CN108722369B - 一种通用便捷的表位印迹方法及所得分子印迹聚合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种通用便捷的表位印迹方法，该方法为：首先选择目标蛋白的末端多肽作为特征表位，经过糖化处理后得到的糖化多肽作为印迹模板，印迹模板通过硼亲和作用被锚定于硼酸功能化的基底材料，然后根据表位序列的氨基酸种类，选择不同种类和比例的单体硅烷化试剂进行非共价印迹，印迹层厚度通过调节印迹时间实现精准印迹，得到分子印迹聚合物。该印迹技术具有通用性好、制备便捷和识别性能好等优点。本发明制备的分子印迹材料不仅可以识别表位片段，而且可以特异性识别完整目标蛋白，在分离、富集、纯化、传感、蛋白质组学和靶向识别等领域具有重要的应用前景。

Description

一种通用便捷的表位印迹方法及所得分子印迹聚合物的应用

技术领域

本发明属于仿生分子识别材料和分子印迹技术领域。

背景技术

抗体是生物体抵御病毒和微生物等有害物质入侵的重要武器，也是在生命科学研究领域中用于生物分子识别的最为广泛的生物试剂。然而，抗体存在着明显的局限性。首先，抗体的制备比较繁琐，价格通常比较昂贵。其次，在制备中需要以识别目标分子为抗原，以诱导动物或细胞株产生相应的抗体，因而一些纯品难以获得或者其免疫原性差的目标分子的抗体难以制备。再者，抗体的稳定性和重现性较差。因此，发展抗体的替代物不仅具有重要的科学意义，而且具有巨大的经济价值。

分子印迹聚合物(MIP)[Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1972,11,341-345；Nature1993,361,645-647]是一种化学合成的高分子材料，具有类似抗体的分子识别性能或酶的催化活性。它是在模板分子(即目标分子)存在的情况下引发功能单体和交联剂等的聚合，聚合结束后除去模板分子，聚合物中留下了与模板分子形状、大小和官能团相互补的印迹空腔，从而能与目标分子专一结合，而不结合其他分子。和抗体比较，分子印迹聚合物具有制备简单，成本低廉，稳定性好等优点。分子印迹聚合物已经在传感[Adv.Mater.2013,25,566-570]、分离[Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,495-498]和催化[Chem.Rev.2002,102,1-28]等重要领域获得了成功的应用。尽管分子印迹技术已经取得了显著的进步，但生物大分子尤其是蛋白质的分子印迹，仍然是挑战性的任务。一方面，蛋白质的分子尺寸较大，很难从高度交联的聚合物网状结构中除去。另一方面，蛋白质的空间构象在苛刻的聚合条件下容易发生改变，所得印迹空腔不能有效识别目标蛋白质。

通常分子印迹技术以完整的目标分子为模板，这使得蛋白质的分子印迹所涉及到的以上两个方面的不利因素变得更加严重。为了克服这些不利因素，Minoura等最先提出了“表位印迹”的概念，利用目标多肽分子上含4个氨基酸的一段短肽作为模板，印迹得到的聚合物可以用于目标多肽的识别[J.Chromatogr.A 2000,889,111-118；Biochim.Biophys.Acta 2001,1544,255-266]。Shea等在此基础上提出了蛋白质的表位印迹技术[Angew.Chem.,Int.Ed.2006,45,2392-2396]。之后，表位印迹技术得到广泛的发展。该方法选取蛋白质C端或N端的一段能代表该蛋白质的特征多肽序列(通常含九个氨基酸残基)为印迹模板，即以表位部分代替整个蛋白作为模板，所得分子印迹聚合物能专一识别完整目标蛋白。相对于传统的蛋白质印迹方法，表位印迹中模板肽段可以化学合成，容易获得且价格低廉。肽段结构稳定，对苛刻的印迹条件不敏感，因此表位的印迹条件可选范围宽。表位相对于完整蛋白的分子尺寸明显小得多，有利于从聚合物中移除模板。但是，现有的表位印迹法仍存在明显的局限。首先，绝大部分的表位印迹方法不是便捷、通用的方法，从一个目标蛋白切换到另一个时，印迹条件通常仍需从头摸索。其次，缺乏通用的能将表位多肽有效固定的基础材料，导致表位多肽在印迹时的空间取向上是杂乱无章的，产生的印迹腔与在目标蛋白中的表位序列方向不一致，从而无法有效识别目标蛋白。更重要的是，大部分的表位印迹方法在印迹进程上不是可预测和可控的，从而难以得到性能先进的分子印迹聚合物。

硼酸能可逆结合糖蛋白、聚糖和单糖等含顺式二羟基的生物分子。在硼亲和相互作用的基础上，刘震等已发展出两个普遍适用于糖蛋白的、便捷、高效的分子印迹新方法，包括：1)光刻硼亲和分子印迹法[Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,7451-7454；刘震，李澧。一种专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物及其制法和应用。中国发明专利。申请号：2011104161988，专利授权号：CN102516458B。申请日期：2011-12-13。授权日期：2014.01.08]，和2)硼亲和可控定向表面印迹法[Chem.Sci.2014,5,1135-1140；Nat.Protoc.2017,12,964-987；刘震，王双寿，毕晓东。一种可控、通用的定向表面印迹方法以及所得分子印迹聚合物的应用。中国发明专利，申请号：201310339600.6。申请日期：2013-08-06。授权日期：2016-08-10]。所得分子印迹材料展现出先进的识别性能(宽的pH适用范围、高专一性、高亲和力和超强的抗干扰能力)。其中，硼亲和可控定向表面印迹法更为优越，其适用范围更广，可以适用于任何形状的支撑材料，同时，印迹过程是可预测和可控的，容易获得最佳的印迹条件。该方法已进一步发展成为适用于聚糖[Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,10211-10215]和单糖[Sci.Rep.2016,6,22757]的印迹的通用方法。该方法制备的分子印迹聚合物特异性强，印迹效率高，适用的基底材料广泛(从二维到三维结构，从常规尺寸到纳米尺寸)。该方法最大优势在于印迹层的厚度可以通过调节印迹时间控制。当改变目标分子时，印迹过程只需要根据目标分子尺寸调整印迹时间，就可以得到优异的结合性能。但是，对于不含顺式二羟基基团的非糖蛋白，由于不存在硼亲和作用，以上分子印迹方法不适用。

