CN109078614B - 一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药功能高分子材料制备技术领域，具体公开了一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法及应用。SiO2‑MIPs具有以下优势：1)采用枝状硼酸作为识别单体，相比于单链硼酸，枝状硼酸带来的多重共价键协同效应能够有效的增强SiO2‑MIPs对OVA的吸附亲和性与接触几率；2)枝状硼酸有效解决了传统硼酸亲水性弱的缺点，采用多巴胺作为印迹层也能够有效增强吸附剂的亲水性，从而减弱了由疏水作用导致的非特异性吸附，增强了吸附选择性；3)硼亲和作用可以通过调节环境pH控制，因而可以通过调节pH的方式实现对OVA的可控分离。综上所述，SiO2‑MIPs因为采用枝状硼酸与表面印迹技术，制备简便，选择性与亲和性强，所以在糖蛋白分离富集领域前景巨大。

Description

一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法 及应用
技术领域
本发明属于生物医药功能高分子材料制备技术领域，涉及一种适用于选择性分离糖蛋白的印迹聚合物的制备方法，尤其涉及一种枝状硼酸作为功能单体构建高效硼亲和印迹聚合物的制备方法及应用。
背景技术
蛋白质糖基化在众多生命活动中都起着关键的作用。此外，异常化的糖蛋白长期被认为与各种癌症的发生密切相关。对这些糖蛋白进行大规模分析不仅有助于发现新的诊断标记物，而且也为临床治疗提供了重要信息。然而，生物样品中糖蛋白固有的低丰度伴随着大量的干扰物为糖蛋白的分析造成了巨大的困难。因此，选择性富集糖蛋白是糖蛋白分析过程中必不可少的关键步骤。
硼亲和材料因为对含有顺式二羟基的化合物具有独特的亲和性，而被大量用于糖蛋白的分离富集。硼亲和材料能够在弱碱性水溶液中捕获糖蛋白，而在酸性条件下，硼酸酯键被破坏，目标糖蛋白能够被释放。虽然以上优点推动了硼亲和材料在糖蛋白分离领域的迅速发展。但是，作为糖蛋白分离吸附剂，硼亲和依旧存在着明显的缺陷，如对于单一硼酸位点而言，由于硼酸酯键作用强度相对较弱，因而其并不能有效的快速捕获糖蛋白这类复杂的生物大分子。为了解决这一问题，科研工作者提出了采用多重共价键协同作用的策略。虽然，采用多重共价键协同作用能够有效增强硼亲和材料对于糖蛋白的亲和能力，却无法解决硼亲和不能选择性识别某一特定糖蛋白的问题。
发明内容
本工作为了同时解决单一硼亲和位点作用较弱并且无法实现选择性分离目标糖蛋白的缺陷，在多重共价键协同作用的基础上进一步引入表面印迹技术。表面印迹技术是分子印迹技术在生物大分子领域的创新，印迹空腔靠近或分布于基质材料表面，能够充分解决传统印迹方式导致生物大分子包埋深、难洗脱、传质慢的缺陷。同时与模板分子尺寸形状一致的印迹腔能够有效的增强硼亲和材料对于糖蛋白的选择识别能力。因此，本发明通过在纳米颗粒表面修饰枝状硼酸结构，然后氧化聚合形成表面印迹层，制备了枝状硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(MIPs)，可以在中性条件下高效的选择性分离糖蛋白，并维持糖蛋白较好的生物活性。
本发明专利首先在SiO2表面修饰枝状多胺多乙烯多胺，随后通过胺醛缩合对SiO2进行硼酸改性，吸附模板糖蛋白OVA后，采用多巴胺作为印迹层单体在SiO2表面形成分子印迹层，除去模板后得到枝状硼酸功能化的糖蛋白表面印迹纳米颗粒(SiO2-MIPs)。多乙烯多胺是一种枝状多胺，其骨架上含有众多活性氨基能够与带有醛基的硼酸反应形成枝状硼酸，并能有效改善传统硼酸亲水性差的缺点。枝状硼酸的引入使得SiO2-MIPs表面具有更多的硼酸位点，从而能够更好的与糖蛋白表面的糖链结合，进而实现多重共价键协同作用增强亲和识别能力，而改善的亲水性则能够避免非特异性吸附。多巴胺印迹层采用温和的方式制备，在不损害糖蛋白结构的同时增强了吸附剂的选择性。结合多重表征手段与静态吸附实验等，我们研究了SiO2-MIPs对糖蛋白的选择性吸附能力。结果表明，SiO2-MIPs具有极佳的吸附亲和性，相比单链硼亲和吸附材料吸附选择性更好，可以作为糖蛋白前处理的候选材料。
