CN103406109A - 一种可控、通用的定向表面印迹方法以及所得分子印迹聚合物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可控、通用的定向表面印迹方法，该方法先通过硼亲和作用将模板糖蛋白锚定于取代硼酸功能化基体材料表面，再利用可自聚合的化合物在水相中的自聚合形成的聚合物形成印迹层，最后在酸性条件下将模板洗脱形成印迹空腔，从而得到分子印迹聚合物。该方法制备的分子印迹聚合物不仅具有专一性好、结合容量高、抗干扰能力强和结合及解析速度快等优点，还能在有或无硼亲和作用两种模式下专一性识别模板糖蛋白，在保持专一性的同时与模板的结合力可调，应用范围宽。该技术具有便捷、可控、通用和印迹效率高等优点。本发明制备的分子印迹聚合物可以对复杂的实际样品中低丰度的糖蛋白进行专一性识别、富集、分离与检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子印迹功能化材料领域，具体说是一种可控、通用的定向表面印迹方法以及所得分子印迹聚合物在糖蛋白的专一性识别、富集、分离和检测方面的应用。
背景技术
糖蛋白是一类具有重要生物学功能和临床意义的蛋白质。它们在生物体内广泛存在，例如，哺乳动物体内的总蛋白的一半以上为糖蛋白。糖蛋白在生理过程中发挥着重要作用，如分子识别、免疫应答、细胞内/间信号及发育调控等。此外，糖蛋白在重大疾病的早期诊断上也具有重要意义，如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病及糖尿病等等。在美国食品药物管理局（FDA）批准的疾病标志物中绝大多数是糖蛋白，如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）和前列腺特异抗原（PSA）等。再者，人类绒毛膜促性腺激素（hCG）和促红细胞生成素（EPO）等糖蛋白兴奋剂是体育运动中的禁用物质，这些兴奋剂的快速灵敏检测也具有很强的挑战性[F.Lasne,J.de Geaurriz,Nature2000,405,635；何坚刚，刘震，刘晶，窦鹏，陈洪渊，色谱2008,28,402-407]。
凝集素和抗体是糖蛋白识别、纯化和分离的重要工具，但是，它们均存在着价格昂贵、稳定性差以及目标糖蛋白结合后洗脱困难等缺点。因此，能专一识别糖蛋白的价廉、稳定和洗脱方便的凝集素和抗体的替代品具有重要的应用前景。分子印迹（molecular imprinting）技术是先将模板分子与功能单体按一定比例形成配合物，再加入交联剂形成聚合物从而将模板分子固定并包裹在聚合物中，然后采用合适的方法将模板分子去除，从而在聚合物中留下形状与模板分子互补的空腔及选择性的结合位点。分子印迹技术具有如下特点：一、专一性，通过分子印迹制备的功能材料具有专一性识别模板分子的能力，能与模板分子形成类似于抗原-抗体间的相互作用，因此，分子印迹材料也被称为“塑料抗体”或“人工抗体”；二、预见性，可以根据不同目的而制备不同的印迹材料；三、实用性，分子印迹材料可通过化学合成进行批量的大规模生产，价格低廉，能适用于不同的条件，且稳定性好、寿命长。分子印迹材料已被广泛用于色谱分离、化学传感、药物运输及生物催化等领域。
