CN104820100A - 基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法与应用 - Google Patents
基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为模板分子，再利用硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，随后利用硅烷化试剂进行缩聚反应形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹的凝集素模拟物。该凝集素模拟物制备简单，成本低廉，性质稳定，并且所识别的目标物更容易释放。具有良好的专一性、亲和力，且抗干扰能力强。不仅能识别完整糖蛋白，而且能识别糖蛋白的特征片段-糖肽和聚糖。在用于复杂生物样品时仍能保持其专一识别能力。该材料在糖蛋白组学、代谢组学、糖生物学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面有着良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子印迹功能化材料领域，具体说是一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备以及其在复杂样品中对糖蛋白及其特征片段的专一性识别与分离，以及其在蛋白质组学、代谢组学、糖生物学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面的应用。
背景技术
抗体是能专一识别特定分子(抗原)的一类蛋白质分子，在生物化学、生物医学和临床诊断等领域具有重要应用。抗体通常只能识别完整的抗原分子，而当抗原分子发生酶解或降解后，抗体通常无法识别抗原破碎后产生的片段。因此，对于生物体内或生物样品中不稳定的重要生物分子，如糖蛋白等，对其本身和其特征片段的专一识别具有重要意义。
凝集素是可以特异性识别含有特定糖或糖基的生物分子(如糖蛋白、糖肽和聚糖等)的一类蛋白质。凝集素不仅可以识别完整糖蛋白而且能识别由糖蛋白酶解得到的糖肽及糖链片段或是其他含有糖基的部分。因此，凝集素可以通过识别不稳的糖基化分子的特征片段来监测其在生物体内的代谢过程。目前凝集素被广泛的应用于蛋白质组学、糖组学以及疾病诊断等领域中。然而，天然的凝集素具有一些明显缺陷，如难于制备，稳定性差以及难于释放已结合的目标物等。因此，发展出具有类似于凝集素识别特性的仿生材料具有重要的科学意义和实际应用价值。
硼亲和作用是选择性识别顺式二羟基类化合物的一类独特方法，在仿生识别中具有重要作用[J.Yan,H.Fang,B.H.Wang,Med.Res.Rev.《医学研究评论》2005,25,490-520；A.Pal,M.Bérubé,D.G.Hall,Angew.Chem.Int.Ed.《德国应用化学》2010,49,1492-1495]。其原理是，在较高的pH条件下，硼酸配基能和顺式二羟基化合物中的邻二羟基共价结合，形成共价复合物；而在酸性条件下，共价复合物解离，从而释放出顺二羟基分子。单纯的硼亲和材料不能特异性地识别特定的顺式二羟基分子，但是，取代硼酸配基已经作为重要的亲和配基在仿生亲和材料的制备中发挥重要作用[Y.C.Liu,Y.Lu,Z.Liu,Chem.Sci.《化学科学》2012,3,1467-1471；Y.Lu,Z.J.Bie,Y.C.Liu,Z.Liu,Analyst《分析师》2013,138,290-298]。尤其是，将硼亲和作用与材料的纳米空腔的选择性相结合，多种专一识别糖蛋白的分子印迹聚合物已经广泛报道[L.Li,Y.Lu,Z.J.Bie,H.Y.Chen,Z.Liu,Angew.Chem.Int.Ed.《德国应用化学》2013,52,7451-7454；Z.Lin,L.X.Sun,W.Liu,Z.W.Xia,H.H.Yang G.N.Chen,J.Mater.Chem.B《材料化学B》2014,2,637-643；Y.X.Li,M.Hong,M.Miao,Q.Bin,Z.Y.Lin,Z.W.Cai G.N.Chen,J.Mater.Chem.B《材料化学B》,2013,1,1044-1051]。然后，这些分子印迹聚合物只能识别完整的糖蛋白，无法识别糖蛋白分子上的特征片段。