本发明采用的具体技术方案，包括如下步骤：
(1)SiO2的制备
根据改进的
Figure GDA0002742753180000021
法制备SiO2纳米粒子，将正硅酸四乙酯(TEOS)与无水乙醇混合，并在25-45℃水浴条件下搅拌，随后缓慢加入氨水与双蒸水的混合溶液，反应8-16h，反应结束后，将得到的SiO2纳米粒子离心分离，并用无水乙醇与双蒸水洗涤多次，最后将洗涤过的粒子分散于无水乙醇中，得SiO2分散液，备用。
(2)氨基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-NH2)的制备
在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中，加入步骤(1)中得到的SiO2分散液与无水乙醇，超声分散均匀，置于45-55℃水浴中反应12h，反应结束后，将产物用无水乙醇洗涤多次后，得到SiO2-NH2纳米粒子，备用。
(3)醛基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-CHO)的制备
将步骤(2)中制得的SiO2-NH2纳米粒子溶于甲醇，而后加入戊二醛溶液，超声分散后用锡纸包裹避光，15-35℃反应8-24h，最后将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水清洗多次，25℃真空干燥至恒重，得到SiO2-CHO纳米粒子。
(4)多乙烯多胺枝接的SiO2(SiO2-多乙烯多胺)的制备
称取一定量多乙烯多胺和SiO2-CHO纳米粒子溶于甲醇，超声分散均匀，室温反应8-24h，每4小时加入一定量的硼氢化钠，反应结束后，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤3次，最后在45℃真空干燥箱中干燥12h，得到SiO2-多乙烯多胺。
(5)4-甲酰基苯硼酸修饰的纳米粒子(SiO2-4-甲酰基苯硼酸)的制备
将步骤(4)制得的SiO2-多乙烯多胺与一定量4-甲酰基苯硼酸分散溶解于甲醇中，室温下磁力搅拌反应8-24h，每4小时加入一定量的硼氢化钠，反应结束后，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤3次，最后在45℃真空干燥箱中干燥12h得到产物SiO2-4-甲酰基苯硼酸。
(6)枝状苯硼酸修饰表面印迹聚合物(SiO2-MIPs)的制备
称取步骤(5)制得的SiO2-4-甲酰基苯硼酸纳米粒子，分散于PBS缓冲溶液中，随后加入一定量的模板蛋白卵清白蛋白(OVA)，在4℃环境中静置1h，使OVA通过硼亲和作用吸附于粒子表面，而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次除去表面非特异性吸附的OVA，将粒子再次分散于一定量的双蒸水中，并加入一定量的盐酸多巴胺(DA)，搅拌溶解后缓慢滴入Tris-HCl缓冲溶液，室温反应2-10h，将产物离心分离并用无水乙醇与去离子水分别洗涤三次，随后用含有5％SDS的醋酸溶液洗涤产物多次直到在UV-vis光谱检测不到OVA的吸收峰，以除去模板分子OVA，用去离子水洗至中性，并且在45℃下真空干燥，得到最终产物SiO2-MIPs。
作为对比，重复上述操作不加OVA制得非印迹聚合物(SiO2-NIPs)。
作为对比，将多乙烯多胺换为单链的己二胺，重复上述步骤制备单链印迹聚合物(SC-MIPs)。
步骤(1)中，正硅酸四乙酯(TEOS)，无水乙醇，氨水和双蒸水的比例为(8-10g)：(120-240mL)，(8-12mL)：(9-10g)。
步骤(2)中，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和SiO2分散液体积比例为1-3：10，SiO2分散液的浓度0.22g/mL。
步骤(3)中，SiO2-NH2纳米粒子、甲醇和戊二醛溶液的比例为2.2g：10-50mL：2-6mL，其中，戊二醛溶液的体积百分浓度为25％。