发明内容

针对现有蛋白质的分子印迹技术中面临的问题，本发明提供一种能通用、高效地制备能识别蛋白质的表位印迹方法，以及所得分子印迹聚合物的应用。所得分子印迹聚合物不仅能识别表位片段，而且能够特异性识别目标蛋白。

为了解决上述目的，本发明的技术方案如下：

一种通用便捷的表位印迹方法，其特征在于：选择目标蛋白的末端多肽作为特征表位，经过糖化处理后得到的糖化多肽作为印迹模板，印迹模板通过硼亲和作用被锚定于硼酸功能化的基底材料，然后根据表位序列的氨基酸种类，选择不同种类和比例的单体硅烷化试剂进行非共价印迹，印迹层厚度通过调节印迹时间实现精准印迹，得到分子印迹聚合物。

进一步地，所述特征表位的确定：找出目标蛋白的氨基酸序列信息，选择目标蛋白的N端或C端多肽序列作为表位。

进一步地，所述的糖化C端表位，通过其表位的末端先连接赖氨酸，然后赖氨酸的残基通过希夫碱反应与单糖进行糖化；所述的糖化N端表位，通过其表位的起始氨基酸的氨基通过希夫碱反应与单糖进行糖化。

为了保证糖化表位多肽与硼酸配基有强的作用力，最好选择果糖和葡萄糖等与取代硼酸具有强亲和力的单糖。本发明糖化表位序列中采用果糖，但不排除其他单糖的使用。

进一步地，所述硼酸功能化基底材料包括但不限于磁性纳米材料、单层金纳米粒子自组装玻璃片和银纳米材料等。

进一步地，所述硼酸功能化过程中根据材料修饰的表面活性官能团不同而不同，所用取代硼酸包括但不限于2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸、醛基苯硼酸、氨基苯硼酸、羧基苯硼酸、巯基苯硼酸和烯基苯硼酸等。

进一步地，所述单体硅烷化试剂根据表位序列的氨基酸种类进行选择，包括但不限于氨丙基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷和原硅酸四乙酯等。

进一步地，所得分子印迹层的厚度在确定硅烷化试剂种类和比例下，通过调节印迹时间而精准印迹糖化表位。

本发明通用型表位印迹方法在亲和分离、纯化和富集，靶向识别，生物传感和生物医学中的应用。

本发明发展出一种广泛适用于蛋白质的、便捷高效的表位印迹技术。本发明是一种以糖化表位多肽为模板的分子印迹技术，不需要目标蛋白纯品，只需要知道蛋白的一级结构序列信息，利用化学合成手段获得糖化的表位多肽，通过印迹糖化表位多肽而制得能专一识别目标蛋白的分子印迹聚合物。和现有的表位印迹技术比较，本发明具有显著的不同：1)现有的表位印迹技术通常直接以表位多肽为印迹模板，而本方法则需要在表位多肽的基础上进行结构加工，得到糖化表位多肽；2)现有的表位印迹技术由于缺乏合适的锚定基团，印迹过程常常是无序和非可控的，而本方法则是定向和可控的；3)现有的表位印迹技术仅适用于少数的目标蛋白，而本方法则是通用的，不仅适用于非糖蛋白而且适用于糖蛋白，不仅适用于C端表位，而且适用于N端表位；4)本方法具有更好的普适性，模板容易获得，且不限于基底材料种类和印迹技术形式，是一种通用性好、应用性强的分子印迹技术。同时，该技术和硼亲和定向表面印迹法比较，也具有显著的不同：1)在本方法中，硼亲和作用仅仅起到锚定目标多肽的作用，并不参与后续的对蛋白质的识别；2)硼亲和定向表面印迹法中硼亲和作用在识别糖蛋白时发挥关键作用，而其它的分子间相互作用处于辅助作用，而在本方法中，存在多种不同的分子间相互作用参与对目标蛋白的识别；3)硼亲和定向表面印迹法仅适用于糖蛋白，而本方法既适用于非糖蛋白也适用于糖蛋白。目前本发明公布的方法尚未有类似文献和专利报道。

有益效果：本发明糖化表位印迹技术可以特异性识别、结合和富集目标蛋白质。印迹模板为糖化多肽表位，而非完整的目标蛋白。与现有蛋白质的印迹技术相比，本发明首次采用蛋白表位糖化处理，突破了表位选取的局限性，而且拓宽了基底材料的种类，针对蛋白表位序列可以采用不同种类和比例的单体硅烷化试剂进行非共价印迹，而印迹层厚度可以通过调节聚合时间实现精准印迹，对目标蛋白的识别仅通过印迹糖化表位即可实现。该技术通用性好，实用性强，所用糖化表位模板方便易得，所制备的印迹材料的分子识别性能优异，在免疫识别、传感和分离等领域具有重要应用潜力。

附图说明

图1为本发明糖化表位印迹技术的原理示意图。

图2分别为β₂-微球蛋白(B2M)的C端表位(a)，肌红蛋白(Mb)的C端表位(b)，癌胚抗原(CEA)N端表位(c)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)的C端表位(d)和N端表位(e)的糖化过程示意图。

图3为不同材料的透射电子显微镜(TEM)表征。其中a为磁纳米粒子；b为硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子；c为B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子；d为非印迹的磁纳米粒子。

图4为磁纳米粒子(a)，硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子(b)，B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子(c)和非印迹的磁纳米粒子(d)的红外光谱图。