分子印迹技术[G.Wulff,A.Sarhan,Angew.Chem.Int.Ed.《德国应用化学》1972,11,341-345；G.Vlatakis,L.I.Andersson,R.Müller,K.Mosbach,Nature《自然》1993,361,645-647]是先将模板分子与功能单体按一定比例形成配合物，再加入交联剂形成聚合物从而将模板分子固定并包裹在聚合物中，然后采用合适的方法将模板分子去除，从而在聚合物中留下形状与模板分子互补的空腔及选择性的结合位点。尽管已有诸多文献报道了以单糖为模板的分子印迹材料[G.Wulff,R.Grobe-Einsler,W.Vesper,A.Sarhan,Makromol.Chem.《大分子化学》1977,178,2817-2825；Z.L.Cheng,E.K.Wang,X.R.Yang,Biosens.Bioelectron.《生物传感与生物电子》2001,16,179-185W.J.Wizeman,P.Kofinas,Biomaterials《生物材料》2001,22,1485-1491]，但是，具有凝集素分子识别特性，即既能专一识别完整糖蛋白又能专一识别糖蛋白的特征片段的分子印迹材料从未见报道。此外，以糖链为模板的分子印迹聚合物目前尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法及该凝集素模拟物的应用；它是利用分子印迹技术制备具有类似凝集素分子识别特性的功能化材料。
本方法以糖链为模板，利用硼亲和分子印迹为技术基础，所得材料不仅可以识别完整糖蛋白，同时还可以识别糖蛋白特征片段(糖链和糖肽)。该材料具有良好的专一性和亲和力，且抗干扰能力强，用于复杂生物样品时，也表现出同时识别完整糖蛋白以及其特征片段的能力。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，该方法是先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，再利用硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化的基体材料表面，再利用硅烷化试剂在合适条件下的缩聚反应形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹的凝集素模拟物。
所述糖链可以是任意糖蛋白上的不同结构的糖链，这些不同糖型的糖链体现在实施例1和4中。所述糖链包括核糖核酸酶B，或者转铁蛋白；或者其他糖蛋白。
所述基体材料是指取代硼酸功能化基体材料，是硼酸功能化的磁性纳米颗粒、或者磁性微球、或者其他纳米材料和玻璃片或其他表面材料等。
所述模板分子通过与硼酸配基间的硼亲和作用而被固定于硼酸功能化基体材料表面。
所述取代硼酸是含有羟基、醛基、羧基、巯基、不饱和键或氨基等活性基团的苯硼酸或杂环硼酸。
所述硅烷化试剂是由正硅酸乙酯或其他取代正硅酸酯，所述硅烷化试剂的浓度为1至50mM。
所述印迹层的厚度通过控制反应条件(如反应时间、硅烷化试剂的浓度)进行控制精确控制(通常控制在糖链模板分子长度的三分之一至三分之二)。反应时间一般为40到90分钟。此项操作体现在实施例3和4中。
所述酸性条件是酸性溶液，包括但不限于0.1M的醋酸溶液。
利用上述步骤可以制备得到基于分子印迹技术的凝集素模拟物。
上述凝集素模拟物具有类似凝集素的分子识别特性，不仅能识别特定完整糖蛋白，同时还能识别该糖蛋白的特征片段-聚糖和糖肽。但与天然凝集素相比，该分子印迹材料容易制备，价格低廉，性质稳定，而且所识别的目标物更容易释放。该技术制备的凝集素模拟物专一性好、抗干扰能力强。
上述凝集素模拟物在糖蛋白及其特征片段的专一识别、富集、纯化、分离和检测方面的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明首次提出了基于糖链的硼亲和定向表面印迹技术，成功制备了用于模拟凝集素的分子印迹材料。与天然凝集素相比，该材料制备简单，成本低廉，性质稳定，并且所识别的目标物更容易释放。该技术与所得凝集素模拟物目前尚未有类似文献和专利报道。该技术所制备的凝集素模拟物专一性识别能力好，抗干扰能力强，不仅能识别完整糖蛋白，而且能识别糖蛋白特征片段，用于复杂生物样品时，仍能保持其原先优异的识别能力。这种独特的分子识别特性使得该凝集素模拟物在糖蛋白组学、代谢组学、糖组学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面有着广泛的应用前景。
附图说明
图1为基于分子印迹技术的凝集素模拟物制备方法的原理图，其中a)为模板糖链的获得，b)为以糖链为模板的定向表面印迹。
图2为正硅酸乙酯水解所形成的二氧化硅层厚度与时间的关系，插图为代表性的测量二氧化硅层厚度的透射电子显微镜照片。