步骤(4)中，多乙烯多胺，SiO2-CHO纳米粒子和每次加入的硼氢化钠比例为(1-5g)：(0.8-1.5g)：(30-100mg)。
步骤(5)中，SiO2-多乙烯多胺，4-甲酰基苯硼酸和每次加入硼氢化钠的比例为(0.1-0.3g)：(0.1-0.5g)：(30-100mg)。
步骤(6)中，SiO2-4-甲酰基苯硼酸纳米粒子，PBS缓冲溶液，模板蛋白卵清白蛋白(OVA)，盐酸多巴胺(DA)，双蒸水和Tris-Hcl缓冲溶液比例为(30-80mg)：(5-20mL)：(5-15mg)：(15-30mg)：(15-50mL)：(1-2mL)，其中，PBS缓冲溶液的pH＝8.5，Tris-Hcl缓冲溶液的pH＝8.8，浓度为1.5M，含有5％SDS的醋酸溶液的pH＝4.0。
将本发明制备的基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物SiO2-MIPs用于分离提纯蛋白卵清白蛋白OVA。
本发明的有益效果为：
本发明采用枝状硼酸作为识别单体结合表面印迹技术制备了一种新型的枝状硼酸修饰的糖蛋白表面印迹纳米颗粒(SiO2-MIPs)。SiO2-MIPs能够在60min内达到吸附平衡，最大吸附容量高达243.4mg/g，并且吸附选择性高、稳定性好。此外，SiO2-MIPs还具有以下优势：
(1)采用枝状硼酸作为识别单体，相比于单链硼酸，枝状硼酸带来的多重共价键协同效应能够有效的增强SiO2-MIPs对OVA的吸附亲和性与接触几率；
(2)枝状硼酸有效解决了传统硼酸亲水性弱的缺点，采用多巴胺作为印迹层也能够有效增强吸附剂的亲水性，从而减弱了由疏水作用导致的非特异性吸附，增强了吸附选择性；
(3)硼亲和作用可以通过调节环境pH控制，因而可以通过调节pH的方式实现对OVA的可控分离。综上所述，SiO2-MIPs因为采用枝状硼酸与表面印迹技术，制备简便，选择性与亲和性强，所以在糖蛋白分离富集领域前景巨大。
附图说明
图1为实施例1中制备的枝状硼酸糖蛋白表面印迹聚合物的TEM图片，(a)SiO2；(b)SiO2-4-甲酰基苯硼酸，图(c)显示的是最终得到的SiO2-MIPs；
图2为实施例1中制备得到的SiO2，SiO2@多乙烯多胺和枝状硼酸糖蛋白表面印迹聚合物的红外光谱图；
图3为实施例1中制备得到的枝装硼酸糖蛋白表面印迹聚合物的XPS图；
图4为试验例1中吸附实验数据图。
具体实施方式
实施例1：
(1)SiO2的制备
将8.74g正硅酸四乙酯(TEOS)与180mL无水乙醇混合，并在35℃水浴条件下搅拌，随后缓慢加入10mL氨水与9.46g双蒸水的混合溶液，反应12h。反应结束后，将得到的SiO2纳米粒子离心分离，并用无水乙醇与双蒸水洗涤多次，最后将洗涤过的粒子分散于10mL无水乙醇中备用。
(2)氨基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-NH2)的制备
将2mL3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)加入100mL三口烧瓶中，随后加入步骤(1)中得到的SiO2分散液与50mL无水乙醇，超声分散均匀，而后将烧瓶置于50℃水浴中反应过夜。反应结束后，将产物用无水乙醇洗涤多次后备用。
(3)醛基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-CHO)的制备
将步骤(2)中制得的SiO2-NH2纳米粒子与20mL甲醇混合，而后加入5mL25％的戊二醛溶液，超声分散后用锡纸包裹避光，25℃反应12h。最后将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水清洗多次，25℃真空干燥至恒重得到SiO2-CHO。
(4)多乙烯多胺枝接的SiO2(SiO2-多乙烯多胺)的制备
称取2.5g多乙烯多胺和1.25g的SiO2-CHO纳米粒子加入100mL三口烧瓶中，随后50mL的甲醇，超声分散均匀，室温反应24h，每4小时加入50mg的硼氢化钠。反应结束后，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤3次，最后在45℃真空干燥箱中干燥12h。
