CN108816202B - 一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料及其制备方法和应用，属于医药功能材料制备技术领域；本发明首先在带有环氧键的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子表面修饰亚氨基二乙酸并螯合铜离子形成金属离子亲和位点，其次，将修饰有金属离子亲和位点的PSG纳米粒子与模板糖蛋白分子OVA共同培养，将模板蛋白固定于粒子表面，氧化引发水溶性3‑氨基苯硼酸聚合后进行一系列处理后得到双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料，并将该材料用于糖蛋白的选择性识别和分离；本发明的制备过程简便易行，有效降低合成成本，双重识别位点使得PSG‑MIPs对于糖蛋白的吸附亲和性更强，有效增强了对糖蛋白的选择性吸附能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种表面印迹纳米材料的制备方法，尤其涉及一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料及其制备方法和应用，属于医药功能材料制备技术领域。
背景技术
糖蛋白已经被证明与多种疾病存在着密切的联系，例如糖尿病、癌症和免疫紊乱等。目前，糖蛋白在临床治疗中经常被用作诊断与治疗标记物。因此，从复杂生物样品中捕获并检测糖蛋白具有极高医疗价值。
硼亲和法因为其与顺式二羟基化合物间可逆的共价作用而被广泛用于糖蛋白的分离。在碱性环境中，硼酸与糖蛋白形成分子共价键合，可形成五元或者六元硼酸环酯，当环境变为酸性时硼酸环酯则被破坏，重新释放出糖蛋白分子。因此，硼亲和法pH响应的优点，可实现对糖蛋白的可控吸附与解吸附。虽然硼亲和具有可逆亲和释放的优势，但却无法将目标糖蛋白从其类似物中分离出来。因此，发展一种新的具有较高选择性与良好抗干扰性的方法用于实际样品分析过程中糖蛋白的预处理是非常必要的。
分子印迹技术是实现分子识别的重要手段，已经成为一种有效的样品前处理方法。但是糖蛋白分子结构复杂、尺寸大、难以传递与洗脱，因而极大的限制了分子印迹技术在糖蛋白分子分离中的应用。表面印迹技术制备的印迹聚合物，印迹空腔接近或位于表面，因而可以确保目标糖蛋白分子的洗脱及再吸附。将硼亲和与表面印迹技术相结合制备硼亲和表面印迹聚合物并用于糖蛋白的选择性分离已有报道。但是现有的硼亲和表面印迹聚合物还存在以下问题：(1) 通常都需要先进行硼酸修饰，固定蛋白再进行印迹聚合，步骤繁琐，硼酸单体利用率不高；(2) 单一硼亲和识别方式，对糖蛋白的亲和性较低；(3) 表面印迹层种类单一，聚合条件苛刻，难以实现水相等温和条件下制备。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中硼亲和表面印迹吸附剂制备过程繁琐，且单一硼亲和识别作用吸附效果较差的缺陷，而提供了一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料及其制备方法。
因此，本发明通过在带有环氧键的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子表面修饰亚氨基二乙酸，并螯合铜离子形成金属离子亲和位点，固定模板蛋白分子后，氧化3-氨基苯硼酸单体形成表面印迹聚合层，制备了双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)。
本发明首先以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)为功能单体、二乙烯基苯(DVB)为交联剂在水溶液中通过无皂乳液聚合制备具有环氧键的PSG纳米粒子；随后，通过开环反应将亚氨基二乙酸(IDA)枝接于PSG表面，使得粒子表面存在带有负电荷的羧基，继而螯合带有正电荷的Cu2+形成金属离子亲和位点。
表面印迹纳米材料的形成是通过将带有金属离子亲和位点的PSG纳米粒子和模板蛋白卵清白蛋白（OVA)分散在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，让OVA通过与Cu2+的配位作用预先固定于PSG表面，接着加入3-氨基苯硼酸(APBA)，引发APBA氧化聚合形成具有硼亲和作用的表面印迹聚合层；洗去模板蛋白分子，最终得到具有双重识别位点的表面印迹纳米材料PSG-MIPs。
具体的，本发明采用的技术方案是：
本发明首先提供一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料，所述纳米材料，使用的识别作用方式为铜离子提供的金属离子亲和作用与3-氨基苯硼酸提供的硼亲和作用，表面印迹层通过3-氨基苯硼酸氧化自聚形成，印迹空腔位于聚合物表面，对目标糖蛋白分子识别能力更强，吸附容量大且制备简便。
本发明还提供一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，具体的，包括如下步骤：
