CN108355625A

CN108355625A - 一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108355625A
Application number: CN201810134917.9A
Authority: CN
Inventors: 朱恒佳; 潘建明; 刘金鑫; 夏可旭
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Guangzhou Jinkui Biotechnology Co.,Ltd.; Hefei Jiuzhou Longteng Scientific And Technological Achievement Transformation Co ltd
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN108355625B

Abstract

本发明涉及一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物及其制备方法和应用，属医药功能材料制备技术领域；本发明首先将核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒使用团队硼亲和分子进行修饰，使其表面硼酸功能化，其次，将修饰过的Fe₃O₄@PGMA与模板糖蛋白共同培养，将模板蛋白固定于粒子表面化，氧化引发苯胺聚合后进行一系列处理后得到吸附剂，并将吸附剂用于中性条件下糖蛋白的选择性识别和分离；制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物制备简单，能够有效避免调节pH造成的二次污染，重复利用性好，在中性条件下对糖蛋白具有较高的吸附容量，具有明显的糖蛋白识别性能，并且能够很好维持糖蛋白的生物活性。

Description

一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种印迹聚合物的制备方法，尤其涉及一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物及其制备方法和应用，属于医药功能材料制备技术领域。

背景技术

糖蛋白广泛分布于各种组织和细胞中，具有重要的生物学功能，如参与细胞粘附及信号传导，免疫及炎症反应和精卵识别等。分离并检测糖蛋白，特别是分离可以作为癌症标记物的糖蛋白具有重要的意义。因此，需要一种能够有效选择性分离糖蛋白并保持其生物活性的方法。

吸附是一种从复杂生物样品中分离糖蛋白的有效方法，然而在实际应用过程中选择性有待提高。分子印迹技术是一种用于制备分子印迹聚合物（Molecular ImprintedPolymers，MIPs）的技术，这种MIPs能对目标物有选择性地快速有效去除，并且能够重复利用。然而通过传统方法，如沉淀聚合，将模板分子，功能单体和交联剂共同在溶液中引发聚合后，再洗脱模板制备MIPs的方法。对于糖蛋白这类生物大分子存在模板难以洗脱，目标分子难以进入识别位点，吸附效果差等缺点。而表面印迹因为其印迹位点多位于吸附剂表面或接近于表面，更有利于糖蛋白等大分子进入分子印迹腔，有助于提高吸附选择性，因此制备表面印迹糖蛋白的吸附剂用于选择性分离糖蛋白具有重要的应用前景。

硼亲和因其对含糖生物样品具有特异吸附性及可控释放性被广泛用于糖蛋白的吸附分离。传统的硼亲和吸附剂往往采用具有较高pKa值的硼酸单体，只能在碱性环境中才能与糖蛋白结合，这造成了操作的不便，并且碱性环境会增加糖蛋白变性的风险。已经报道有多种方法来合成低pKa值的硼酸，如引入吸电子基团，Wulff型硼酸和增强Wulff硼酸等。但是这些方法一般都需要复杂的合成和纯化步骤，而团队硼亲和通过一个常规的苯硼酸或其他取代硼酸和一个含有氨基的分子组成分子间的硼-氮配位键。硼-氮配位的存在降低了取代硼酸的 pKa 值，使得该分子团队在中性 pH 下的亲和能力大大增强；同时，由于该分子团队整体呈电中性，消除了静电相互作用的干扰，极大增强了专一性。并且，可以有效避免合成新单体和调节pH的复杂过程。然而，以团队硼亲和作为识别位点的表面印迹聚合物还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中印迹吸附剂在生理条件下对糖蛋白吸附分离效果差，选择性低，生物活性容易缺失的缺陷，而提供了一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法。

因此，本发明通过在纳米颗粒表面修饰团队硼亲和单体，然后氧化聚合形成表面印迹层，制备了团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs），可以在中性条件下高效的选择性分离糖蛋白，并维持其较好的生物活性。

本发明首先将3-氨基苯硼酸（APBA）和 1，6-己二胺溶解在乙醇中，随后搅拌让其通过B-N配位键形成团队硼亲和分子（TBA），然后将核壳结构的具有环氧键的Fe₃O₄@PGMA纳米粒子分散于上述溶液中，经过开环反应将TBA分子修饰在Fe₃O₄@PGMA纳米粒子表面，得到TBA修饰的磁性纳米颗粒（Fe₃O₄@PGMA-TBA）。

