CN109856402B - 一种用于人血清中afp在线检测的分子印迹传感器的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备，包括以下步骤：⑴制备APBA‑PA；⑵配制食人鱼溶液；⑶配制MPS无水乙醇溶液；⑷配制APBA‑PA无水乙醇溶液；⑸配制PB缓冲液；⑹配制AFP稀释溶液；⑺配制TEOS溶液；⑻配制模板分子洗脱剂；⑼清洁载体；⑽将清洁的载体依次浸入食人鱼溶液、MPS无水乙醇溶液，经漂洗、吹干即得双键功能化的载体；⑾双键功能化的载体浸入APBA‑PA无水乙醇溶液中，再加入AIBN，经漂洗、吹干，即得APBA‑PA接枝的载体；⑿将APBA‑PA接枝的载体浸入AFP稀释溶液反应，经漂洗、晾干，得到表面固定有AFP的载体；⒀将表面固定有AFP的载体浸入TEOS溶液反应，经洗脱、漂洗、自然晾干即得。本发明制备方法简单、成本低廉，所得的传感器选择性好、生物相容性好。

Description

一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备。

背景技术

癌症是人类健康的第二大杀手。据统计，全球每年有近千万人死于癌症（R. A.Smith, CA Cancer J. Clin., 2017,67,100-121）。早诊断、早治疗是提高癌症患者存活率的关键。目前，临床上主要借助酶联免疫分析技术对人血清中AFP（甲胎蛋白）等肿瘤标志物进行检测，以作为癌症早期筛查的重要依据。基于天然抗体的免疫分析操作简单快速、灵敏度高、选择性好，但该法存在试剂稳定性差、获得高质量的抗体成本高、对检测人员经验要求高等问题（Y. D. Wu, ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 9369-9377; H. Ma,Anal. Chem., 2018, 90, 12342-12346）。因此，发展完全避免使用抗体的新型生物分析技术并将其应用于人血清中肿瘤标志物的检测，对于癌症早期诊断意义重大。

分子印迹技术是通过模仿生命过程中的抗体特异性识别过程，采用人工合成方法，制备对目标分子具有高选择性识别能力的材料的技术（K. Graniczkowska, Biosens. Bioelectron., 2017, 92, 741-747）。近年来，分子印迹技术凭借其优异的样品净化和高选择性识别能力，已作为一种强有力的样品制备技术被应用于化合物小分子及部分生物大分子的分离分析中(M. A. Zazouli, Anal. Methods, 2017, 9, 3019-3028)。但是，这些方法常需借助离线模式对分子印迹材料的识别吸附结果进行定性、定量检测，该过程耗时费力、操作步骤繁琐、检测成本高昂，还易增大结果误差（J. Luo, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017, 9, 7735-7744）。为此，亟需将分子印迹技术与在线检测技术相结合，以促进分子印迹技术在生物医药技术领域的应用。

文献显示，APBA-PA兼具硼酸基团与荧光基团，在中性及弱碱性条件下可与含有顺式邻二羟基的目标物之间发生硼酸亲和作用，形成硼酸内脂，同时其自身荧光发生改变（Z.F. Xu, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6, 1406-1414），现已逐渐被用于果糖、葡萄糖等糖类小分子印迹聚合物的制备，但在糖蛋白等生物大分子方面的研究尚未见报道。然而，糖蛋白AFP中寡糖端含有大量顺式邻二羟基结构，与APBA-PA中硼酸基团间易发生硼酸亲和作用，若将其作为荧光硼酸单体用于通过AFP印迹聚合物的制备，有望实现对AFP的在线检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、成本低廉的用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备。

为解决上述问题，本发明所述的一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备，包括以下步骤：

⑴制备（3-2-（4-（丙烯酰氧基）甲基）-1H-1，2，4-三唑-1-基）乙酰氨基）苯基）硼酸（APBA-PA）；

⑵在冰水浴中配制30 mL食人鱼溶液；

⑶配制MPS无水乙醇溶液：

将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷（MPS）溶解于无水乙醇中，得到体积浓度为1%~10%的MPS无水乙醇溶液；