(1) 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子的制备：
将GMA、DVB和St加入三口烧瓶中，随后加入100 mL双蒸水并插入温度计和氮气导管，在氮气氛围下持续搅拌并加热。当温度达到71℃时，加入过硫酸钾溶液引发聚合，反应一定时间结束后，将产物通过离心分离，并用乙醇与双蒸水分别对产物分别洗涤，随后将产物分散于双蒸水中备用，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液。
其中，所述的GMA、DVB、St的用量分别为1.5-3.0 mL、0.05-1.0 mL、0.2-0.6 mL；
所述加入过硫酸钾溶液的量为1.5-2.5 mL，浓度为0.03g/mL；
所述反应时间为6.0-9.0 h。
(2) 表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)的制备：
在三口烧瓶中分别加入IDA和NaOH，随后加入步骤(1)中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液，超声分散后用NaOH调节溶液pH为碱性，优选pH为11，并将烧瓶置于水浴中，加热反应一段时间。反应结束后，得到的产物PSG/IDA通过离心分离并用双蒸水洗涤至中性。将洗涤干净的PSG/IDA分散于双蒸水中，加入CuSO4搅拌溶解，并于室温下反应过夜。最后将得到的产物蓝色的PSG/IDA-Cu2+用双蒸水洗涤多次，并在40℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)。
其中，所述的IDA、NaOH和PSG分散液的用量分别为 1.0-2.5g、1.0-1.5g、100mL；
所述反应温度为70-90 ℃；
所述反应时间为10-14 h；
所述加入CuSO4的量为1.0-3.0 g。
(3) 双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)的制备：
将步骤(2)中得到的，得到表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)和模板蛋白卵清白蛋白(OVA)加入烧瓶中，随后加入PBS缓冲溶液，超声分散后在4.0 ℃环境中静置，使卵清白蛋白(OVA)通过螯合作用于粒子表面。而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次，直至洗涤液中无法测试出卵清白蛋白(OVA)。将粒子再次分散于PBS缓冲溶液中，并加入APBA，搅拌溶解后缓慢滴入过硫酸铵溶液(15 mg/mL)，室温反应一段时间，将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤。随后用含有5% SDS的醋酸溶液(pH=4.0)洗涤产物，直至用UV-vis光谱检测不到卵清白蛋白(OVA)的吸收峰。最终产物(PSG-MIPs)用双蒸水洗至中性，并且在45℃下真空干燥。
其中，所述的步骤(2)中得到的表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)和模板蛋白卵清白蛋白(OVA)的用量分别为 40-60 mg和5-15 mg；
所述PBS缓冲溶液(pH=8.5)用量为10-20 mL；
所述静置时间为0.5-1.5 h；
所述再次分散使用PBS缓冲溶液的量为10-20 mL；
所述加入APBA和过硫酸铵溶液的量为70-85 mg和400-600 μL；
所述反应时间为2.0-4.0 h；
作为对比，重复上述操作不加模板蛋白卵清白蛋白(OVA)制得双重识别位点非印迹聚合物(PSG-NIPs)，不加铜离子制备单一识别位点表面印迹聚合物(S-MIPs)以及单一识别位点表面非印迹聚合物(S-NIPs)。
本发明的有益效果为：
传统的硼亲和表面印迹吸附剂通常都需要通过复杂的表面修饰手段将硼酸基团修饰至基质材料表面，再通过高温聚合形成表面印迹聚合层。繁琐的制备过程带来了高昂的制备代价，并且使用有机溶剂会造成环境污染，此外苛刻的制备条件会导致糖蛋白的降解与失活。而且传统硼酸印迹吸附剂往往只具有硼亲和这一单一的识别作用，因此对糖蛋白的识别能力与结合强度通常都较弱。因此，本发明首先在具有环氧键的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)表面修饰形成金属离子亲和位点，固定模板蛋白分子后采用水溶性的APBA在缓冲溶液中温和氧化交联形成既是硼亲和作用位点又是表面印迹聚合层的聚3-氨基苯硼酸印迹壳层。随后以卵清白蛋白(OVA)为模型蛋白研究了选择性吸附分离的行为和机理，最大吸附量为138.92 mg/g。选择性实验结果表明PSG-MIPs对卵清白蛋白(OVA)具有特异性识别和选择性吸附的能力。实际样品SDS-PAGE凝胶电泳分析表明本发明中的双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)可以用于实际样品的选择性分离。