尽管分子印迹技术已广泛应用于生物分子的印迹，但生物大分子尤其是蛋白质的分子印迹仍具有极大的挑战性，这是因为：①绝大部分蛋白均是水溶性的，而分子印迹往往在有机相中进行，这样的聚合条件下蛋白质容易变性；②蛋白质分子量大，模板蛋白质在高分子聚合物网络中难以除去。为了解决这些问题，已发展出多种适用于蛋白质的分子印迹技术，例如表面印迹法[Kempe,M.;Glad.M.;Mosbach,K.J.Mol.Recognit.1995,8,35-39]、抗原决定基印迹法[Nishino,N.;Huang,C.S.;Shea,K.J.Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,2392-2396]、金属配位印迹法[Qin,L.;He,X.W.;Zhang,W.;Li,W.-Y.;Zhang,Y.-K.Anal.Chem.2009,81,7206-7216]、分层印迹法[Nematollahzadeh,A.;Sun,W.;Aureliano,C.S.A.;Lütkemeyer,D.;Stute,J.;Abdekhodaie,M.J.;Shojaei,A.;Sellergren,B.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,495-498]、皮克林乳液印迹法[Shen,X.T.;Ye L.Chem.Commun.2011,47,10359-10361]及纳米技术印迹[Cai,D.;Ren,L.;Zhao,H.Z.;Xu,C.J.;Zhang,L.;Yu,Y.;Wang,H.Z.;Lan,Y.C.;Roberts,M.F.;Chuang,J.H.;Naughton,M.J.;Ren,Z.F.;Chiles,T.C.Nat.Nanotechnol.2010,5,597-601]等等。然而，目前蛋白质印迹方法和技术主要是针对单个蛋白质设计，能对一类蛋白质进行印迹的通用方法和技术很有限。最近，一种能高效、便捷地印迹糖蛋白的普适性方法—光刻硼亲和分子印迹法已经出现，通过引入取代硼酸功能单体以提供能识别糖蛋白分子中糖链的结合位点，所得分子印迹聚合物展现出多个超出预期的优异性能：高专一性、高亲和力和超高抗干扰能力[Li,L.;Lu,Y.;Bie,Z.J.;Chen,H.Y.;Liu,Z.Angew.Chem.Int.Ed.,2013，52，7451-7455]。但是，该方法采用的是紫外光引发聚合，只适用于在基体材料开放表面上的印迹。
发明内容
为了克服现有蛋白质印迹技术可控性和通用性差的缺点，本发明目的在于提供一种可控、通用的定向表面印迹方法以及所得分子印迹聚合物的应用。
为了解决上述目的，本发明的技术方案如下：一种可控、通用的定向表面印迹方法，先硼亲和作用将模板糖蛋白锚定于基体材料表面，再利用可自聚合的化合物在水相中的自聚合形成的聚合物形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到分子印迹聚合物。所述基体材料是取代硼酸功能化基体材料，所述模板糖蛋白通过取代硼酸功能化基体材料表面上的硼酸配基的硼亲和作用锚定。
所述取代硼酸功能化基体材料是二维或三维结构，这些结构体现在实施例6、7、9中。
所述取代硼酸可以是含有羟基、醛基、羧基、巯基、不饱和键或氨基等活性基团的苯硼酸或杂环硼酸。
所述可自聚合的化合物（又称预聚液）是由多巴胺与间氨基苯硼酸等比组成的共聚物，或者其他能在水相中自聚且可控性好的单体，如苯胺，丙烯酰胺等。
所述分子印迹聚合物的厚度通过控制反应条件（反应时间、可自聚合的化合物的浓度）进行控制精确控制（通常控制在模板蛋白分子三维尺寸的其中一维的三分之一至三分之二）。此项操作体现在实施例3和9中。
所述酸性条件是酸性溶液；包括但不限于0.1M的醋酸溶液醋酸。
方法步骤如下：首先在取代苯硼酸功能化的基体材料表面利用硼酸配基与糖蛋白之间的硼亲和作用在基体材料表面结合上一层模板糖蛋白分子，然后再利用在水相中能自聚的化合物自聚合形成的聚合物来制备印迹聚合物层，通过控制合适的反应条件来控制聚合物层对模板糖蛋白分子的覆盖程度，最后在酸性条件下洗脱模板分子从而在印迹聚合物层形成与模板分子形状相匹配的三维印迹空腔，这样即可制得能专一识别模板糖蛋白的分子印迹聚合物。由于印迹聚合物层的厚度是可控的，每一个锚定后的模板分子都能形成有效的印迹空腔，因此印迹效率高。同时，由于使用的印迹聚合物层具有良好的亲水性，因此大大减少了印迹聚合物层的非特异作用。