(5)枝装硼酸聚合物SiO2@4-甲酰基苯硼酸的制备：
先将0.2gSiO2@多乙烯多胺纳米粒子和0.4g4-甲酰基苯硼酸加入50mL烧瓶，再加入30mL的甲醇，超声至分散。室温下反应24h，每4个小时加入100mg硼氢化钠。然后在40℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到枝装硼酸聚合物(SiO2@4-甲酰基苯硼酸)。
(6)糖蛋白表面印迹聚合物的制备：
称取50mgSiO2-4-甲酰基苯硼酸纳米粒子，分散于10mLPBS缓冲溶液(pH＝8.5)中，随后加入10mg模板蛋白卵清白蛋白(OVA)，在4℃环境中静置1h，使OVA通过硼亲和作用吸附于粒子表面。而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次除去表面非特异性吸附的OVA。将粒子再次分散于25mL双蒸水中，并加入25mg盐酸多巴胺(DA)，搅拌溶解后缓慢滴入1mLTris-Hcl(pH＝8.8,1.5M)缓冲溶液，室温反应5h，将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤三次。随后用含有5％SDS的醋酸溶液(pH＝4.0)洗涤产物多次直到在UV-vis光谱检测不到OVA的吸收峰，以除去模板分子OVA。最终产物(SiO2-MIPs)用双蒸水洗至中性，并且在45℃下真空干燥。
实施例2：
(1)SiO2的制备
与实施列1中的步骤(1)一致；
(2)氨基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-NH2)的制备
与实施列1中的步骤(2)一致；
(3)醛基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-CHO)的制备
与实施列1中的步骤(3)一致；
(4)多乙烯多胺枝接的SiO2(SiO2-多乙烯多胺)的制备
称取1g多乙烯多胺和0.8g的SiO2-CHO纳米粒子加入100mL三口烧瓶中，随后50mL的甲醇，超声分散均匀，室温反应8h，每4小时加入30mg的硼氢化钠。反应结束后，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤3次，最后在45℃真空干燥箱中干燥12h。
(5)枝装硼酸聚合物SiO2@4-甲酰基苯硼酸的制备：
首先，对SiO2@多乙烯多胺纳米颗粒进行表面修饰。先将0.1g的SiO2@多乙烯多胺纳米粒子和0.1g的4-甲酰基苯硼酸加入50mL烧瓶，再加入20mL的甲醇，超声至分散。室温下反应8h，每4个小时加入30mg硼氢化钠。然后在45℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到枝装硼酸聚合物(SiO2@4-甲酰基苯硼酸)。
(6)糖蛋白表面印迹聚合物的制备：
称取30mgSiO2-4-甲酰基苯硼酸纳米粒子，分散于5mLPBS缓冲溶液(pH＝8.5)中，随后加入5mg模板蛋白卵清白蛋白(OVA)，在4℃环境中静置1h，使OVA通过硼亲和作用吸附于粒子表面。而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次除去表面非特异性吸附的OVA。将粒子再次分散于15mL双蒸水中，并加入15mg盐酸多巴胺(DA)，搅拌溶解后缓慢滴入1mLTris-Hcl(pH＝8.8,1.5M)缓冲溶液，室温反应5h，将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤三次。随后用含有5％SDS的醋酸溶液(pH＝4.0)洗涤产物多次直到在UV-vis光谱检测不到OVA的吸收峰，以除去模板分子OVA。最终产物(SiO2-MIPs)用双蒸水洗至中性，并且在45℃下真空干燥。
实施例3：
(1)SiO2的制备
与实施列1中的步骤(1)一致
(2)氨基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-NH2)的制备