因此，本发明制备的双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)同时采用金属离子亲和与硼亲和双重作用方式，能够有效的弥补单一识别作用蛋白辨识能力弱的问题；3-氨基苯硼酸则具有良好的水溶性，可以通过温和的氧化交联聚合方式，形成的聚3-氨基苯硼酸作为印迹层既能有效避免传统硼亲和表面印迹聚合物制备过程的繁琐，又能实现识别单体即是印迹单体的目的，简单易得，制备条件温和，成本低廉。
本发明的制备方法中使用3-氨基苯硼酸作为印迹单体与硼酸配体，在形成印迹聚合层的同时形成表面印迹位点，有效避免了传统硼酸印迹聚合物复杂的修饰制备过程，并且原料易得、价格低廉、制备条件温和。此外，金属离子亲和与硼亲和的协同作用，能更好的实现对糖蛋白的选择性亲和识别，改善了传统单一位点造成的结合力弱，吸附容量差的缺点，扩展了硼亲和表面印迹吸附的制备方法。
附图说明
图1 为实施例 1中制备双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)的示意图。
图2为实施例1中制备的双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)的SEM图片；图中图A是没有任何修饰的PSG的SEM 图片；图B为最终制备的PSG-MIPs的SEM图，图C与图D为相应的放大图。
图3为实施例1中制备得到的PSG、PSG/IDA-Cu2+与PSG-MIPs的红外谱图。
图4为试验例1中四种吸附剂PSG-MIPs、PSG-NIPs、S-MIPs、S-NIPs的吸附容量及拟合图。
图5为试验例2中四种吸附剂PSG-MIPs、PSG-NIPs、S-MIPs、S-NIPs对三种蛋白质HRP、OVA、BSA的选择性吸附容量图。
图6为试验例3中四种吸附剂PSG-MIPs、PSG-NIPs、S-MIPs、S-NIPs对实际样品分析的SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中识别性能评价按照下述方法进行：
利用静态吸附实验完成：将5.0 mL一定浓度的OVA溶液加入到离心管中，加入一定量的双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)，放在25℃恒温水域中静置若干小时，吸附后OVA含量用紫外可见分光光度计测定，并根据结果计算出吸附容量；饱和吸附后，选择几种其他蛋白质，作为竞争吸附物，参与研究PSG-MIPs聚合物的选择性识别性能。
下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
实施例1：
(1) 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液的制备：
将1.5 mL GMA、0.05 mL DVB和0.2 mL St加入250 mL三口烧瓶中，随后加入100mL双蒸水并插入温度计和氮气导管，在氮气氛围下持续搅拌并加热。当温度达到71 ℃时，加入1.5 mL 0.03 g/mL的过硫酸钾溶液引发聚合，反应6.0 h。反应结束后，将产物通过离心分离，并用乙醇与双蒸水分别洗涤三次，随后将产物分散于100 mL双蒸水，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液，备用。
(2) 表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒(PSG/IDA-Cu2+)的制备：
在250 mL三口烧瓶中分别加入1.0 g IDA和1.0 g NaOH，随后加入100 mL步骤(1)中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液，超声分散后用NaOH调节溶液pH为11，并将烧瓶置于70 ℃的水浴中，加热反应10 h。反应结束后，将产物PSG/IDA通过离心分离并用双蒸水洗涤至中性。将洗涤干净的PSG/IDA分散于125 mL双蒸水中，加入1.0 g CuSO4搅拌溶解，并于室温下反应过夜。最后将蓝色的PSG/IDA-Cu2+用双蒸水洗涤多次，并在40 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)。
(3) 双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)的制备：