利用上述可控、通用的定向表面印迹方法制备的分子印迹聚合物。
上述分子印迹聚合物在糖蛋白的专一识别、富集、纯化、分离和检测方面的应用。
所述分子印迹聚合物在有或无硼亲和作用两种模式下专一性识别模板糖蛋白，即：高pH(≥7)时存在硼亲和作用，此时印迹聚合物与模板分子之间作用较强；低pH(≤3)时不存在硼亲和作用，此时印迹聚合物与模板分子之间作用较弱，但仍能专一性识别，因此，能通过调节pH来调节作用强弱，以满足不同的应用。
上述可控、通用的定向表面印迹技术用于糖蛋白的富集、纯化和分离，尤其是复杂样品中糖蛋白的纯化和分离，该技术制备的分子印迹材料专一性好、印迹效率高、抗干扰能力强，还具有便捷、可控和通用等优点。
有益效果：与现有技术相比，本发明首次描述了一种可控、通用的定向表面印迹技术，它是基于硼亲和作用的可控定向表面印迹技术，在保留以上硼亲和分子印迹法所提供的优点的同时，能适用于任意基体材料，是一种通用、便捷和高效的分子印迹技术，目前尚未有类似文献和专利报道。该技术制备的材料专一性识别能力好，抗干扰能力强，不仅能在高丰度非糖蛋白的干扰下选择性富集低丰度糖蛋白，还能在有或无硼亲和作用的双模式下识别模板分子，在保持专一性的同时，还能通过调节pH来调节印迹材料与模板分子间的作用强度。此外，该技术制备的材料还具有有效印迹位点多，印迹效率高，结合容量大，结合及解析速度快等优点。
附图说明
图1为可控通用的定向水相表面印迹技术的原理图。
图2为该技术制备的材料的颜色和接触角数据，其中，A为未经处理的玻璃片；B为多巴胺与间氨基苯硼酸共聚物修饰的玻璃片；C为未经处理的玻璃片的接触角；D为多巴胺与间氨基苯硼酸共聚物修饰的玻璃片的接触角。
图3为印迹聚合物厚度与聚合时间的关系。
图4为不同聚合物修饰的基体材料的X射线光电子能谱波长全扫描（A）及氧元素扫描（B）。
图5为印迹和非印迹玻璃片的TMB显色效果图，其中，A是非印迹玻璃片；B是HRP印迹玻璃片。
图6为印迹了AFP后的96孔酶标板，右三列为含聚苯胺印迹聚合物的孔，其余为未经处理的孔。
图7是印迹甲胎蛋白（AFP）后的酶标板对血清中AFP的检测结果。
图8为硼亲和整体柱的SEM表征图，其中，A、B为硼亲和整体柱的形貌；C、D为在硼亲和整体柱上印迹辣根过氧化物酶（HRP）后的形貌。
图9为存在硼亲和作用时HRP印迹整体柱对几种蛋白的色谱保留，其中，A是HRP印迹柱，B是非印迹柱。
图10为存在硼亲和作用时转铁蛋白（TRF）印迹整体柱对几种蛋白的色谱保留，其中，A是TRF印迹柱；B是A的局部放大图；C是非印迹柱。
图11为不存在硼亲和作用时印迹柱的色谱保留，其中A是HRP印迹柱，B是TRF印迹柱。
图12为TRF印迹柱萃取人血清样品的基体辅助激光电离-时间飞行质谱（MALDI-TOF MS）图，其中，A为20倍稀释的人血清样品；B为20倍稀释的人血清样品经TRF印迹柱萃取不被保留的部分；C为0.1mg/mL标准TRF样品；D为20倍稀释的人血清样品经TRF印迹柱萃取保留部分经醋酸洗脱得到的样品。
具体实施方式
实施例1：聚合物修饰的玻璃片的制备
首先配置预聚液：预聚液是含2.0mg/mL多巴胺，1.6mg/mL间氨基苯硼酸和1.2mg/mL过硫酸铵的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液。预聚液混匀后加入玻璃片，室温下自聚合24小时即可得到聚合物修饰的玻璃片。结果如图2B。与未经处理的玻璃片（图2A）对比，呈现明显更深的颜色。
实施例2：聚合物修饰的玻璃片的接触角测试
将清洁的未经处理的玻璃片和实施例1得到的玻璃片干燥后分别用于接触角测试。结果分别如图2C，2D。其中，聚合物修饰的玻璃片接触角为38.9°，未经处理的玻璃片的接触角为66.1°。显然，聚合物修饰的玻璃片亲水性更好。