与实施列1中的步骤(2)一致
(3)醛基修饰的SiO2纳米粒子(SiO2-CHO)的制备
与实施列1中的步骤(3)一致
(4)多乙烯多胺枝接的SiO2(SiO2-多乙烯多胺)的制备
称取5g多乙烯多胺和1.5g的SiO2-CHO纳米粒子加入100mL三口烧瓶中，随后50mL的甲醇，超声分散均匀，室温反应8h，每4小时加入100mg的硼氢化钠。反应结束后，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤3次，最后在45℃真空干燥箱中干燥12h。
(5)枝装硼酸聚合物SiO2@4-甲酰基苯硼酸的制备：
首先，对SiO2@多乙烯多胺纳米颗粒进行表面修饰。先将0.3g的SiO2@多乙烯多胺纳米粒子和0.5g的4-甲酰基苯硼酸加入50mL烧瓶，再加入20mL的甲醇，超声至分散。室温下反应24h，每4个小时加入100mg硼氢化钠。然后在45℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到枝装硼酸聚合物(SiO2@4-甲酰基苯硼酸)。
(6)糖蛋白表面印迹聚合物的制备：
称取80mgSiO2-4-甲酰基苯硼酸纳米粒子，分散于15mL的PBS缓冲溶液(pH＝8.5)中，随后加入15mg模板蛋白卵清白蛋白(OVA)，在4℃环境中静置1h，使OVA通过硼亲和作用吸附于粒子表面。而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次除去表面非特异性吸附的OVA。将粒子再次分散于15mL双蒸水中，并加入30mg盐酸多巴胺(DA)，搅拌溶解后缓慢滴入2mL的Tris-Hcl(pH＝8.8,1.5M)缓冲溶液，室温反应5h，将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤三次。随后用含有5％SDS的醋酸溶液(pH＝4.0)洗涤产物多次直到在UV-vis光谱检测不到OVA的吸收峰，以除去模板分子OVA。最终产物(SiO2-MIPs)用双蒸水洗至中性，并且在45℃下真空干燥。
试验例1：取5mL初始浓度分别为0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mg/mL的OVA溶液，OVA溶解在磷酸盐缓冲溶液中(20mM，pH＝8.5)加入到三组离心管中，一组离心管中分别加入5mg实施例1中制备的枝装硼酸糖蛋白表面印迹聚合物(SiO2-MIPs)作为测试液，同样的，另一组离心管加入枝装硼酸糖蛋白表面非印迹聚合物(SiO2-NIPs)作为对比，最后一组加入单链硼酸糖蛋白表面印迹聚合物(SC-NIPs)作为对比。
将测试液和对比液放在25℃的水浴中静置50min，离心机分离收集，未吸附的OVA分子浓度用紫外可见分光光度计测定，并根据结果计算出吸附容量，结果表明，达到吸附平衡时枝装硼酸糖蛋白表面印迹聚合物(SiO2-MIPs)的最大吸附容量是243.4mg/g，在相同温度下比非印迹聚合物(SiO2-NIPs)和单链硼酸糖蛋白表面印迹聚合物(SC-NIPs)要高，说明SiO2-MIPs是一种有效识别和去除OVA的良好的吸附剂。
试验例2：分别选取糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)和非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)作为选择性吸附中吸附OVA的竞争物。先分别将5mg SiO2-MIPs(实施例1中)和SiO2-NIPs加入5mL离心管中，然后分别加入1.0mg/mL OVA、HRP和BSA的单组份磷酸盐溶液(PBS,pH＝8.5,20mM)各5ml，超声分散均匀。将离心管置于25℃水浴振荡器中静态吸附60min。60min后将测试液离心取上层清液，通过UV-vis测定未吸附蛋白质浓度。OVA与BSA检测波长为280nm，HRP检测波长为410nm。实验平行测定三次，求取平均值。印迹因子(IF)通过公式计算。结果表明，对OVA的印迹因子为4.82，高于HRP与BAS(3.24和2.14)。分子印迹技术在这一结果中起着主要作用，因为HRP与BAS的形状尺寸与印迹腔不符，所以SiO2-MIPs无法识别除OVA以外的其它蛋白质。而BSA由于表面不存在糖链，所以更难以被识别吸附。