将40 mg步骤(2)中得到的，得到表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)和5 mg模板蛋白卵清白蛋白(OVA)加入25 mL烧瓶中，随后加入10 mL PBS缓冲溶液(pH=8.5)，超声分散后在4.0 ℃环境中静置0.5 h，使卵清白蛋白(OVA)通过螯合作用于粒子表面。而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次，直至洗涤液中无法测试出卵清白蛋白(OVA)。将粒子再次分散于10 mL PBS缓冲溶液中，并加入70 mg APBA，搅拌溶解后缓慢滴入400 μL过硫酸铵缓冲溶液(15 mg/mL)，室温反应2.0 h，将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤三次。随后用含有5% SDS的醋酸溶液(pH=4.0)洗涤产物多次,直至用UV-vis光谱检测不到卵清白蛋白(OVA)的吸收峰。最终产物用双蒸水洗至中性，并且在45 ℃下真空干燥，得到双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)。
作为对比，重复上述操作不加模板蛋白卵清白蛋白(OVA)制得双重识别位点非印迹聚合物(PSG-NIPs)，不加铜离子制备单一识别位点糖蛋白表面印迹聚合物(S-MIPs) 与单一识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(S-NIPs)。
图1 为实施例 1中制备双重识别位点表面印迹聚合物纳米材料(PSG-MIPs)的示意图，具体步骤如下：(1) 以GMA和St为功能单体、DVB为交联剂在水溶液中通过无皂乳液聚合制备具有环氧键的PSG纳米粒子；(2) 通过开环反应将IDA枝接于PSG表面，使得粒子表面存在带有负电荷的羧基，继而螯合带有正电荷的Cu2+；(3) 将糖蛋白模板分子通过与Cu2+的配位作用预先固定于PSG表面，接着加入APBA，引发APBA氧化聚合形成表面印迹层。洗去模板糖蛋白分子，最终得到具有双重识别位点的表面印迹奶材料PSG-MIPs。
图2为实施例1中制备的双重识别位点表面印迹聚合物(PSG-MIPs)的SEM图片，图A是没有任何修饰的PSG的SEM 图片； 图B为最终制备的PSG-MIPs的SEM图，图C与图D 为相应的放大图。从图中可以发现未修饰的PSG纳米粒子表面相对平滑，整体呈球状，而被聚3-氨基苯硼酸包裹后的PSG-MIPs表面则变得粗糙，并且形状不规则，粒子粒径也明显增大，这一结果证明APBA成功在PSG表面形成表面印迹层。
图3为实施例1中制备得到的PSG、PSG/IDA-Cu2+和PSG-MIPs的红外谱图，对比可知，与PSG的谱图结果相比，PSG/IDA-Cu2+的谱图中出现了两个新的吸收峰，分别为1630 cm-1处C-N的特征吸收峰和1430 cm-1处IDA骨架中的C-O振动峰，说明IDA成功枝接到了PSG表面。而PSG-MIPs红外谱图中，1121 cm-1、881 cm-1和929 cm-1处为芳香B-OH弯曲振动引起的弱吸收峰，1328 cm-1处特征吸收峰则来自于不对称的B-O伸缩振动，这都属于聚3-氨基苯硼酸的特征吸收峰。这些结果表明APBA印迹聚合层成功沉积于PSG表面。
实施例2：
(1) 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液的制备：
将2.348 mL GMA、0.064 mL DVB和0.46 mL St加入250 mL三口烧瓶中，随后加入100 mL双蒸水并插入温度计和氮气导管，在氮气氛围下持续搅拌并加热。当温度达到71 ℃时，加入2.0 mL 0.03g/mL的过硫酸钾溶液引发聚合，反应8.0 h。反应结束后，将产物通过离心分离，并用乙醇与双蒸水对产物分别洗涤三次，随后将产物分散于100 mL双蒸水中，分离，并用乙醇与双蒸水对产物分别洗涤三次，随后将产物分散于100 mL双蒸水中，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液，备用。
(2) 表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒(PSG/IDA-Cu2+)的制备：
在250 mL三口烧瓶中分别加入2.2 g IDA和1.3 g NaOH，随后加入100 mL步骤(1)中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液，超声分散后用NaOH调节溶液pH为11，并将烧瓶置于80 ℃的水浴中，加热反应12 h。反应结束后，将产物PSG/IDA通过离心分离并用双蒸水洗涤至中性。将洗涤干净的PSG/IDA分散于125 mL双蒸水中，加入2.0 g CuSO4搅拌溶解，并于室温下反应过夜。最后将蓝色的PSG/IDA-Cu2+用双蒸水洗涤多次，并在40 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)。
(3) 双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)的制备：