实施例3：聚合物厚度随时间变化关系的考察
将一组洁净的玻璃片置于含有2.0mg/mL多巴胺、1.6mg/mL间氨基苯硼酸和1.2mg/mL过硫酸铵的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液中，分别控制聚合时间为0.5h，1.0h，1.5h，2.0h和2.5h。然后用原子力显微镜（AFM）表征聚合厚度。结果如图3。图中线性相关系数r2=0.95，斜率s=3.5±0.4nm/h，这表明聚合物的厚度与时间增长有着良好的线性相关性，为本技术的可控性提供了保障。
实施例4：不同聚合物修饰的玻璃片的C、O、B、N相对含量的测定
将实施例1中制得的玻璃片用XPS表征各种元素的相对含量，结果见表1，表1为X射线光电子能谱表征多巴胺与间氨基苯硼酸共聚物修饰的玻璃片中C、O、B及N的相对含量，其中相对含量是以N为参照。
表1
实施例5：X射线光电子能谱表征不同聚合物修饰的玻璃片
将实施例1中制得的玻璃片用XPS表征各种元素的结合能，结果见图4。
实施例6：辣根过氧化物酶（HRP）印迹及非印迹阵列的比色测定
将一组洁净的玻璃片置于50mL由四氢呋喃和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）体积比1:1组成的溶液中，80℃反应10小时，反应完后用甲醇冲洗，然后置于含有1mg/mL4-醛基苯硼酸的甲醇溶液中反应10小时，反应完成后用甲醇冲洗，再置于含有1mg/mL氰基硼氢化钠的甲醇溶液中反应10小时，最后用甲醇冲洗后真空干燥，这样就制得了硼酸功能化的玻璃片。
将上述硼酸功能化的玻璃片置于含有1mg/mL HRP的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液中反应10分钟，然后用不含HRP的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液冲洗，干燥后用记号笔绘制圆圈作为阵列。然后将含有多巴胺和间氨基苯硼酸的预聚液（预聚液是含2.0mg/mL多巴胺、1.6mg/mL间氨基苯硼酸及1.2mg/mL过硫酸铵的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液）加入到阵列中，室温反应70分钟。最后将所得玻璃片用含10%SDS（十二烷基磺酸钠，该百分数为质量与体积比）的0.1M醋酸移除模板，这样就制得了HRP印迹的阵列。非印迹阵列的制备方法除了不添加HRP之外，其他步骤相同。
将上述HRP印迹及非印迹阵列分别加入10μL含有0μg/mL，2μg/mL，200μg/mL HRP的0.1M，pH8.5磷酸盐缓冲液。室温下放置10分钟后用不含HRP的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液冲洗残余试剂，干燥后加入TMB显色液，反应10分钟后用数码相机记录结果。如图5（A为非印迹阵列，B为HRP印迹阵列）。显然HRP印迹阵列能抓取模板分子，而非印迹阵列不能。
实施例7：AFP印迹涂层的制备
步骤1），酶标板硼酸功能化
先用甲醇、去离子水超声清洗96孔酶标板，晾干。然后每孔加入250μL硝化反应液，室温反应30分钟，反应结束后用水洗至中性，接着每孔加入250μL氨基化反应液室温反应2小时，反应结束后用水洗净，并在62℃加热96孔酶标板2小时后用甲醇清洗。然后每孔加入150μL浓度为10mg/mL的4-甲酰基苯硼酸的甲醇溶液，室温反应12小时，再每孔加入100μL浓度为10mg/mL的氰基硼氢化钠甲醇溶液，继续反应12小时，最后用甲醇冲洗，反应液回收处理。其中硝化反应液是浓硝酸：浓硫酸按照体积比为3:1混合后的混合液。氨基化反应液的配制方法为：将5%（v/v）的APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）水溶液用浓盐酸调节pH至6.9。