图5为硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子对不同分析物的选择性。分析物分别为腺苷和脱氧腺苷(a),B2M的C端糖化表位和B2M的C端表位(b)，B2M,核糖核酸酶A(RNsae A)，核糖核酸酶B(RNase B),辣根过氧化物酶(HRP)和牛血清白蛋白(BSA)(c)。

图6为以B2M的C端糖化表位为印迹模板的分子印迹聚合物的印迹层厚度与聚合时间关系。

图7为不同种类和比例单体硅烷化试剂制备的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子在最优印迹时间下对B2M的C端表位的紫外吸光度和最优印迹因子的影响。

图8为不同种类和比例单体硅烷化试剂制备的CEA的N端糖化表位印迹和非印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片在不同印迹时间下对CEA的N端表位的紫外吸光度和最优印迹因子的影响。(其中单体硅烷化试剂种类和摩尔比例：a为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:10:20:60；b为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝15:15:30:40；c为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:20:30:40)

图9为不同种类和比例单体硅烷化试剂制备的NSE的N端糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子在不同印迹时间下对NSE的N端表位的紫外吸光度和最优印迹因子的影响。(其中单体硅烷化试剂种类和摩尔比例：a为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:10:20:60；b为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:20:20:50；c为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:20:30:40)

图10为制备的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子在蛋白水平的选择性。其中a：空白，b：B2M，c：RNase A(c)，d：BSA，e：RNase B，f：HRP。(i为不同蛋白直接质谱分析；ii为制备的B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子对不同蛋白萃取后质谱分析；iii为非印迹的磁纳米粒子对不同蛋白萃取后质谱分析。)。

图11为制备的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子在肽段水平的选择性。其中a为B2M的C端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物的混合物直接质谱分析；b为制备的B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子对B2M的C端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物的混合物萃取后质谱分析；c为非印迹的磁纳米粒子对B2M的C端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物的混合物萃取后质谱分析。(

B2M的C端表位；

HRP酶解肽段；

BSA酶解肽段)

图12为CEA的N端糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片对目标蛋白CEA的选择性。

图13为制备的NSE的N端糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子在蛋白水平的选择性。其中a：空白，b：NSE，c：RNase A，d：BSA，e：RNase B，f：HRP。(i为不同蛋白直接质谱分析；ii为制备的NSE的N端糖化表位印迹的银纳米粒子对不同蛋白萃取后质谱分析；iii为非印迹的银纳米粒子对不同蛋白萃取后质谱分析)。

图14为制备的NSE的N端糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子在肽段水平的选择性。其中a为NSE的N端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物的混合物直接质谱分析；b为制备的NSE的N端糖化表位印迹的银纳米粒子对NSE的N端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物的混合物萃取后质谱分析；c为非印迹的银纳米粒子对NSE的N端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物的混合物萃取后质谱分析。(

NSE的N端表位；

HRP酶解肽段；

BSA酶解肽段)

图15为制备的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子在实际样品中萃取目标蛋白B2M。其中a为人血清直接质谱分析，b为制备的B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子对人血清萃取后质谱分析；c为非印迹的磁纳米粒子对人血清萃取后质谱分析。

图16为制备的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子在加标实际样品酶解物中萃取B2M的C端表位。a为B2M的C端表位与人血清酶解物的混合物直接质谱分析；b为制备的B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子对B2M的C端表位与人血清酶解物的混合物萃取后质谱分析；c为非印迹的磁纳米粒子对B2M的C端表位与人血清酶解物的混合物萃取后质谱分析。(

B2M的C端表位)

具体实施方式

本发明通过确定目标蛋白的N端或C端的多肽片段作为表位，然后经糖化处理后作为模板，利用硼亲和作用将其锚定于硼酸功能化的基底材料上，再根据表位多肽片段中各种氨基酸残基的性质和数目选择合适的硅烷化试剂进行定向表面印迹，印迹层厚度能通过控制印迹时间进行调节以得到合适的印迹层厚度，所得印迹材料对目标蛋白具有优异的特异性识别能力。该技术不需要目标蛋白质纯品，而且表位多肽片段经糖化处理后，可以满足任意序列的印迹，能够适用于各种各样的目标蛋白质。

本发明的分子印迹方法，具体包括以下几个步骤：

(1)表位序列的确定及糖化

通过蛋白质数据库(如UniProt，Protein Date Bank等)找出目标蛋白的氨基酸序列信息，选择目标蛋白的N端或者C端多肽序列作为表位。为了便于将表位多肽锚定于印迹基底材料，需要将表位多肽进行糖化，连接一个单糖。糖化处理：N端表位糖化的过程为N端多肽起始氨基酸的氨基通过希夫碱反应与果糖结合；C端表位糖化过程为C端多肽末端先连接赖氨酸，然后赖氨酸的残基通过希夫碱反应与果糖结合，最终得到N端或C端的糖化表位模板。

(2)基底材料的选择及硼酸功能化

根据检测方法以及用途的不同，可以选择不同功能和种类的基底材料，其硼酸功能化过程为：将一定量的氨水和原硅酸四乙酯(TEOS)加入到乙醇溶液中，在合适温度下搅拌一段时间后，加入基底材料，持续一段时间后，得到表面包硅的基底材料，然后将其加入到含有一定量的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液中，在合适温度下搅拌一段时间后，得到氨基功能化的基底材料，最后将其加入到含有取代硼酸的醇溶液中，同时加入一定量的氰基硼氢化钠还原，在合适的温度下反应一段时间后，得到硼酸功能化的基底材料。