表面印迹聚合物的形成通过将Fe₃O₄@PGMA-TBA和模板蛋白（鸡蛋白蛋白，OVA）分散在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，静置让OVA与TBA通过硼亲和作用固定在表面。最后将固定有蛋白的Fe₃O₄@PGMA-TBA分散在含有苯胺（ANI）的PBS中，加入过硫酸铵（APS）作为引发剂，制备得到OVA表面印迹聚合物（TBA-MIPs）用于中性条件下糖蛋白的选择性吸附与分离。

具体的，本发明采用的技术方案是：

本发明首先提供一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物，所述聚合物为核-壳-壳三层结构，表面印迹层为10-20 nm，使用的配体为3-氨基苯硼酸与1,6-己二胺配位形成的团队硼亲和分子，印迹位点位于聚合物表面，存在大量的识别位点，吸附容量大。

本发明还提供一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，具体的，包括如下步骤：

（1）TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备：

首先，对Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒进行表面修饰，先将3-氨基苯硼酸与1，6-己二胺分散在乙醇中，随后搅拌一定时间来形成B-N配位的团队硼亲和分子；然后加入核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒并且回流反应一段时间，然后在真空干燥箱中干燥至恒重，得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒（Fe₃O₄@PGMA-TBA）。

其中，所述的3-氨基苯硼酸、1，6-己二胺和乙醇的用量为0.1-0.2 g：0.1-0.15 g：20-60 mL；

所述搅拌的条件为在30-60 ℃下搅拌30-90 min；

所述核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒的用量为0.025-0.075 g；

所述回流反应的条件为在60-100℃ 回流反应12h。

（2）糖蛋白表面印迹聚合物的制备：

首先，将模板蛋白鸡蛋白蛋白和步骤（1）得到的 Fe₃O₄@PGMA-TBA加入到pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，超声分散5-15 min，随后在暗处静置一段时间，让鸡蛋白蛋白与Fe₃O₄@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起；再将Fe₃O₄@PGMA-TBA通过离心分离，并且用去离子水清洗除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白；将清洗干净的Fe₃O₄@PGMA-TBA重新分散在磷酸盐缓冲溶液中，在机械搅拌500-800 rpm下加入过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物（TBA-MIPs）；接着将得到的产物离心分离，并且用乙醇洗涤除去未反应物质，再将产物在冰醋酸/水混合溶液（V/V， 1/9）中透析一周去除模板蛋白；最后真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。

其中，所述的鸡蛋白蛋白、 Fe₃O₄@PGMA-TBA和磷酸盐缓冲溶液的用量为0.005-0.015 g ：0.025-0.075 g：20-40 mL；

所述静置的时间为0.5-1.5 h；

所述分散清洗干净的Fe₃O₄@PGMA-TBA所需要的磷酸盐缓冲溶液为20-40 mL，含有5-15μL苯胺，pH=7.4；

所述加入过硫酸铵的量为0.005-0.015 g。

作为对比，不加模板蛋白 OVA制备团队硼亲和的糖蛋白表面非印迹聚合物（TBA-NIPs），不加1,6-己二胺制备普通苯硼酸表面印迹聚合物（APBA-MIPs）。

与现有技术相比较，本发明的有益效果体现在如下方面：

传统的硼酸功能化吸附剂往往在碱性条件下才能对糖蛋白进行选择性识别，碱性的环境会导致糖蛋白活性的丧失，而且调节pH的过程复杂繁琐，容易造成二次污染。此外，传统的印迹聚合物通常采用沉淀聚合等聚合方法，这导致了印迹位点包埋过深，目标分子难以被吸附分离，尤其是糖蛋白等生物大分子更难进入识别位点。因此，本发明首先将3-氨基苯硼酸与1,6-己二胺进行配位形成团队硼亲和分子，并通过开环反应固定在粒子表面，B-N配位键的形成能够有效的降低硼酸单体的pKa值；其次，通过硼亲和将模板蛋白吸附在粒子表面，并通过苯胺的氧化聚合在粒子表面形成表面印迹层；随后以OVA为模型蛋白研究了选择性吸附分离的行为和机理，最大吸附量为190.7 mg g^-1。选择性实验结果表明TBA-MIPs对OVA具有特异性识别和选择性吸附的能力，圆二色谱表明吸附分离后的OVA仍然具有较好的生物活性。