图3为核糖核酸酶B糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对不同蛋白的结合能力的比较。
图4为转铁蛋白糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对不同蛋白的结合能力的比较。
图5为核糖核酸酶B糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对不同糖蛋白的糖肽结合，其中a)图为直接检测核糖核酸酶B和辣根过氧化物酶的胰蛋白酶解混合物的基质辅助激光解析与电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)图；b)图为检测核糖核酸酶B糖链的印迹材料萃取酶解混合物后的MALDI-TOF MS图；c)图为检测相应的非印迹材料萃取酶解混合物后的MALDI-TOF MS图。注：心形表示核糖核酸酶B的糖链；梅花表示辣根过氧化物酶的糖链。
图6为转铁蛋白糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对不同糖蛋白的糖肽结合，其中a)图为直接检测转铁蛋白，核糖核酸酶B和辣根过氧化物酶的胰蛋白酶解混合物的基质辅助激光解析与电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)图；b)图为检测转铁蛋白糖链的印迹材料萃取酶解混合物后的MALDI-TOF MS图；c)图为检测相应的非印迹材料萃取酶解混合物后的MALDI-TOF MS图。注：心形表示核糖核酸酶B的糖链；梅花表示辣根过氧化物酶的糖链；方块表示转铁蛋白的糖链。
图7为高浓度甘露糖对糖核酸酶B糖链的印迹材料结合糖核酸酶B的干扰，其中左边表示材料结合糖核酸酶B时不加入甘露糖，右边表示材料结合糖核酸酶B时加入甘露糖。
图8为高浓度甘露糖对结合了糖核酸酶B的核酸酶B糖链的印迹材料的顶替，其中A表示核酸酶B糖链的印迹材料结合了核糖核酸酶B后直接用100mM醋酸溶液解析，B表示核酸酶B糖链的印迹材料结合了核糖核酸酶B后用高浓度甘露糖解析，C表示核酸酶B糖链的印迹材料结合了核糖核酸酶B后，用高浓度甘露糖解析后，用100mM醋酸溶液解析。
图9为核糖核酸酶B糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对血清中加入的核糖核酸酶B的结合，其中a为直接检测核糖核酸酶B添加的血清的MALDI-TOF MS图，b为检测核糖核酸酶B糖链的印迹材料萃取混合物后的MALDI-TOF MS图；c为检测相应的非印迹材料萃取混合物后的MALDI-TOFMS图。
图10为转铁蛋白糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对血清中的转铁蛋白的结合，其中a为直接检测血清的MALDI-TOF MS图，b为检测转铁蛋白糖链的印迹材料萃取血清后的MALDI-TOF MS图；c为检测相应的非印迹材料萃取血清后的MALDI-TOF MS图。
图11为核糖核酸酶B糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对血清中加入的核糖核酸酶B胰蛋白酶解混合物的结合，其中a为直接检测核糖核酸酶B的胰蛋白酶解混合物添加的血清的MALDI-TOF MS图，b为检测核糖核酸酶B糖链的印迹材料萃取混合物后的MALDI-TOF MS图；c为检测相应的非印迹材料萃取混合物后的MALDI-TOF MS图。
具体实施方式
如图1所示，一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，该方法是先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，再利用硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，再利用可硅烷化试剂在合适条件下的缩聚反应形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹的凝集素模拟物。