⑷配制APBA-PA无水乙醇溶液：

将所述APBA-PA溶解于无水乙醇中，得到质量浓度为5%~40%的APBA-PA无水乙醇溶液；

⑸配制20 mmol L^-1、pH=7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（PB）缓冲液；

⑹配制甲胎蛋白（AFP）稀释溶液：

采用所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（PB）缓冲液稀释甲胎蛋白（AFP）标准溶液，得到质量浓度为125 μg L^-1~1000 μg L^-1的AFP稀释溶液；

⑺配制正硅酸乙酯溶液：

将正硅酸乙酯（TEOS）均匀分散至所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（PB）缓冲液中即得体积浓度为0.1%~0.5%的TEOS溶液；

⑻配制模板分子洗脱剂：

将体积浓度为6%~20%的醋酸水溶液与体积浓度为40%~80%的乙腈水溶液按1：1的体积比混合均匀即得；

⑼将载体分别利用超纯水、无水乙醇和丙酮超声漂洗2~5次，每次5~20分钟，得到清洁的载体；

⑽将所述清洁的载体先浸入所述食人鱼溶液中进行表面羟基活化反应，再浸入所述MPS无水乙醇溶液中进行表面双键功能化，最后经漂洗、氮气吹干即得双键功能化的载体；

⑾所述双键功能化的载体浸入所述APBA-PA无水乙醇溶液中，再加入与APBA-PA等量的偶氮二异丁腈（AIBN）进行自由基聚合反应，反应结束后经漂洗、氮气吹干，即得APBA-PA接枝的载体；

⑿将所述APBA-PA接枝的载体浸入所述AFP稀释溶液进行硼酸亲和反应，反应结束后经漂洗、自然晾干，得到表面固定有AFP的载体；

⒀将所述表面固定有AFP的载体浸入所述正硅酸乙酯（TEOS）溶液中，于20℃~35℃振荡反应0.5 h~10 h，反应结束后用模板分子洗脱剂洗脱20 min~60 min，再经漂洗、自然晾干，即得分子印迹功能化的传感器。

所述步骤⑼中载体是指尺寸为25 mm×15 mm×1 mm~25 mm×75 mm×1 mm的普通生物显微镜载玻片、医用载玻片、盖玻片、高晶硅片中的任意一种。

所述步骤⑽中表面羟基活化反应的条件是指温度为80℃~110℃，时间为0.5 h~4h。

所述步骤⑽中表面双键功能化的条件是指温度为60℃~75℃，时间为20 min~60min。

所述步骤⑾中自由基聚合反应的条件是指温度为66℃~72℃，时间为6 h~24 h。

所述步骤⑿硼酸亲和反应的条件是指温度为20℃~35℃，时间为6 h~24 h。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明利用成本低、易修饰、便携性好的普通生物显微镜载玻片、医用载玻片、盖玻片、高晶硅片等作为分子印迹聚合物载体，制备分子印迹功能化传感器，简化了分子印迹材料的制备流程及其在实际样品分析中的操作步骤，有助于推进分子印迹材料向器件化、产品化发展。

2、本发明以APBA-PA为“点亮”型（turn-on）荧光硼酸单体作为分子印迹功能化传感器的信号单元，以正硅酸乙酯（TEOS）为交联剂，以AFP为模板分子，在载体表面构筑分子印迹聚合物，由此制得分子印迹功能化传感器。

3、本发明所得的分子印迹功能化传感器表面的印迹空穴与AFP大小、形状一致，官能团互相匹配，可实现对AFP的高选择性识别吸附。同时，AFP进入印迹空穴后，该传感器荧光增强（参见图2），因此结合荧光检测检测限低、灵敏度高的优点，通过监测传感器对AFP高选择性识别吸附前后体系荧光强度的变化，即可实现该传感器对人血清中AFP的在线检测，不但提高了分子印迹材料的分析效率，还有利于分子印迹技术在生物医药领域的应用推广。