该方法使用的团队硼亲和，通过常规的硼酸单体与含有氨基的化合物形成B-N配位键能有效降低硼酸配体的pKa值，从而能够在中性条件下对糖蛋白进行吸附，避免了调节pH的过程，能更好的保持其生物活性，并且避免了调节pH造成的二次污染。此外，由于不需要合成新的硼酸单体，节约了合成和纯化的成本，更具操作性。并且由于印迹位点处于聚合物表面，解决了印迹位点包埋过深的问题，有利于糖蛋白这一类大分子扩散至印迹腔，提高了吸附效率和印记效果，同时扩大了吸附剂的应用范围。

附图说明

图1 为实施例 1中制备团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）的示意图。

图2为没有任何修饰的四氧化三铁(a)、四氧化三铁修饰上带环氧键的聚合物(b)和实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物TBA-MIPs（c）的TEM图。

图3为实施例1中制备得到的Fe₃O₄@PGMA, Fe₃O₄@PGMA-TBA和TBA/MIPs的红外光谱图。

图4为实施例1中制备得到的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）的XPS图。

图 5为实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）、团队硼亲和糖蛋白表面非印迹聚合物（TBA-NIPs）、普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（APBA-MIPs）的吸附容量及拟合结果图。

图 6为实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）、团队硼亲和糖蛋白表面非印迹聚合物（TBA-NIPs）、普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（APBA-MIPs）三种吸附剂吸附量受pH影响的结果图。

图 7为实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）、团队硼亲和糖蛋白表面非印迹聚合物（TBA-NIPs）、普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（APBA-MIPs）三种吸附剂对蛋白辣根过氧化物酶（HRP）、非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)为鸡蛋白蛋白（OVA）吸附容量选择性结果图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中识别性能评价按照下述方法进行：

利用静态吸附实验完成,将10 mL一定浓度的OVA溶液加入到离心管中，加入一定量的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs），放在25℃恒温水域中静置若干小时，吸附后OVA含量用紫外可见分光光度计测定，并根据结果计算出吸附容量；饱和吸附后，选择几种其他蛋白质，作为竞争吸附物，参与研究TBA-MIPs聚合物的选择性识别性能；通过几种不同pH值下的吸附量，研究TBA-MIPs中性条下的吸附效果。

下面结合具体实施实例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1：

（1）TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备：

首先，对Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒进行表面修饰。先将0.1g 3-氨基苯硼酸与0.1g 1，6-己二胺分散在 20mL的乙醇中，随后在30 ℃下搅拌30 min来形成B-N配位的团队硼亲和分子。然后加入0.025 g 核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒并且在60℃ 回流12h，然后在40 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒（Fe₃O₄@PGMA-TBA）。

（2）糖蛋白表面印迹聚合物的制备：

首先，将0.005 g模板蛋白鸡蛋白蛋白和0.025 g步骤（1）得到的 Fe₃O₄@PGMA-TBA加入到20 mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，超声分散5min，随后在暗处静置0.5h，让鸡蛋白蛋白与Fe₃O₄@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起。随后，将Fe₃O₄@PGMA-TBA通过离心分离，并且用去离子水清洗3遍除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白；将清洗干净的Fe₃O₄@PGMA-TBA重新分散在20 mL含有5 uL苯胺的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，在机械搅拌500 rpm下加入0.005 g的过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物（TBA-MIPs）；接着将得到的产物离心分离，并且用乙醇洗涤3次除去未反应物质，再将产物在冰醋酸/水混合溶液（V/V， 1/9）中透析一周去除模板蛋白；最后在40℃真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。

图1 为实施例 1中制备团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）的示意图，首先3-氨基苯硼酸与1,6-己二胺自组装形成团队硼亲和分子（TBA），然后通过开环聚合将TBA分子固定，随后通过硼亲和作用在表面吸附模板蛋白，再通过苯胺的氧化聚合得到表面印迹层，洗脱模板后得到TBA-MIPs。

图2为没有任何修饰的四氧化三铁(a)、四氧化三铁修饰上带环氧键的聚合物(b)和实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物TBA-MIPs（c）的TEM图，从图中明显的核壳结构可知修饰成功；图(c)是最终得到的TBA-MIPs的TEM图，从图中三层核-壳-壳结构可知印迹层约10-20 nm厚，印迹聚合物被成功制备。

图3为实施例1中制备得到的Fe₃O₄@PGMA, Fe₃O₄@PGMA-TBA和TBA/MIPs的红外光谱图。对比可知，在Fe₃O₄@PGMA-TBA曲线中新出现在1381 cm^-1 和 1652 cm^-1处强的吸收峰，分别为B-O的伸缩振动和N-H的面内弯曲振动，表明TBA分子被成功引入Fe₃O₄@PGMA表面；而在TBA/MIPs曲线处出现的1158和 864 cm^-1吸收峰为苯胺C-H的伸缩振动，表明成功形成印记层，印迹聚合物被成功制备。