(3)糖化表位模板在基底材料上的锚定

硼酸功能化的基底材料加入到含有糖化表位模板的缓冲溶液中，调节pH至合适范围，在合适的温度下温育一段时间后，糖化表位锚定于硼酸功能化基底材料表面。

(4)基底材料上的定向表面印迹

糖化表位锚定的基底材料首先加入到一定量水中，然后加入含有一定量氨水与不同种类和比例的单体硅烷化试剂的乙醇溶液中，反应一段时间进行印迹。

(5)糖化表位模板的去除

将印迹后的基底材料加入到一定的洗脱溶液中反应一段时间，糖化表位模板被清除，得到糖化表位印迹的分子印迹材料。

下面是不同基底材料的制备方法。

1、以硼酸功能化的磁纳米粒子作为基底材料时的制备方法如下：

步骤1)，磁纳米粒子制备方法可参见以下方法[Chem.Sci.2013,4,4298-4303；Chem.Eur.J.2006,12,6341-6347]；

步骤2)，将一定量的氨水和TEOS加入到乙醇溶液中，在合适温度下搅拌一段时间，然后加入一定量的磁纳米粒子的乙醇溶液，在合适温度下搅拌一段时间后，得到表面包硅的磁纳米粒子；

步骤3)，将步骤2)得到的表面包硅的磁纳米粒子分散在乙醇溶液中，然后加入一定量的APTES，在合适温度下搅拌一段时间后，得到氨基功能化的磁纳米粒子；

步骤4)，将步骤3)得到的氨基功能化的磁纳米粒子分散于含取代硼酸的甲醇溶液中，并加入一定量的氰基硼氢化钠还原，在合适的温度下反应一段时间后，得到硼酸功能化的磁纳米粒子；

步骤5)，将步骤4)得到的硼酸功能化的磁纳米粒子分散于含有糖化表位模板的缓冲溶液中，调节pH至合适范围，然后在合适的温度下温育一段时间后，糖化表位锚定于磁纳米粒子表面；

步骤6)，将步骤5)得到的糖化表位锚定的磁纳米粒子分散于水中，然后加入含有一定量氨水和不同种类和比例的单体硅烷化试剂的乙醇溶液中，反应一段时间后磁分离，再经过洗脱溶液移除模板，得到糖化表位印迹的磁纳米粒子。

非印迹的磁纳米粒子的制备方法除了没有添加糖化表位模板外，其他所有步骤相同。

本发明制备方法中，步骤4)中所用的取代硼酸根据磁性材料修饰的表面活性官能团不同而不同，包括但不限于2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸(DFFPBA)、醛基苯硼酸(FPBA)、氨基苯硼酸、羧基苯硼酸、巯基苯硼酸和烯基苯硼酸等。

步骤6)中所用的单体硅烷化试剂根据表位序列的氨基酸种类进行选择，包括但不限于APTES、脲丙基三乙氧基硅烷(UPTES)、异丁基三乙氧基硅烷(IBTES)、TEOS等。

2、以硼酸功能化的单层金纳米粒子自组装的玻璃片作为基底材料时的制备方法如下：

步骤1)，金纳米粒子制备可参见以下方法[J.Nanosci.Nanotechnol.2011,11,1141-1146]；

步骤2)，将玻璃片用食人鱼溶液浸泡并洗净后，放入含一定浓度APTES的乙醇溶液中，在合适的温度下反应一段时间后，得到氨基功能化的玻璃片；

步骤3)，将步骤2)得到的氨基功能化的玻璃片浸泡在步骤1)所得的金纳米粒子溶液中，在合适的温度下反应一段时间后，得到单层金纳米粒子自组装玻璃片；

步骤4)，将步骤3)得到的单层金纳米粒子自组装玻璃片放入含一定浓度APTES的乙醇溶液中，在合适的温度下反应一段时间后，得到氨基功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片；

步骤5)将步骤4)得到的氨基功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片放置在含取代硼酸的乙醇溶液中，并加入一定量的氰基硼氢化钠还原，在合适的温度下反应一段时间后，得到硼酸功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片；

步骤6)，将步骤5)得到的硼酸功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片放置在含有糖化表位模板的缓冲溶液中，调节pH至合适范围，然后在合适的温度下温育一段时间后，糖化表位锚定于单层金纳米粒子自组装玻璃片表面；

步骤7)，将步骤6)得到的糖化表位锚定的单层金纳米粒子自组装玻璃片放置于水中，然后加入含有一定量氨水和不同种类和比例的单体硅烷化试剂的乙醇溶液中，反应一段时间后清洗，再用洗脱溶液移除模板，得到糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片。

非印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的制备方法除了没有添加糖化表位模板外，其他所有步骤相同。

本发明制备方法中，步骤5)中所用的取代硼酸根据单层金纳米粒子自组装玻璃片修饰的表面活性官能团不同而不同，包括但不限于DFFPBA、FPBA、氨基苯硼酸、羧基苯硼酸、巯基苯硼酸和烯基苯硼酸等。

步骤7)中所用的单体硅烷化试剂根据表位序列的氨基酸种类进行选择，包括但不限于APTES、UPTES、IBTES、TEOS等。

3、以硼酸功能化的银纳米粒子作为基底材料时的制备方法如下：

步骤1)，银纳米粒子制备可参见以下方法[Angew.Chem.2016,55,13215-13218]；

步骤2)，将银纳米粒子溶液加入到含一定量的氨水的乙醇溶液中，在合适温度下搅拌一段时间，然后加入一定量的TEOS乙醇溶液，在合适温度下搅拌一段时间后，得到表面包硅的银纳米粒子；

步骤3)，将步骤2)得到的表面包硅的银纳米粒子分散在乙醇溶液中，然后加入一定量的APTES，在合适温度下搅拌一段时间后，得到氨基功能化的银纳米粒子；

步骤4)，将步骤3)得到的氨基功能化的银纳米粒子分散于含取代硼酸的乙醇溶液中，并加入一定量的氰基硼氢化钠还原，在合适的温度下反应一段时间后，得到硼酸功能化的银纳米粒子；

步骤5)，将步骤4)得到的硼酸功能化的银纳米粒子分散于含有糖化表位模板的缓冲溶液中，调节pH至合适范围，然后在合适的温度下温育一段时间后，糖化表位锚定于银纳米粒子表面；