最近，我们已经发展出制备能专一识别糖蛋白的分子印迹聚合物的通用、便捷的方法—硼亲和可控定向表面印迹法[S.S.Wang,J.Ye,Z.J.Bie,Z.Liu,Chem.Sci.《化学科学》2014,5,1135-1140；X.D.Bi,Z.Liu,Anal.Chem.《分析化学》2014,86,959-966]。虽然本发明在技术路线上与该方法有一定的相似性，但是，本发明与该方法具有根本的不同：1)本发明以糖蛋白酶解得到的糖链为模板，而该方法以完整蛋白为模板；2)本发明得到的分子印迹聚合物不仅能识别完整糖蛋白，而且能识别糖蛋白的特征片段，而该方法所制备得到的分子印迹聚合物只能识别完整糖蛋白；3)本发明以硅烷化试剂为单体制备印迹层，而该方法以其他自聚合试剂制备印迹层。
下面通过具体实施例来进一步阐述本发明，应该说明的是，下面的实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均在本发明的保护范围之内。
实施例1：糖链(印迹模板分子)的获得
首先将完整糖蛋白溶于10mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 7.5)中,配制得到1mg/mL的混合溶液。取100μL上述混合溶液浸入沸水浴中10分钟，取出自然冷却至25℃后，加入10个单位的肽-N-糖苷酶F在37℃的水浴中反应24小时。反应结束后，在14000转/分钟的速度下用截留分子量为3000道尔顿的超滤管离心30分钟将糖链从反应体系中分离。所得糖链保存在-20℃下待用。
上述完整糖蛋白是核糖核酸酶B，或者转铁蛋白；或者其他糖蛋白。
上述肽-N-糖苷酶F是用来将完整糖蛋白上的糖链酶切下来的一种酶。
实施例2：2,4-二氟-3-甲酰基-苯硼酸修饰的磁性纳米粒子的制备
首先制备一种氨基修饰的磁性纳米粒子[制备方法参见但不限于以下文献L.Wang,J.Bao,L.Wang,F.Zhang,Y.Li,Chem.Eur.J.《欧洲化学》2006,12,6341-6347]。取200mg氨基修饰的磁性纳米粒子加入40mL无水甲醇中，随后加入400mg 2,4-二氟-3-甲酰基-苯硼酸以及400mg氰基硼氢化钠。混合物在25℃下搅拌反应24小时。所得产物用水和乙醇各清洗三遍，50℃下真空干燥12小时。即得到2,4-二氟-3-甲酰基-苯硼酸修饰的磁性纳米粒子。
实施例3：印迹涂层厚度随时间变化关系的考察
将粒径与磁性纳米粒子相近的银纳米粒子加入40mL无水乙醇和0.7mL浓氨水(37％)的混合溶液中。最后加入10mL 10mM的正硅酸乙酯的乙醇溶液。在25℃搅拌，从搅拌后的10分钟开始至60分钟结束，每隔5分钟取样，用透射电子显微镜表征其表面印迹涂层的厚度。结果如图2。图中线性相关系数r2＝0.99，斜率s＝0.04nm/min，这表明聚合物的厚度与时间增长有着良好的线性相关性，为本技术的可控性提供了保障。
实施例4：印迹材料的制备
首先取20mg 2,4-二氟-3-甲酰基-苯硼酸修饰的磁性纳米粒子，分散在2mL的含500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵(pH 8.5)缓冲溶液中，随后向混合物中加入40μL由实施例1中得到的核糖核酸酶B的糖链。在25℃下振荡2小时。用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用50mM碳酸氢铵(pH8.5)缓冲溶液洗涤三次，每次500μL。所得材料记为M-1。
将M-1分散于160mL无水乙醇和2.8mL浓氨水(质量浓度28％)的混合溶液中。最后加入40mL 10mM的正硅酸乙酯的乙醇溶液。在25℃搅拌50分钟(核糖核酸酶B糖链的尺寸为2.4至3.1nm，根据这个尺寸来确定搅拌时间为50分钟)。所得材料随后溶乙醇清洗三遍后，40℃真空干燥。所得材料记为M-2。
为了除去M-2中的模板分子，20mg M-2分散于2mL 100mM的醋酸溶液中，在25℃下振荡20分钟，上述清洗步骤重复3遍。随后所得材料用乙醇清洗3遍后，40℃真空干燥。所得材料即为核糖核酸酶B糖链的印迹材料，即为基于分子印迹技术的凝集素模拟物。
对于非印迹材料，除了没有加入模板分子(糖链)以外，其余步骤保持不变。
对于转铁蛋白糖链的印迹材料，除以下步骤外其余均保持不变：①将核糖核酸酶B的糖链替换为转铁蛋白的糖链，②将缓冲溶液替换为含500mM氯化钠的100mM磷酸盐(pH 7.4)缓冲溶液，③将印迹时间变为60分钟(转铁蛋白的糖链的尺寸为3.9nm)。
实施例5：印迹材料对于完整糖蛋白的选择性测试
首先配制一系列测试物溶液，其中包括核糖核酸酶B,核糖核酸酶A，转铁蛋白，辣根过氧化物酶，其浓度都是1mg/mL，所用溶液除转铁蛋白外均为含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)，转铁蛋白溶液的配制采用含500mM氯化钠的100mM磷酸盐(pH 7.4)缓冲溶液。