图4为实施例1中制备得到的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）的XPS图，从图中可以观察到C 1s（283 eV），N 1s（398 eV）,O 1s（530 eV），Si 2p （100 eV）和B1s（189 eV）,表面TBA分子被成功修饰到了粒子表面，并且所有元素表明TBA-MIPs被成功制备。

实施例2：

（1）TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备：

首先，对Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒进行表面修饰。先将0.167 g 3-氨基苯硼酸与0.138 g1，6-己二胺分散在 40 mL的乙醇中，随后在40 ℃下搅拌60 min来形成B-N配位的团队硼亲和分子。然后加入0.050 g 核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒并且在60-100℃ 回流12h，然后在40-60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4@PGMA-TBA）。

（2）糖蛋白表面印迹聚合物的制备：

首先，将0.010 g模板蛋白鸡蛋白蛋白和0.050 g步骤（1）得到的Fe₃O₄@PGMA-TBA加入到30 mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，超声分散10 min，随后在暗处静置1 h，让鸡蛋白蛋白与Fe3O4@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起。随后，将Fe3O4@PGMA-TBA通过离心分离，并且用去离子水清洗3遍除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白；将清洗干净的Fe₃O₄@PGMA-TBA重新分散在30 mL含有10 uL苯胺的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，在机械搅拌600 rpm下加入0.010 g的过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物（TBA-MIPs）；接着将得到的产物离心分离，并且用乙醇洗涤3次除去未反应物质，再将产物在冰醋酸/水混合溶液（V/V， 1/9）中透析一周去除模板蛋白；最后在40℃真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。

实施例3：

（1）TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备：

首先，对Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒进行表面修饰。先将0.2 g 3-氨基苯硼酸与0.15 g 1，6-己二胺分散在 60 mL的乙醇中，随后在60 ℃下搅拌390 min来形成B-N配位的团队硼亲和分子。然后加入0.075 g 核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒并且在100℃ 回流12 h，然后在60℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4@PGMA-TBA）。

（2）糖蛋白表面印迹聚合物的制备：

首先，将0.015 g模板蛋白鸡蛋白蛋白和0.075 g步骤（1）得到的 Fe₃O₄@PGMA-TBA加入到40 mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，超声分散15 min，随后在暗处静置1.5 h，让鸡蛋白蛋白与Fe₃O₄@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起。随后，将Fe₃O₄@PGMA-TBA通过离心分离，并且用去离子水清洗3遍除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白；将清洗干净的Fe₃O₄@PGMA-TBA重新分散在40 mL含有15 uL苯胺的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，在机械搅拌800 rpm下加入0.015 g的过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物（TBA-MIPs）；接着将得到的产物离心分离，并且用乙醇洗涤3次除去未反应物质，再将产物在冰醋酸/水混合溶液（V/V， 1/9）中透析一周去除模板蛋白；最后在40℃真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。

实施例4：

取10mL初始浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL的OVA溶液，OVA溶解在磷酸盐缓冲溶液中（20 mM， pH=7.4）加入到三组离心管中，一组离心管中分别加入10mg实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）作为测试液，同样的，另一组离心管加入团队硼亲和糖蛋白表面非印迹聚合物（TBA-NIPs）作为对比，最后一组加入普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（APBA-MIPs）作为对比。将测试液和对比液放在25℃的水浴中静置50 min，离心机分离收集，未吸附的OVA分子浓度用紫外可见分光光度计测定，并根据结果计算出吸附容量。图 5 为试验例 1 中三种吸附剂的吸附容量及拟合图，结果表明，达到吸附平衡时团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）的最大吸附容量是190.7 mg/g，并且符合 Langmuir模型，在相同温度下比非印迹聚合物（TBA-NIPs）和普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（APBA-MIPs）要高，说明TBA-MIPs是一种有效识别和去除OVA的良好的吸附剂。

实施例5：

选择 pH 值6.0、7.4 、8.5作为影响测试值，用三种不同pH的缓冲溶液分别配置10 mL初始浓度为0.8 mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液于三离心管中，一组离心管中加入10 mg实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（TBA-MIPs）作为测试液，同样的，另一组离心管加入团队硼亲和糖蛋白表面非印迹聚合物（TBA-NIPs）作为对比，最后一组加入普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物（APBA-MIPs）作为对比。