将50 mg步骤(2)中得到的表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)和10 mg模板蛋白卵清白蛋白(OVA)加入25 mL烧瓶中，随后加入15 mL PBS缓冲溶液(pH=8.5)，超声分散后在4.0 ℃环境中静置1.0 h，使卵清白蛋白(OVA)通过螯合作用于粒子表面。而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次，直至洗涤液中无法测试出卵清白蛋白(OVA)。将粒子再次分散于15 mL PBS缓冲溶液中，并加入75 mg APBA，搅拌溶解后缓慢滴入500 μL过硫酸铵缓冲溶液(15 mg/mL)，室温反应3.0 h，将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤三次。随后用含有5% SDS的醋酸溶液(pH=4.0)洗涤产物多次,直至用UV-vis光谱检测不到卵清白蛋白(OVA)的吸收峰。最终产物用双蒸水洗至中性，并且在45℃下真空干燥，得到双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)。作为对比，重复上述操作不加卵清白蛋白(OVA)制得双重识别位点非印迹聚合物(PSG-NIPs)，不加铜离子制备单一识别位点糖蛋白表面印迹聚合物(S-MIPs) 与单一识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(S-NIPs)。
实施例3：
(1) 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液的制备：
将3.0 mL GMA、1.0 mL DVB和0.6 mL St加入250 mL三口烧瓶中，随后加入100 mL双蒸水并插入温度计和氮气导管，在氮气氛围下持续搅拌并加热。当温度达到71 ℃时，加入2.5 mL 0.03g/mL的过硫酸钾溶液引发聚合，反应9.0 h。反应结束后，将产物通过离心分离，并用乙醇与双蒸水分别洗涤三次，随后将产物分散于100 mL双蒸水中，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液，备用。
(2) 表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒(PSG/IDA-Cu2+)的制备：
在250 mL三口烧瓶中分别加入2.5 g IDA和1.5 g NaOH，随后加入100 mL步骤(1)中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PSG)纳米粒子分散液，超声分散后用NaOH调节溶液pH为11，并将烧瓶置于90 ℃的水浴中，加热反应14 h。反应结束后，将产物PSG/IDA通过离心分离并用双蒸水洗涤至中性。将洗涤干净的PSG/IDA分散于125 mL双蒸水中，加入3.0 g CuSO4搅拌溶解，并于室温下反应过夜。最后将蓝色的PSG/IDA-Cu2+用双蒸水洗涤多次，并在40 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)。
(3) 双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)的制备：
将60 mg步骤(2)中得到的表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子(PSG/IDA-Cu2+)和15 mg模板蛋白卵清白蛋白(OVA)加入25 mL烧瓶中，随后加入20 mL PBS缓冲溶液(pH=8.5)，超声分散后在4.0 ℃环境中静置1.5 h，使清白蛋白(OVA)通过螯合作用于粒子表面。而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次，直至洗涤液中无法测试出清白蛋白(OVA)。将粒子再次分散于20 mL PBS缓冲溶液中，并加入85 mg APBA，搅拌溶解后缓慢滴入600 μL过硫酸铵缓冲溶液(15 mg/mL)，室温反应4.0 h，将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤三次。随后用含有5% SDS的醋酸溶液(pH=4.0)洗涤产物多次,直至用UV-vis光谱检测不到清白蛋白(OVA)的吸收峰。最终产物用双蒸水洗至中性，并且在45 ℃下真空干燥，，得到双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)。作为对比，重复上述操作不加清白蛋白(OVA)制得双重识别位点非印迹聚合物(PSG-NIPs)，不加铜离子制备单一识别位点糖蛋白表面印迹聚合物(S-MIPs)与单一识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(S-NIPs)。