取2mg由实施例4制备得到的印迹材料分别加入200μL上述配制的测试物的溶液中，在25℃下振荡1小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次1mL，然后加入20μL洗脱液(洗脱液是100mM醋酸溶液)，振荡1小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，测定其在214nm下的吸光度，其吸光度的大小可以代表该印迹材料结合对应测试物的量。
对于非印迹材料，测试方式与上述步骤完全一致。
由图3可知：核糖核酸酶B糖链的印迹材料可以特异性地识别核糖核酸酶B。这证明了所得材料优异的特异性。
对于转铁蛋白糖链的印迹材料，测试方法与上述步骤完全一致。
由图4可知：转铁蛋白糖链的印迹材料可以特异性地识别转铁蛋白。这证明了所得材料优异的特异性的同时，也说明了此种印迹策略的普适性。
实施例6：印迹材料对于糖肽(完整糖蛋白的特征片段)的选择性测试
首先配制肽段的混合溶液，将核糖核酸酶B，转铁蛋白，辣根过氧化物酶三种蛋白的酶解肽(1mg/mL)等量混合后，用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)稀释10倍。取2mg由实施例4制备得到的核糖核酸酶B糖链的印迹材料，加入100μL上述稀释后的溶液中，在25℃下振荡1小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)洗涤三次，每次1mL，然后加入20μL洗脱液(洗脱液是100mM醋酸溶液)，振荡1小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，用质谱鉴定其中的肽段信息。
对于非印迹材料，测试方式与上述步骤完全一致。
对于转铁蛋白糖链的印迹材料，将缓冲溶液替换为含500mM氯化钠的100mM磷酸盐(pH 7.4)缓冲溶液。其余步骤保持不变。
由图5和图6可知，印迹材料对于相应的糖肽同样具有优异的特异性识别能力。
实施例7：单糖干扰物对于材料性能影响的考察
考虑本实验中糖链的结构，选用甘露糖作为代表性的单糖干扰物。应该说明的是，其他种类的单糖对材料性能的影响和甘露糖类似，在此不再赘述。
首先考察甘露糖对于抓取步骤的影响。取2mg核糖核酸酶B糖链的印迹材料分散于200μL核糖核酸酶B(1mg/mL)与甘露糖(100mg/mL)的混合溶液中。(溶液由含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)配制而成)。在25℃下振荡1小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次1mL，然后加入20μL洗脱液(洗脱液是100mM醋酸溶液)，振荡1小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，测定其在214nm下的吸光度，由于甘露糖在214nm时不具有紫外吸收，其吸光度的大小可以代表印迹材料结合的核糖核酸酶B的量。
由图7可知，高浓度单糖的干扰并不会影响印迹材料对于目标分子的识别能力。
甘露糖对于解吸步骤的影响通过如下步骤考察：按照实施例5中的步骤进行。但将解吸液替换为100mg/mL的甘露糖溶液(溶液由含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)配制而成)。在上述操作步骤后，再用100mM醋酸溶液对抓取材料进行解吸。
由图8可知，高浓度单糖并不能将印迹材料所结合的模板顶替下来，而100mM醋酸溶液却可以基本达到完全解吸。
上述两个结果保证了该材料在复杂样品中仍具有优异的特异性识别性能。
实施例8：印迹材料对于血清中完整糖蛋白的选择性测试
首先考察核糖核酸酶B糖链的印迹材料对于血清中核糖核酸酶B的选择性。由于血清中没有核糖核酸酶B的存在，所以选择人为添加一定量的核糖核酸酶B。具体配置方法：人血清用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH8.5)稀释10倍以后，人为添加核糖核酸酶B使其在血清中的浓度达到0.1mg/mL。取2mg核糖核酸酶B糖链的印迹材料分散于200μL上述稀释血清中。在25℃下振荡1小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次1mL，然后加入20μL洗脱液(洗脱液是100mM醋酸溶液)，振荡1小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，用质谱鉴定其中蛋白质的信息。