4、将本发明所得的分子印迹功能化传感器、非分子印迹功能化传感器分别与AFP标准样品（图3a）、吸附稀释20倍后疾病患者血清样品后的洗脱液进行比对，可以发现：在稀释20倍后疾病患者血清样品中，由于AFP在人血清中的含量极微，所以该谱图中未出现AFP的特征质子峰（参见图3b）；非分子印迹聚合物缺少与AFP大小、形状一致，官能团互相匹配的印迹空穴，所以其无法选择性识别吸附血清中AFP，故该洗脱液中未检出AFP（参见图3c）；而本发明AFP特征质子峰清晰可见，证明分子印迹传感器对AFP具有高选择性识别吸附作用（参见图3d）。

5、本发明制备方法简单、成本低廉，所得的传感器选择性好、生物相容性好、吸附速率快、分析效率高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明分子印迹传感器的制备方法流程示意图。

图2为本发明分子印迹传感器在不同浓度AFP条件下的荧光谱图。

图3为本发明分子印迹传感器对人血清中AFP在线检测后MALDI-TOF MS验证结果。其中，a为AFP标准样品的MALDI-TOF MS图谱，其中“AFP（3+）”为AFP的三电荷质子峰，“AFP（2+）”为AFP的双电荷质子峰，“AFP”为AFP的单电荷质子峰；b为稀释20倍后疾病患者血清样品的MALDI-TOF MS谱图，其中“HSA（2+）”为HSA的双电荷质子峰，“HSA”为HSA的单电荷质子峰，人血清白蛋白（HSA）为人血清中蛋白质的主要成分；c为非分子印迹功能化传感器吸附疾病患者血清样品后的洗脱液；d为分子印迹功能化传感器吸附疾病患者血清样品后的洗脱液。

具体实施方式

实施例1 一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备（如图1所示），包括以下步骤：

⑴制备（3-2-（4-（丙烯酰氧基）甲基）-1H-1，2，4-三唑-1-基）乙酰氨基）苯基）硼酸，即APBA-PA（ACS Appl. Mater. Interfaces., 2014, 6, 1406-1414）：

称取1.488g3-氨基苯硼酸半硫酸盐和2.016g碳酸氢钠溶解于80 mL超纯水中，然后逐滴加入3.680g溴乙酰溴。将该反应溶液于冰水浴中反应2 h，然后于室温条件下继续反应16h。反应结束后，滤出沉淀并复溶于用20 mL氢氧化钠溶液中（0.5 M）。调节溶液pH至2.0，滤出沉淀冻干。

称取1.37g上述产物、0.36g叠氮化钠溶解于21 mL N,N-二甲基甲酰胺中，于室温条件下持续搅拌12 h后，加入35 mL超纯水。用盐酸将溶液调至pH=2，随后用乙酸乙酯对其进行萃取处理，收集有机相后蒸干，得到绿色粉末APBA。

称取0.219g上述产物溶解于6 mL甲醇/水混合液（2:1, v/v）中。另取110μL丙烯酸丙炔酯、200 μL硫酸铜溶液水溶液（100 mM）和3.0 mL抗坏血酸水溶液（100 mM）配制成混合溶液，对其进行氮气脱氧处理5 min。将该体系于室温条件下在氮气氛围中反应48 h后，蒸干溶液，将产物复溶至乙酸乙酯/水混合液（1:1，v/v）中。收集有机相后用无水硫酸钠进行脱水处理。随后，对溶液进行旋蒸处理，并用乙基己烷/正己烷混合液（5:1，v/v）反复重结晶两次，即得荧光硼酸单体APBA-PA。

⑵在冰水浴中配制30 mL食人鱼溶液（浓硫酸/双氧水=7:3，V/V）。

⑶配制MPS无水乙醇溶液：

将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷（MPS）溶解于无水乙醇中，得到体积浓度为1%~10%的MPS无水乙醇溶液。

⑷配制APBA-PA无水乙醇溶液：

将APBA-PA溶解于无水乙醇中，得到质量浓度为5%~40%的APBA-PA无水乙醇溶液。

⑸配制20 mmol L^-1、pH=7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（PB）缓冲液。

