamine and serotonin by use of covalent modification of 5-hydroxytryptophan on glassy carbon electrode
Numnuam et al. An amperometric uric acid biosensor based on chitosan-carbon nanotubes electrospun nanofiber on silver nanoparticles
Singh et al. A dual enzyme functionalized nanostructured thulium oxide based interface for biomedical application
CN110823980B (zh) 一种基于类过氧化酶催化银沉积检测gpc3的方法
Batra et al. An amperometric lactate biosensor based on lactate dehydrogenase immobilized onto graphene oxide nanoparticles‐modified pencil graphite electrode
Karadag et al. Modified gold surfaces by 6-(ferrocenyl) hexanethiol/dendrimer/gold nanoparticles as a platform for the mediated biosensing applications
Temoçin Designing of a stable and selective glucose biosensor by glucose oxidase immobilization on glassy carbon electrode sensitive to H 2 O 2 via nanofiber interface
Ouyang et al. Fabrication of surface protein-imprinted biofuel cell for sensitive self-powered glycoprotein detection
Bagal-Kestwal et al. Electrically nanowired-enzymes for probe modification and sensor fabrication
CN102147389B (zh) 一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法
Willander et al. ZnO based potentiometric and amperometric nanosensors
Li et al. A microbial electrode based on the co-electrodeposition of carboxyl graphene and Au nanoparticles for BOD rapid detection
Zhang et al. A stable biosensor for organophosphorus pesticide detection based on chitosan modified graphene
Li et al. Electrochemical sensors applied for in vitro diagnosis
Pimpilova et al. Biosensing dopamine and L-Epinephrine with Laccase (Trametes pubescens) immobilized on a gold modified electrode
CN101963592B (zh) 基于辣根过氧化物酶-多孔植酸锆纳米粒子修饰玻碳电极的电化学生物传感器的制备方法
Oh et al. Closed bipolar electrode-enabled electrochromic sensing of multiple metabolites in whole blood
Sun et al. Paper‐based electrochemical sensor
Ankitha et al. A mini review on recent advances in MXene based electrochemical wearable sensing devices

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20181019

Termination date: 20191031