试验例1：取5.0 mL初始浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和 1.0 mg/mL的卵清白蛋白(OVA)溶液，卵清白蛋白(OVA)溶解在磷酸盐缓冲溶液中(pH=8.5, 20 mM)分别加入到四组离心管中，一组离心管中分别加入5.0 mg实施例1中制备的双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)作为测试液，同样的，另一组离心管加入双重识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(PSG-NIPs)作为对比，最后两组分别加入单一识别位点糖蛋白表面印迹聚合物(S-MIPs)与单一识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(S-NIPs)作为对比。
将测试液和对比液放在25℃的水浴中静置3.0 h，离心机分离收集，未吸附的卵清白蛋白(OVA)分子浓度用紫外可见分光光度计测定，并根据结果计算出吸附容量。
图4为试验例1中四种吸附剂（PSG-MIPs、PSG-NIPs、S-MIPs、S-NIPs）的吸附容量及拟合图，结果表明，达到吸附平衡时双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)最大吸附容量是138.92 mg/g，并且符合 Langmuir模型，在相同温度下比双重识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(PSG-NIPs)和单一识别位点糖蛋白表面印迹聚合物(S-MIPs)要高，说明PSG-MIPs是一种有效识别和分离卵清白蛋白(OVA)的良好的吸附剂。
试验例2：选择糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)、非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)为卵清白蛋白(OVA)竞争吸附蛋白质，配制HRP、BSA、OVA的单组分溶液，三种物质的浓度都为0.7mg/mL，pH为8.5。分别取5.0 mL配置好的溶液分别加入到四组离心管中，一组离心管中分别加入5.0 mg实施例1中的双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)，把测试液放在25℃的水浴中分别静置90 min，静置完成后，上层清液用高速离心分离收集，未吸附的各种竞争吸附蛋白质浓度用紫外分光光度计测定。同样的，另一组离心管加入双重识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(PSG-NIPs)作为对比，最后两组分别加入单一识别位点糖蛋白表面印迹聚合物(S-MIPs)与单一识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(S-NIPs)作为对比。
图5为试验例2中四种吸附剂（PSG-MIPs、PSG-NIPs、S-MIPs、S-NIPs）对三种蛋白质的选择性吸附容量图，结果表明，PSG-MIPs对HRP、BSA和OVA的吸附容量分别为60.28 mg/g，40.11 mg/g和138.92 mg/g。表明PSG-MIPs对OVA有显著的专一识别性，吸附容量高于其它蛋白质。
试验例3：取5.0 mg实施例1中制备的双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)加入离心管中，随后加入5.0 mL用PBS缓冲溶液(pH 8.5, 20 mM)稀释250倍的鸡蛋清样品，将离心管置于25 ℃水浴振荡器中静态吸附90 min。随后通过离心分离吸附剂，取上清液，并将粒子用20 mL PBS缓冲溶液洗涤三次后，用醋酸溶液(pH 4.0, 20mM)洗脱捕获的卵清白蛋白(OVA)。分别将母液、上清液、洗脱液用于SDS-PAGE凝胶电泳分析。同样的，另一个离心管加入双重识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(PSG-NIPs)作为对比，最后两个分别加入单一识别位点糖蛋白表面印迹聚合物(S-MIPs)与单一识别位点糖蛋白表面非印迹聚合物(S-NIPs)作为对比。
图6为试验例3中四种吸附剂（PSG-MIPs、PSG-NIPs、S-MIPs、S-NIPs）对实际样品分析的SDS-PAGE凝胶电泳图，结果表明双重识别位点表面印迹纳米材料(PSG-MIPs)在实际样品分析中依旧具有良好的选择性吸附分离性能，能够分离出目标糖蛋白。图中OVA为卵清白蛋白(Ovalbumin)，OVT为卵转铁蛋白(Ovotransferrin)。
Claims (10)
1.一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG分散液的制备：
将甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA、二乙烯基苯DVB和苯乙烯St加入三口烧瓶中，随后加入双蒸水并插入温度计和氮气导管，在氮气氛围下持续搅拌并加热；当温度达到71 ℃时，加入过硫酸钾溶液引发聚合，反应一定时间后，将产物通过离心分离，并用乙醇与双蒸水对产物分别洗涤，随后将产物分散于双蒸水中，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG分散液，备用；