⑹配制甲胎蛋白（AFP）稀释溶液：

采用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（PB）缓冲液稀释甲胎蛋白（AFP）标准溶液，得到质量浓度为125 μg L^-1~1000 μg L^-1的AFP稀释溶液。

⑺配制TEOS溶液：

将正硅酸乙酯（TEOS）均匀分散至PB缓冲液中即得体积浓度为0.1%~0.5%的TEOS溶液。

⑻配制模板分子洗脱剂：

将体积浓度为6%~20%的醋酸水溶液与体积浓度为40%~80%的乙腈水溶液按1：1的体积比（mL/mL）混合均匀即得。

⑼将载体分别利用超纯水、无水乙醇和丙酮超声漂洗2~5次，每次5~20分钟，得到清洁的载体。

⑽将清洁的载体先浸入食人鱼溶液中，于80℃进行表面羟基活化反应4 h，再浸入体积浓度为1%的MPS无水乙醇溶液于60℃中进行表面双键功能化60 min，最后经无水乙醇漂洗、氮气吹干即得双键功能化的载体。

⑾双键功能化的载体浸入质量浓度为5%的APBA-PA无水乙醇溶液中，再加入与APBA-PA等量的AIBN，于66℃进行自由基聚合反应，24 h后反应结束，经无水乙醇漂洗、氮气吹干，即得APBA-PA接枝的载体。

⑿将APBA-PA接枝的载体浸入质量浓度为125 μg L^-1的AFP稀释溶液，于20℃进行硼酸亲和反应24 h，反应结束后经PB缓冲液漂洗、自然晾干，得到表面固定有AFP的载体。

⒀将表面固定有AFP的载体浸入体积浓度为0.1%的TEOS溶液中，于20℃振荡反应10 h，反应结束后用模板分子洗脱剂洗脱20 min，再经超纯水漂洗、自然晾干，即得分子印迹功能化的传感器。

实施例2 一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备，包括以下步骤：

⑴~⑼同实施例1。

⑽将清洁的载体先浸入食人鱼溶液中，于110℃进行表面羟基活化反应0.5 h，再浸入体积浓度为10%的MPS无水乙醇溶液于75℃中进行表面双键功能化20 min，最后经无水乙醇漂洗、自然晾干即得双键功能化的载体。

⑾双键功能化的载体浸入质量浓度为40%的APBA-PA无水乙醇溶液中，再加入与APBA-PA等量的AIBN，于72℃进行自由基聚合反应，6 h后反应结束，经无水乙醇漂洗、氮气吹干，即得APBA-PA接枝的载体。

⑿将APBA-PA接枝的载体浸入质量浓度为1000 μg L^-1的AFP稀释溶液，于35℃进行硼酸亲和反应6 h，反应结束后经PB缓冲液漂洗、自然晾干，得到表面固定有AFP的载体。

⒀将表面固定有AFP的载体浸入体积浓度为0.5%的TEOS溶液中，于35℃振荡反应0.5 h，反应结束后用模板分子洗脱剂洗脱60 min，再经超纯水漂洗、自然晾干，即得分子印迹功能化的传感器。

实施例3 一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备，包括以下步骤：

⑴~⑼同实施例1。

⑽将清洁的载体先浸入食人鱼溶液中，于90℃进行表面羟基活化反应2 h，再浸入体积浓度为5%的MPS无水乙醇溶液于65℃中进行表面双键功能化40 min，最后经无水乙醇漂洗、氮气吹干即得双键功能化的载体。

⑾双键功能化的载体浸入质量浓度为20%的APBA-PA无水乙醇溶液中，再加入与APBA-PA等量的AIBN，于69℃进行自由基聚合反应，15 h后反应结束，经无水乙醇漂洗、氮气吹干，即得APBA-PA接枝的载体。

⑿将APBA-PA接枝的载体浸入质量浓度为500 μg L^-1的AFP稀释溶液，于28℃进行硼酸亲和反应15 h，反应结束后经PB缓冲液漂洗、自然晾干，得到表面固定有AFP的载体。