对于非印迹材料，其操作步骤与上述步骤保持一致。
对于转铁蛋白糖链的印迹材料，由于血清中存在一定浓度的转铁蛋白，所以血清直接稀释即可，同时将缓冲溶液替换为含500mM氯化钠的100mM磷酸盐(pH 7.4)缓冲溶液。其余步骤保持不变。
如图9和图10可知，印迹材料可以抓取血清样品中相应的完整蛋白，说明该材料对于相应的糖蛋白有良好的专一性识别能力，且抗干扰能力强。
实施例9：印迹材料对于血清中糖肽(完整糖蛋白的特征片段)的选择性测试
由于血清中没有核糖核酸酶B肽段的存在，所以选择人为添加一定量的核糖核酸酶B肽段。具体配置方法：人血清用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)稀释10倍以后，人为添加核糖核酸酶B肽段使其在血清中的浓度达到0.1mg/mL。取2mg核糖核酸酶B糖链的印迹材料分散于200μL上述稀释血清中。在25℃下振荡1小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次1mL，然后加入20μL洗脱液(洗脱液是100mM醋酸溶液)，振荡1小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，用质谱鉴定其中肽段的信息。
对于非印迹材料，其操作步骤与上述步骤保持一致。
如图11可知，印迹材料可以抓取血清样品中相应的糖肽，说明该材料有良好的专一性识别能力，且抗干扰能力强。
Claims (10)
1.一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于，该方法为：先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，然后通过硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，再利用硅烷化试剂进行缩聚反应形成印迹层，通过缩聚反应的反应条件来控制印迹层对模板分子的覆盖程度，最后在酸性条件下移除模板分子形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹技术的凝集素模拟物。
2.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：所述的糖链是任意目标糖蛋白上的不同结构的糖链。
3.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：所述基体材料是取代硼酸功能化的材料；所述取代硼酸功能化的材料是硼酸功能化的磁性纳米颗粒、或者磁性微球、或者其他纳米材料和玻璃片或其他表面材料。
4.根据权利要求3所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：用于硼酸功能化的取代硼酸为含有羟基、或者醛基、或者羧基、或者巯基、或者不饱和键，或者氨基等活性基团的苯硼酸或杂环取代硼酸。
5.根据权利要求1所述的一种分子印迹材料的合成方法，其特征在于，所述硅烷化试剂是正硅酸乙酯或其他取代正硅酸酯，所述硅烷化试剂的浓度为1mM～50mM。
6.根据权利要求1所述的的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：所述印迹层的厚度通过控制缩聚反应的反应条件控制在糖链模板分子长度的三分之一至三分之二。
7.根据权利要求1所述的的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：模板分子的去除采用酸性溶液洗提。
8.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于，所述凝集素模拟物在pH≥7.0条件下结合目标物，而在pH≤3.0条件下释放被结合的目标物。
9.权利要求1所述的制备方法得到的基于分子印迹技术的凝集素模拟物。
10.权利要求9所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物在分离、富集糖蛋白组学、代谢组学、糖生物学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面的应用。
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