步骤2），制备AFP印迹及非印迹涂层
将经步骤1）处理后得到的96孔酶标板每孔加入100μL AFP（甲胎蛋白）样品溶液（该样品溶液是由AFP溶于0.2M，pH8.5的磷酸盐缓冲液中制得，其中AFP浓度为5μg/mL），室温反应2小时后，用不含AFP的0.2M，pH8.5的磷酸盐缓冲溶液清洗5次，这样就制得了锚定过AFP模板的酶标板。然后每孔加入预聚液和氧化剂溶液各50μL，室温反应1小时，反应结束后倒掉反应液，依次用去离子水、体积浓度为1%的醋酸溶液、去离子水清洗，制备好的印迹涂层4℃下保存备用。其中预聚液由苯胺溶于0.2M，pH7.4的磷酸盐缓冲溶液制得，苯胺浓度为600mM。氧化剂溶液是由过硫酸铵（APS）溶于0.2M，pH7.4的磷酸盐缓冲溶液制得，APS浓度为200mM）。
非印迹涂层的制备除了没有添加模板以外，其他步骤相同。结果如图6所示。
实施例8：血清中AFP检测
每孔加入50μL不同浓度（0-300ng/mL）的AFP血清样品和100μL的HRP标记的AFP一抗的稀释液，所述AFP一抗的稀释液是将AFP一抗与酶标抗体稀释液按照体积比1:2000进行稀释得到的稀释液，室温反应1小时，用含有0.05%tween-20的0.2M，pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗5次。然后每孔加入200μL的TMB显色液，室温25℃下振荡反应10-30分钟，待显色稳定后，用酶标仪读取650nm的吸收值，上述实验重复3次，或者在3个相同的酶标板孔内进行，结果为3次的平均值。（此处的结果未扣除涂层的本身以及TMB本身在650nm处的背景吸收值），结果如图7所示。
实施例9：HRP印迹柱和非印迹柱及TRF印迹柱和非印迹柱的制备
先制备一种硼亲和基础柱（制备方法参见但不限于以下文献：Yunchun Liu,Lianbing Ren,Zhen Liu,Chem.Commun.,2011,47,5067-5069;Hengye Li,Yunchun Liu,Jing Liu,Zhen Liu,Chem.Commun.,2011,47,8169-8171;Hengye Li,Heye Wang,Yunchun Liu,Zhen Liu,Chem.Commun.,2012,48,4115-4117）和模板分子溶液（模板分子溶液即为含有1mg/mL HRP的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液），之后将模板分子溶液注入到基础柱内，室温反应10分钟，然后用不含HRP的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液冲掉未反应液，接着将含有多巴胺和间氨基苯硼酸的预聚液（预聚液是含2.0mg/mL多巴胺、1.6mg/mL间氨基苯硼酸及1.2mg/mL过硫酸铵的0.1M，pH8.5的磷酸盐缓冲液）注入到柱内，室温反应70分钟（HRP的分子大小为4.0×6.7×11.7nm），反应完后用含有10%SDS（十二烷基磺酸钠，该百分数为质量与体积比）的0.1M醋酸移除模板，这样的制得了HRP印迹柱。非印迹柱除了不加模板之外，其他步骤相同。
TRF印迹柱及非印迹柱的制备方法除了以下两点不同之外，其他与HRP印迹柱及非印迹柱的制备方法相同。①、将HRP替换成TRF；②、多巴胺和间氨基苯硼酸预聚液的聚合时间为90分钟（TRF的分子大小为4.5×5.8×13.6nm）。
实施例10：SEM表征硼亲和基础柱和HRP印迹柱