步骤6)，将步骤5)得到的糖化表位锚定的银纳米粒子分散于水中，然后加入含有一定量氨水和不同种类和比例的单体硅烷化试剂的乙醇溶液中，反应一段时间后离心分离，再用洗脱溶液移除模板，得到糖化表位印迹的银纳米粒子。

非印迹的银纳米粒子的制备方法除了没有添加糖化表位模板外，其他所有步骤相同。

本发明制备方法中，步骤4)中所用的取代硼酸根据银纳米粒子修饰的表面活性官能团不同而不同，包括但不限于DFFPBA、FPBA、氨基苯硼酸、羧基苯硼酸、巯基苯硼酸和烯基苯硼酸等。

步骤6)中所用的单体硅烷化试剂根据表位序列的氨基酸种类进行选择，包括但不限于APTES、UPTES、IBTES、TEOS等。

下面通过具体的实施例来进一步阐述本发明。

实施例1：糖化表位的制备

通过蛋白质数据库(如UniProt，Protein Date Bank等)确定目标蛋白的氨基酸序列信息。以B2M为例，选择其C端多肽KIVKWDRDM作为表位序列，通过固相合成直接合成在多肽末端连接有赖氨酸(K)的多肽序列KIVKWDRDMK，然后在连接的K残基上通过希夫碱反应与果糖(Fru)结合，得到果糖化的表位多肽KIVKWDRDMK-Fru。以Mb为例，选择其C端多肽NYKELGFQG作为表位序列，通过固相合成直接合成在多肽末端连接有K的多肽序列NYKELGFQGK，然后在连接的K残基上通过希夫碱反应与Fru结合，得到果糖化的表位多肽NYKELGFQGK-Fru。以CEA为例，选择其N端多肽KLTIESTPF作为表位序列，通过固相合成直接合成多肽KLTIESTPF，然后在其起始氨基酸K的氨基上通过希夫碱反应与Fru结合，得到果糖化的表位多肽Fru-KLTIESTPF。以NSE为例，选择其C端多肽HNFRNPSVL作为表位序列，通过固相合成直接合成在多肽末端连接有K的多肽序列HNFRNPSVLK，然后在连接的K的残基上通过希夫碱反应与Fru结合，得到果糖化的表位多肽HNFRNPSVLK-Fru；选择其N端多肽MSIEKIWAR作为表位序列，通过固相合成直接合成多肽MSIEKIWAR，然后在其起始氨基酸M的氨基上通过希夫碱反应与Fru结合，得到果糖化的表位多肽Fru-MSIEKIWAR。如图2所示，分别为B2M的C端表位(a)，Mb的C端表位(b)，CEA的N端表位(c)，NSE的C端表位(d)和N端表位(e)糖化过程示意图。

下面的实施例中所采用的糖化表位可以是本实施例中提及到的糖化表位，也可以是采用实施例中描述的设计和制备方法得到的其他糖化表位。

实施例2：TEM表征糖化表位印迹的磁纳米粒子

B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子用TEM表征其形貌和粒径，结果如图3所示，糖化表位印迹的磁纳米粒子形貌规则，粒径均一，尺寸大约为150nm。

实施例3：红外表征糖化表位印迹的磁纳米粒子

红外光谱表征了B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子和非印迹的磁纳米粒子，结果如图4所示，在580cm^-1处有一个很强的吸收峰，为Fe-O伸缩振动。在1630cm^-1，1380cm^-1和1048cm^-1有三处明显的吸收峰，分别为N-H弯曲振动，C-H弯曲振动和C-N伸缩振动，而且三个吸收峰逐渐增强，表明磁纳米粒子成功修饰上氨基基团。在3400cm^-1，2940cm^-1和1650cm^-1有三个吸收峰，分别为Si-O弯曲振动，C-H伸缩振动和C＝O伸缩振动；830-1110cm^-1和1100-1250cm^-1分别为Si-O和C-F的伸缩振动，与C-N伸缩振动重叠；其中3400cm^-1,2940cm^-1,1650cm^-1和830-1250cm^-1的吸收峰逐渐增强，表明磁纳米粒子成功修饰上硼酸基团和不同单体硅烷化试剂。

实施例4：硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子的选择性表征

分别将1.0mg/mL的腺苷和脱氧腺苷溶解到200μL含有NaCl(500mM)的碳酸氢氨缓冲溶液(50mM，pH 8.5)中，然后分别加入2.0mg硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子，并在25℃下孵育2小时。磁分离硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子后分别用200μL含有NaCl(500mM)的碳酸氢氨缓冲溶液(50mM，pH 8.5)和碳酸氢氨缓冲溶液(50mM，pH 8.5)清洗3次，然后重新分散至20μL的100mM醋酸溶液中，振摇1小时。磁分离硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子后得到洗脱液。通过在260nm处紫外测定洗脱液，得到硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子对腺苷和脱氧腺苷的吸光度，如图5a所示,表明硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子对含有顺式二羟基的腺苷具有优异的选择性，而对不含顺式二羟基的脱氧腺苷表现为不结合。为了进一步证明硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子的选择性，将B2M的C端表位，B2M的C端糖化表位，RNase A，RNase B，HRP和BSA作为分析物，其实验过程与上面步骤相同，除了洗脱液改为在214nm处测定紫外吸光度，其结果如图5b，5c所示,硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子对含顺式二羟基化合物(B2M的C端糖化表位，RNase B和HRP)表现出优异的选择性。

实施例5：印迹层厚度表征

糖化表位印迹的磁纳米粒子的印迹层厚度很难直接用TEM测定，因此采用银纳米粒子表征印迹层厚度。

36g的硝酸银溶解到200mL的水中并加热煮沸，然后加入4mL的柠檬酸三钠(1％，w/v)，持续煮沸1小时，然后自然冷却至25℃，得到的银纳米粒子溶液在4℃下保存。