把测试液放在25℃的水浴振荡器中，在50 min的时候取出；通过离心将印迹吸附剂和溶液分离开，滤液中的OVA浓度由紫外分光光度计在280 nm的波长下计算测定，并根据结果计算出吸附容量。

图 6 为三种吸附剂吸附量受pH影响的结果图，结果表明，在酸性条件下三种吸附剂对于鸡蛋白蛋白的吸附效果都较差，说明酸性环境中硼酸并不能与糖蛋白产生较好的作用。而在中性条件下，TBA-MIPs相比于TBA-NIPs和APBA-MIPs都具有更加好的吸附效果，证明TBA-MIPs由于存在团队硼亲和分子具有更好的吸附效果。而碱性环境中，TBA-MIPs的吸附量也高于另外两种吸附剂，说明TBA-MIPs由于存在团队硼亲和配体以及表面印迹腔能够更加有利于糖蛋白进入印迹腔，尤其是在中性环境中拥有优于一般硼酸配体的吸附效果。

实施例6：

选择糖蛋白辣根过氧化物酶（HRP）、非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)为鸡蛋白蛋白（OVA）竞争吸附蛋白质，配置HRP、BSA、OVA的单组分溶液，三种物质的浓度都为0.8 mg/mL，pH为7.4。分别取10 mL配置好的溶液分别加入到三个离心管中，然后分别加入10 mg实施例1中的TBA-MIPs吸附剂，把测试液放在25℃的水浴中分别静置50 min，静置时间完成后，上层清液用高速离心分离收集，未吸附的各种竞争吸附蛋白质浓度用紫外分光光度计测定，结果表明，TBA-MIPs对HRP、BSA和OVA的吸附容量分别为190.7 mg/g，156.2mg/g和80.78 mg/g。图 7 为试验例 3中三种吸附剂对三种蛋白吸附容量选择性图，结果表明，TBA-MIPs对OVA有显著的专一识别性，吸附容量高于其它蛋白质。

Claims

1.一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物，其特征在于，所述聚合物为核-壳-壳三层结构，表面印迹层为10-20 nm，所述团队硼亲和分子为3-氨基苯硼酸与1,6-己二胺。

2.权利要求1所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备：

首先，对Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒进行表面修饰，先将3-氨基苯硼酸与1，6-己二胺分散在乙醇中，随后搅拌一定时间来形成B-N配位的团队硼亲和分子；然后加入核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒并且回流反应一段时间，然后在真空干燥箱中干燥至恒重，得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒；

（2）糖蛋白表面印迹聚合物的制备：

首先，将模板蛋白鸡蛋白蛋白和步骤（1）得到的 Fe₃O₄@PGMA-TBA加入到磷酸盐缓冲溶液中，超声分散后在暗处静置一段时间，让鸡蛋白蛋白与Fe₃O₄@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起；再将Fe₃O₄@PGMA-TBA通过离心分离，并且用去离子水清洗除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白；将清洗干净的Fe₃O₄@PGMA-TBA重新分散在磷酸盐缓冲溶液中，在机械搅拌下加入过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物；接着将得到的产物离心分离，并且用乙醇洗涤除去未反应物质，再将产物在冰醋酸/水混合溶液中透析一周去除模板蛋白；最后真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。

3.根据权利要求所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的3-氨基苯硼酸、1，6-己二胺和乙醇的用量为0.1-0.2 g：0.1-0.15 g：20-60 mL；所述搅拌的条件为在30-60 ℃下搅拌30-90 min。

4.根据权利要求所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述核壳结构的Fe₃O₄@PGMA纳米颗粒的用量为0.025-0.075 g。

5.根据权利要求所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述回流反应的条件为在60-100℃ 回流反应12h。

6.根据权利要求所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的鸡蛋白蛋白、 Fe₃O₄@PGMA-TBA和磷酸盐缓冲溶液的用量为0.005-0.015 g ：0.025-0.075 g：20-40 mL；所述静置的时间为0.5-1.5 h。

7.根据权利要求所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述分散清洗干净的Fe₃O₄@PGMA-TBA所需要的磷酸盐缓冲溶液为20-40 mL，含有5-15 μL苯胺，pH=7.4。

8.根据权利要求所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述加入过硫酸铵的量为0.005-0.015 g。

9.权利要求1所述的一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物在吸附分离糖蛋白中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为在中性或碱性条件下吸附分离糖蛋白。