图8为硼亲和基础柱（图8A，图8B）和HRP印迹柱（图8C，图8D）的SEM表征图，显然，两者都有着与毛细管内壁紧密相连的整体柱床和很好的三维网络骨架，但印迹柱的聚合物颗粒显得更粗大，说明印迹聚合物层覆盖在基体材料上。
实施例11：HRP印迹柱专一性识别模板糖蛋白的考察
称量一组等质量的蛋白样品溶于生理pH的磷酸盐缓冲液中，每个样品均为1mg/mL，包括HRP，Thrombin（凝血酶），OVA（鸡卵清白蛋白），RNase（核糖核酸酶）A，RNase（核糖核酸酶）B和TRF（转铁蛋白）。用高效液相色谱考察HRP印迹柱在pH7.4和pH3.0时专一性识别模板糖蛋白的能力，每个样品进样量600nL。结果分别如图9和图11A。显然，高pH下，HRP印迹柱能选择性保留模板；低pH下，HRP印迹柱对模板蛋白仍然有很好的选择性分离能力。
实施例12：TRF印迹柱专一性识别模板糖蛋白的考察
称量一组等质量的蛋白样品溶于生理pH的磷酸盐缓冲液中，每个样品均为1mg/mL，包括HRP，Thrombin，OVA，RNase A，RNase B和TRF。用高效液相色谱考察TRF印迹柱在pH7.4和pH3.0时专一性识别模板糖蛋白的能力，每个样品进样量600nL。结果分别如图10和图11B。显然，高pH下，TRF印迹柱选择性保留能力很好，非特异作用小；低pH下，TRF印迹柱对模板蛋白仍然有很好的选择性分离能力。
实施例13：TRF印迹柱用于人血清中TRF的选择性抓取与分离
标准人血清样品用超纯水稀释20倍后置于冰箱中-20℃冷冻备用。解冻后取10μL注入TRF印迹柱，收集经印迹柱流出的血清样品，20μL水冲洗残余样品后用20μL HAc（0.1M）洗脱被保留的部分并收集，最后进行MALDI-TOF MS分析。结果如图12。显然，TRF印迹柱能选择性抓取人血清样品中的TRF，说明该柱有良好的专一性识别能力，且抗干扰能力强。
Claims (10)
1.一种可控、通用的定向表面印迹方法，其特征在于，先通过硼亲和作用将模板糖蛋白锚定于基体材料表面，再利用可自聚合的化合物在水相中的自聚合形成的聚合物形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的一种可控、通用的定向表面印迹方法，其特征在于，所述基体材料是取代硼酸功能化基体材料，所述模板糖蛋白通过取代硼酸功能化基体材料表面上的硼酸配基的硼亲和作用锚定。
3.根据权利要求2所述的一种可控、通用的定向表面印迹方法，其特征在于，所述取代硼酸功能化基体材料是二维或三维结构。
4.根据权利要求2所述的一种可控、通用的定向表面印迹方法，其特征在于，所述取代硼酸可以是含有羟基、醛基、羧基、巯基、不饱和键或氨基等活性基团的苯硼酸或杂环硼酸。
5.根据权利要求1所述的一种可控、通用的定向表面印迹方法，其特征在于，所述可自聚合的化合物是由多巴胺与间氨基苯硼酸等摩尔比组成的共聚物，或者其他能在水相中自聚且可控性好的单体。
6.根据权利要求1所述的一种可控、通用的定向表面印迹方法，其特征在于，所述分子印迹聚合物的厚度通过控制反应条件控制在模板蛋白分子三维尺寸的其中一维的三分之一至三分之二。
7.根据权利要求1所述的一种可控、通用的定向表面印迹方法，其特征在于，所述酸性条件是酸性溶液。
8.利用权利要求1所述的一种可控、通用的定向表面印迹方法制备的分子印迹聚合物。
9.权利要求8所述的分子印迹聚合物在糖蛋白的专一识别、富集、纯化、分离和检测方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述分子印迹聚合物在有或无硼亲和作用两种模式下专一性识别模板糖蛋白，且通过调节pH来调节作用强弱，以满足上述不同的应用。
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