将上述10mL的银纳米粒子溶液加入到150mL含有4.5mL氨水(28％，w/v)的无水乙醇中，搅拌5分钟。然后加入40mL含有单体硅烷化试剂(种类和摩尔比例为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:10:20:60)的无水乙醇中，25℃反应70分钟，其中每10分钟取出1mL混悬液进行离心，得到包覆硅层的银纳米粒子用无水乙醇清洗3次，最后用TEM测定其硅层厚度。如图6所示，通过测定硅层厚度与聚合时间关系，表明印迹层的厚度随着聚合时间的增加呈线性增加。

实施例6：糖化表位印迹的磁纳米粒子的制备

该实施例包括以下三步：

步骤1)，磁纳米粒子的制备

将2.0g的六水合三氯化铁，13.0g的1,6-己二胺和4.0g的无水醋酸钠加入到60mL的乙二醇中，混匀后放入内衬聚四氟乙烯的反应釜中，在198℃下反应6小时后，得到磁纳米粒子分别用水和乙醇清洗3次，最后过夜干燥。

步骤2)，包覆二氧化硅的磁纳米粒子的硼酸功能化

7.5mL的氨水(28％，w/v)和1.4mL的TEOS加入到200mL的无水乙醇中，在40℃下搅拌20分钟。将200mg的磁纳米粒子超声分散到20mL的无水乙醇中，然后加入到上述溶液中，在40℃下搅拌20分钟后，磁分离得到二氧化硅包覆的磁纳米粒子，分别用水和无水乙醇清洗3次，最后过夜干燥。

制备得到的二氧化硅包覆的磁纳米粒子超声分散到100mL的无水乙醇中，然后加入3mL的APTES，在80℃下搅拌12小时。磁分离得到氨基功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子，分别用水和无水乙醇清洗3次，最后过夜干燥。

200mg的氨基功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子超声分散到80mL的甲醇中，然后加入400mg的DFFPBA和1％(w/w)的氰基硼氢化钠，在25℃下搅拌24小时。磁分离得到硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子，分别用水和无水乙醇清洗3次，最后过夜干燥。

步骤3)，糖化表位印迹的磁纳米粒子的制备

2.0mg的糖化表位加入到含有NaCl(500mM)的碳酸氢氨缓冲溶液(50mM，pH8.5)中，然后加入20mg硼酸功能化的二氧化硅包覆的磁纳米粒子并超声分散。在25℃下温育2小时后，磁分离得到糖化表位锚定的磁纳米粒子，并用碳酸氢氨缓冲溶液(50mM，pH8.5)清洗3次。

得到的糖化表位锚定的磁纳米粒子超声分散在10mL的水中，然后加入150mL含有4.5mL氨水(28％，w/v)的无水乙醇中，搅拌5分钟。将40mL含有不同种类和比例单体硅烷化试剂的乙醇溶液加入上述溶液中，在25℃搅拌一段时间。磁分离得到糖化表位印迹的磁纳米粒子，无水乙醇清洗3次，最后过夜干燥。其中单体硅烷化试剂的种类和比例以及印迹时间根据选择的表位序列进行优化选择。

得到的糖化表位印迹的磁纳米粒子分散到2mL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，在25℃振摇20分钟，上述操作重复3次。移除糖化表位模板后，得到的糖化表位印迹的磁纳米粒子分别用水和乙醇清洗3次，最后过夜干燥。非印迹的磁纳米粒子的制备方法除了没有加入糖化表位模板外，其他所有步骤相同。

实施例7：糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的制备

该实施例包括以下三步：

步骤1)，金纳米粒子的制备

将0.5mL的HAuCl₄(1％，w/v)加入到50mL水中，在油浴中加热至沸腾后迅速加入0.424mL的柠檬酸钠溶液(34mM)。当溶液的颜色由无色变为紫色时开始计时，继续回流15分钟，然后在25℃下搅拌降温，溶液此时呈浅紫红色，最后溶液放在4℃下保存。

步骤2)，硼酸功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片的制备

将玻璃片切割成25mm×10mm的小玻璃片，然后在其表面划出直径为4mm的4个小圆圈，再用食人鱼溶液(V_H2SO4:V_H2O2＝7:3)在25℃下浸泡60分钟后，分别用蒸馏水和乙醇清洗3次，在50℃的烘箱中烘干。然后将玻璃片放入含有4％(v/v)APTES的乙醇溶液中，在25℃下浸泡9-12h后，分别用乙醇和水清洗3次，在50℃的烘箱中烘干，得到氨基功能化的玻璃片。

将氨基功能化的玻璃片放入步骤1)中所得的金纳米粒子溶液中，在25℃下反应12小时，用蒸馏水清洗3次后，在25℃下晾干。然后制备得到的单层金纳米粒子自组装玻璃片在4％(v/v)APTES的乙醇溶液中浸泡2小时后，乙醇清洗3次，在25℃下晾干，得到氨基功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片。

将该玻璃片放入含有5.0mg/mL FPBA和5.0mg/mL氰基硼氢化钠的乙醇溶液中，在25℃下振荡24小时，然后分别用无水乙醇和水清洗3次，得到硼酸功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片。

步骤3)，糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的制备

将5μL含有1.0mg/mL糖化表位的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.4)滴入硼酸功能化的单层金纳米粒子自组装玻璃片的小圆圈上，在25℃并保持一定湿度环境下反应2小时，期间每隔20分钟补充一次磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.4)。得到的糖化表位锚定的单层金纳米粒子自组装玻璃片用磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.4)清洗3次。

将得到的糖化表位锚定的单层金纳米粒子自组装玻璃片置于0.2mL的水中，然后加入3mL含有0.09mL氨水(28％，w/v)的乙醇溶液，再加入0.8mL不同种类和比例单体硅烷化试剂的乙醇溶液，在25℃下反应一段时间后，分别用乙醇和水清洗3次，得到糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片。其中单体硅烷化试剂的种类和比例以及印迹时间根据选择的表位序列进行优化选择。