⒀将表面固定有AFP的载体浸入体积浓度为0.3%的TEOS溶液中，于28℃振荡反应5h，反应结束后用模板分子洗脱剂洗脱40 min，再经超纯水漂洗、自然晾干，即得分子印迹功能化的传感器。

上述实施例1~3中，载体是指尺寸为25 mm×15 mm×1 mm~25 mm×75 mm×1 mm的普通生物显微镜载玻片、医用载玻片、盖玻片、高晶硅片中的任意一种。

将上述实施例1~3所得的分子印迹功能化传感器应用于生物医药领域的方法：将疾病患者血清用PB缓冲液稀释20倍后，取100 μL~300 μL血清样品溶液均匀滴涂在该传感器表面；将该传感器置于25℃恒温振荡器中缓慢振荡10 min~60 min；震荡结束后，用PB缓冲液漂洗传感器，用荧光光谱仪测定其荧光强度。

Claims (1)

1.一种用于人血清中AFP在线检测的分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：

⑴制备（3-2-（4-（丙烯酰氧基）甲基）-1H-1，2，4-三唑-1-基）乙酰氨基）苯基）硼酸，即APBA-PA；

⑵在冰水浴中配制30 mL食人鱼溶液；

⑶配制MPS无水乙醇溶液：

将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷溶解于无水乙醇中，得到体积浓度为1%~10%的MPS无水乙醇溶液；

⑷配制APBA-PA无水乙醇溶液：

将所述APBA-PA溶解于无水乙醇中，得到质量浓度为5%~40%的APBA-PA无水乙醇溶液；

⑸配制20 mmol L^-1、pH=7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；

⑹配制甲胎蛋白稀释溶液：

采用所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液稀释甲胎蛋白标准溶液，得到质量浓度为125μg L^-1~1000 μg L^-1的AFP稀释溶液；

⑺配制正硅酸乙酯溶液：

将正硅酸乙酯均匀分散至所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中即得体积浓度为0.1%~0.5%的TEOS溶液；

⑻配制模板分子洗脱剂：

将体积浓度为6%~20%的醋酸水溶液与体积浓度为40%~80%的乙腈水溶液按1：1的体积比混合均匀即得；

⑼将载体分别利用超纯水、无水乙醇和丙酮超声漂洗2~5次，每次5~20分钟，得到清洁的载体；所述载体是指尺寸为25 mm×15 mm×1 mm~25 mm×75 mm×1 mm的普通生物显微镜载玻片、医用载玻片、盖玻片、高晶硅片中的任意一种；

⑽将所述清洁的载体先浸入所述食人鱼溶液中进行表面羟基活化反应，再浸入所述MPS无水乙醇溶液中进行表面双键功能化，最后经漂洗、氮气吹干即得双键功能化的载体；所述表面羟基活化反应的条件是指温度为80℃~110℃，时间为0.5 h~4 h；所述表面双键功能化的条件是指温度为60℃~75℃，时间为20 min~60 min；

⑾所述双键功能化的载体浸入所述APBA-PA无水乙醇溶液中，再加入与APBA-PA等量的偶氮二异丁腈进行自由基聚合反应，反应结束后经漂洗、氮气吹干，即得APBA-PA接枝的载体；所述自由基聚合反应的条件是指温度为66℃~72℃，时间为6 h~24 h；

⑿将所述APBA-PA接枝的载体浸入所述AFP稀释溶液进行硼酸亲和反应，反应结束后经漂洗、自然晾干，得到表面固定有AFP的载体；所述硼酸亲和反应的条件是指温度为20℃~35℃，时间为6 h~24 h；

⒀将所述表面固定有AFP的载体浸入所述正硅酸乙酯溶液中，于20℃~35℃振荡反应0.5 h~10 h，反应结束后用模板分子洗脱剂洗脱20 min~60 min，再经漂洗、自然晾干，即得分子印迹功能化的传感器。

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