(2) 表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG/IDA-Cu2+的制备：
在三口烧瓶中分别加入亚氨基二乙酸IDA和NaOH，随后加入步骤(1)中得到的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG分散液，超声分散后用NaOH调节溶液pH，并将烧瓶置于水浴中，加热反应一段时间后，将产物PSG/IDA通过离心分离并用双蒸水洗涤至中性；将洗涤干净的PSG/IDA分散于双蒸水中，加入CuSO4搅拌溶解，并于室温下反应过夜；最后将蓝色的PSG/IDA-Cu2+用双蒸水洗涤多次，并在真空干燥箱中干燥至恒重，得到表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG/IDA-Cu2+；
(3) 双重识别位点表面印迹纳米材料PSG-MIPs的制备：
将步骤(2)中得到的表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG/IDA-Cu2+和模板蛋白卵清白蛋白OVA加入烧瓶中，随后加入磷酸PBS缓冲溶液，超声分散后静置，使卵清白蛋白OVA通过螯合作用于粒子表面；而后离心分离并用PBS缓冲溶液对分离出的粒子洗涤多次，直至洗涤液中无法测试出卵清白蛋白OVA；将洗涤后的粒子再次分散于PBS缓冲溶液中，并加入3-氨基苯硼酸APBA，搅拌溶解后缓慢滴入过硫酸铵溶液，室温反应一段时间，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别对产物洗涤；随后用含有质量浓度为5% SDS的醋酸溶液洗涤产物多次，直至用UV-vis光谱检测不到卵清白蛋白OVA的吸收峰，最终产物用双蒸水洗至中性，并且真空干燥，得到双重识别位点表面印迹纳米材料PSG-MIPs。
2. 根据权利要求1所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的GMA、DVB、St的用量分别为1.5-3.0 mL、0.05-1.0 mL、0.2-0.6mL。
3. 根据权利要求1所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述加入过硫酸钾溶液的量为1.5-2.5 mL，浓度为0.03g/mL；所述反应一定时间为6.0-9.0 h。
4. 根据权利要求1所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的IDA、NaOH和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG分散液的用量分别为 1.0-2.5g、1.0-1.5g、100mL。
5.根据权利要求1所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述NaOH调节溶液pH为碱性；所述加热反应温度为70-90 ℃，所述加热反应时间为10-14 h；所述加入CuSO4量为1.0-3.0 g。
6. 根据权利要求1所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的步骤(2)中得到的表面螯合Cu2+聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米粒子PSG/IDA-Cu2+和卵清白蛋白OVA的用量分别为 40-60 mg、5-15 mg。
7. 根据权利要求1所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述超声分散前加入的PBS缓冲溶液用量为10-20 mL，pH 为8.5；
所述静置条件为在4℃环境下静置0.5-1.5 h。
8.根据权利要求1所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述再次分散用PBS缓冲溶液的量为10-20 mL；所述加入APBA和过硫酸铵溶液的用量分别为70-85 mg和400-600 μL；所述反应时间为2.0-4.0 h。
9.权利要求1~8中任一项权利要求所述方法制备的双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料，其特征在于，所述纳米材料为单分散纳米材料，所述纳米材料的表面印迹层通过3-氨基苯硼酸氧化自聚形成，印迹空腔位于纳米材料表面；所述纳米材料具有金属离子亲和位点与硼亲和位点的双重识别位点。
10.权利要求9所述的一种双重识别位点糖蛋白表面印迹纳米材料在吸附分离糖蛋白中的应用。
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