将得到的糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片置于4mL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，在25℃下振摇20分钟，上述操作重复3次。移除糖化表位模板后，用乙醇和水清洗3次，得到糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片。非印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的制备方法除了没有加入糖化表位模板外，其他所有步骤相同。

实施例8：糖化表位印迹的银纳米粒子的制备

该实施例包括以下三步：

步骤1)，银纳米粒子的制备

将36mg的硝酸银溶于200mL水中，将溶液在油浴(115-135℃)中加热至沸腾，开始回流时迅速加入1％(w/v)的柠檬酸钠进行还原，继续煮沸40-50分钟，然后冷却至25℃，得到银纳米粒子。

步骤2)，包覆二氧化硅的银纳米粒子的硼酸功能化

将0.7mL的氨水(28％，w/v)和10mL的银纳米粒子溶液加入到40mL的乙醇溶液中，在25℃下搅拌5分钟。将10mL的TEOS(10mM)乙醇溶液加入到上述溶液中，在25℃搅拌50分钟，离心(8000rmp，10分钟)分离后，得到二氧化硅包覆的银纳米粒子，用乙醇清洗3次，并分散于10mL乙醇中，然后加入100μL的APTES，在25℃下搅拌1小时后，离心分离得到氨基功能化的二氧化硅包覆的银纳米粒子，用乙醇清洗3次，并分散于30mL乙醇中后，加入5.0mg/mL的FPBA和5.0mg/mL的氰基硼氢化钠乙醇溶液各300μL，在25℃下搅拌24小时。离心分离后，分别用乙醇和水清洗3次，得到硼酸功能化的二氧化硅包覆的银纳米粒子。

步骤3)，糖化表位印迹的银纳米粒子的制备

将硼酸功能化的二氧化硅包覆的银纳米粒子加入到1.0mg/mL的糖化表位的磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH7.4)中，超声分散后，在25℃下温育2小时，离心分离得到糖化表位锚定的银纳米粒子，并用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH7.4)清洗3次。

将得到的糖化表位锚定的银纳米粒子超声分散在1mL水中，然后加入15mL含有0.45mL氨水(28％，w/v)的乙醇溶液，并搅拌5分钟，再加入4mL含有不同种类和比例单体硅烷化试剂的乙醇溶液，在25℃下振摇一段时间。离心分离后，并分别用乙醇和水清洗3次，得到糖化表位印迹的银纳米粒子。其中单体硅烷化试剂的种类和比例以及印迹时间根据选择的表位序列进行优化选择。

得到的糖化表位印迹的银纳米粒子分散到10mL乙腈:水:醋酸溶液(50:49:1)中，在25℃下振摇20分钟，将上述操作重复3次。移除糖化表位模板后，离心分离，并用乙醇和水清洗3次，得到糖化表位印迹的银纳米粒子。非印迹的银纳米粒子的制备方法除了没有加入糖化表位模板外，其他所有步骤相同。

实施例9：糖化表位印迹的磁纳米粒子的单体选择与印迹时间的优化

糖化表位印迹的磁纳米粒子的单体选择与印迹时间根据印迹因子进行优化。

分别将2.0mg不同种类和比例单体硅烷化试剂在不同印迹时间下制备得到的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子加入到200μL含有B2M的C端表位(1.0mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中，在25℃下温育20分钟，分别磁分离糖化表位印迹和和非印迹的磁纳米粒子，用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次后，重新分散到20μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，振摇10分钟，磁分离得到洗脱液。

通过紫外测定洗脱液得到B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子对B2M的C端表位的吸光度，计算它们的比值为印迹因子(IF值)。结果如图7所示，制备B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子时，在单体硅烷化试剂的种类和摩尔比例为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:10:20:60，印迹时间60分钟时获得最优印迹因子，IF值为5.8。

实施例10：糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的单体选择与印迹时间的优化

糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的单体选择与印迹时间根据印迹因子进行优化。

将5μL CEA的N端糖化表位(1.0mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液(10mM,pH7.4)分别滴于不同种类和比例单体硅烷化试剂在不同印迹时间下制备得到的CEA的N端糖化表位印迹和非印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的4个小圆圈上，在25℃并保持一定湿度环境下温育20分钟后，用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)分别清洗3次，最后用5μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)解吸10分钟，收集得到洗脱液后，冻干再重新溶解于5μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)。

通过紫外测定上述溶解液，得到CEA的N端糖化表位印迹和非印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片对CEA的N端表位的吸光度，计算它们的比值为印迹因子(IF值)。结果如图8所示，CEA的N端糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片在单体硅烷化试剂的种类和摩尔比例为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝15:15:30:40，印迹时间50分钟时获得最优印迹因子，IF值为4.8。

实施例11：糖化表位印迹的银纳米粒子的单体选择与印迹时间的优化

糖化表位印迹的银纳米粒子的单体选择与印迹时间根据印迹因子进行优化。

将2.0mg NSE的N端表位溶于20mL磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中，然后加入不同种类和比例单体硅烷化试剂在不同印迹时间下制备得到的NSE的N端糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子，在25℃下温育20分钟，离心分离糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子，用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)分别清洗3次后，重新分散到1mL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，振摇10分钟，离心分离得到洗脱液后，冻干再重新溶解于10μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)。

通过紫外测定上述溶解液，得到NSE的N端糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子对NSE的N端表位的吸光度，计算它们的比值为印迹因子(IF值)。结果如图9所示，NSE的N端糖化表位印迹的银纳米粒子在单体硅烷化试剂的种类和摩尔比例为APTES/UPTES/IBTES/TEOS＝10:20:20:50，印迹时间50分钟时获得最优印迹因子，IF值为4.9。

实施例12：糖化表位印迹的磁纳米粒子的选择性

步骤1)，在蛋白水平

分别将B2M，RNsae A，RNase B，HRP和BSA溶解到磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中制备成1.0mg/mL的蛋白溶液。将2.0mg的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子分别加入到200μL的蛋白溶液中，在25℃下温育20分钟。磁分离糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒后用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次，重新分散至20μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)，振摇10分钟后，磁分离得到洗脱液。

通过MALDI-TOF MS分析测定洗脱液，结果如图10所示，制备的B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子对目标蛋白B2M具有良好的选择性。

步骤2)，在肽段水平

将相同摩尔浓度的B2M的C端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物加入到磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中。然后分别将2.0mg的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子加入到200μL的上述混合酶解溶液中，在25℃下温育20分钟。磁分离糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子后用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次，重新分散至20μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，振摇10分钟后，磁分离得到洗脱液。

通过MALDI-TOF MS分析测定洗脱液，结果如图11所示，制备的B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子对B2M的C端表位表现出了优异的选择性。

实施例13：糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的选择性

分别将CEA，HRP，转铁蛋白(TRF)，RNase B，BSA和β-酪蛋白(β-Casein)溶解到磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中制备成1.0mg/mL的蛋白溶液。取5μL蛋白溶液分别滴于CEA的N端糖化表位印迹和非印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片的4个小圆圈上，在25℃下温育20分钟。然后用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次，用5μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)解吸10分钟，收集得到洗脱液，最后冻干后重新溶解于5μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)。

通过紫外测定上述溶解液得到不同蛋白的吸光度，如图12所示，制备的CEA的N端糖化表位印迹的单层金纳米粒子自组装玻璃片对目标蛋白CEA表现出了优异的选择性。

实施例14：糖化表位印迹的银纳米粒子的选择性

步骤1)，在蛋白水平

分别将NSE，RNsae A，RNase B，HRP和BSA溶解到磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中制备成0.1mg/mL的蛋白溶液，然后加入NSE的N端糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子，在25℃下温育20分钟。离心分离糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒后，用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次，离心后重新分散到1mL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，振摇10分钟，离心分离得到洗脱液。冻干后重新溶解于10μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)。

通过MALDI-TOF MS分析测定上述溶解液，结果如图13所示，制备的NSE的N端糖化表位印迹的银纳米粒子对目标蛋白NSE具有良好的选择性。

步骤2)，在肽段水平

将相同摩尔浓度的NSE的N端表位与HRP和BSA两种蛋白酶解物加入到磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中。然后分别将NSE的N端糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒子加入到20mL的上述混合酶解溶液中，在25℃下温育20分钟。离心分离糖化表位印迹和非印迹的银纳米粒后，用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次，离心后重新分散到1mL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，振摇10分钟，离心分离得到洗脱液。冻干后重新溶解于10μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)。

通过MALDI-TOF MS分析测定上述溶解液，结果如图14所示，制备的NSE的N端糖化表位印迹的银纳米粒子对NSE的N端表位表现出了优异的选择性。

实施例15：糖化表位印迹聚合物在实际样品中应用

步骤1)，在人血清中萃取目标蛋白

将人血清用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)稀释20倍，分别将2.0mg的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子加入到200μL的稀释人血清溶液中，在25℃下温育20分钟。磁分离糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子后用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次，重新分散至20μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)中，振摇10分钟。磁分离后得到洗脱液。

通过MALDI-TOF MS分析测定洗脱液，结果如图15所示，只有目标蛋白B2M被B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子萃取。

步骤2)，在人血清加标酶解物中萃取目标表位序列

将人血清用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)稀释20倍，然后将其酶解后加入0.1mMB2M表位序列作为加标酶解溶液。分别将2.0mg的B2M的C端糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子加入到200μL的上述加标酶解溶液中，在25℃下温育20分钟。磁分离糖化表位印迹和非印迹的磁纳米粒子后用磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)清洗3次，重新分散至20μL的乙腈：水：醋酸溶液(v/v，50：49：1)，振摇10分钟。磁分离后得到洗脱液。

通过MALDI-TOF MS分析测定洗脱液，结果如图16所示，只有目标序列B2M的C端表位被B2M的C端糖化表位印迹的磁纳米粒子萃取。

Claims (9)

1.一种通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，选择目标蛋白的末端多肽作为特征表位，经过糖化处理后得到的糖化多肽作为印迹模板，印迹模板通过硼亲和作用被锚定于硼酸功能化的基底材料，然后根据表位序列的氨基酸种类选择不同种类和比例的单体硅烷化试剂进行非共价印迹，印迹层厚度通过调节印迹时间实现精准印迹，得到分子印迹聚合物。

2.根据权利要求1所述的通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，所述特征表位的确定：找出目标蛋白的氨基酸序列信息，选择目标蛋白的N端或C端多肽序列作为表位。

3.根据权利要求1或2所述的通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，所述目标蛋白的末端多肽选择包含9个氨基酸残基数目的多肽片段。

4.根据权利要求2所述的通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，糖化处理的方法为：糖化C端表位，通过其表位的末端先连接赖氨酸，然后赖氨酸的残基通过希夫碱反应与单糖进行糖化；糖化N端表位利用其起始氨基酸的氨基通过希夫碱反应与单糖进行糖化。

5.根据权利要求4所述的通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，所述糖化表位序列中结合的单糖选择为果糖。

6.根据权利要求1所述的通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，所述硼酸功能化基底材料，包括磁性纳米材料、单层金纳米粒子自组装玻璃片和银纳米材料。

7.根据权利要求6所述的通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，所述硼酸功能化过程中所用取代硼酸，包括2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸、醛基苯硼酸、氨基苯硼酸、羧基苯硼酸、巯基苯硼酸和烯基苯硼酸。

8.根据权利要求1所述的通用便捷的表位印迹方法，其特征在于，所述单体硅烷化试剂，包括氨丙基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷和原硅酸四乙酯。

9.根据权利要求1所述的通用便捷的表位印迹方法制得的印迹聚合物在亲和分离、纯化和富集，靶向识别，生物传感和生物医学中的应用。

Images