图1为实施例1中制备的枝状硼酸糖蛋白表面印迹聚合物的TEM图片，图(a)是没有任何修饰的SiO2的TEM图片；图(b)是图(a)中的SiO2枝接多乙烯多胺与修饰4-甲酰基苯硼酸，得到的枝状硼酸修饰的SiO2-FPAB后图片，尺寸大小并未发生明显变化，但是可以观察到SiO2-4-甲酰基苯硼酸的边缘变得模糊，这可能是多步修饰导致的；图(c)显示的是最终得到的SiO2-MIPs，从图中可以看出SiO2-MIPs在经过印迹修饰之后变为了核-壳结构，印迹壳层厚度均匀，约为5nm，并且SiO2-MIPs依旧具有良好的单分散性，印迹聚合物被成功制备。
图2为实施例1中制备得到的SiO2,SiO2@多乙烯多胺和枝状硼酸糖蛋白表面印迹聚合物的红外光谱图。所有的FT-IR谱图如图所示。未进行修饰的SiO2的红外谱图中1099cm-1与942cm-1处的吸收峰归属于Si-O-Si与Si-O-H的伸缩振动。相比于修饰前的SiO2，在进行醛基功能化、多乙烯多胺枝接以及硼酸修饰后，SiO2-4-甲酰基苯硼酸在1600-1200cm-1范围内出现了许多新的特征吸收峰。1584cm-1处的特征峰可能源于多乙烯多胺骨架上N-H的面内弯曲振动，而1450cm-1处为则为N-C键的拉伸振动，这些结果表明多乙烯多胺被成功枝接与SiO2表面。而1393cm-1与1358cm-1处则为修饰的4-甲酰基苯硼酸的B-O与C-B振动吸收峰，1491cm-1处弱的吸收峰来自苯环C＝C的伸缩振动，基于此，可以推测4-甲酰基苯硼酸也被成功修饰。当进行聚多巴胺表面印迹层包覆后，SiO2-MIPs谱图上新出现了1283cm-1特征峰，该吸收峰是聚多巴胺骨架上酚的C-O伸缩振动造成的。以上所有的结果都证明SiO2-MIPs被成功制备。
图3为实施例1中制备得到的枝装硼酸糖蛋白表面印迹聚合物的XPS图，从图可以明显看出，SiO2-MIPs在进行了多重修饰后，其XPS谱图相比于SiO2出现了三个新的吸收峰，分别为C1s(284.9eV)、N 1s(399.1eV)与B1s(196.8eV)。而SiO2谱图中存在着较弱的C1s吸收峰，可能来于SiO2合成与洗涤过程中残余的试剂。所有的元素组成包括C、N、O、Si、B都证明了枝状硼酸被成功修饰于SiO2表面。而N1s与O1s特征吸收峰在进行多巴胺表面包覆后明显增强，据此可以推测聚多巴胺成功的在SiO2表面沉积，SiO2-MIPs被成功制备。
图4为试验例1中吸附实验数据图，从图中可以看到，SiO2-MIPs的吸附容量Qe是非线性的并且随着平衡浓度Ce的增加而增长。在相同的pH环境中，SiO2-MIPs的吸附容量明显大于单链硼酸修饰的SC-MIPs，这表明由于SiO2-MIPs采用枝状硼酸作为识别位点，所以其对OVA有着更强的亲和性能，增大的表面硼酸密度增大了其印迹位点与OVA的接触几率。而SiO2-NIPs由于缺乏印迹位点，所以其对OVA的饱和吸附容量差于两种表面印迹吸附剂。

Claims (10)

1.一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备SiO2，并分散于无水乙醇中，得SiO2分散液，备用；
(2)氨基修饰的SiO2纳米粒子SiO2-NH2的制备：
在3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES中，加入步骤(1)中得到的SiO2分散液与无水乙醇，超声分散均匀，置于水浴中反应，反应结束后，将产物用无水乙醇洗涤多次后，得到SiO2-NH2纳米粒子，备用；
(3)醛基修饰的SiO2纳米粒子SiO2-CHO的制备：
将步骤(2)中制得的SiO2-NH2纳米粒子溶于甲醇，而后加入戊二醛溶液，超声分散后用锡纸包裹避光反应，反应结束后将产物离心分离并用无水乙醇与双蒸水清洗多次，真空干燥至恒重，得到SiO2-CHO纳米粒子；
(4)多乙烯多胺枝接的SiO2的制备：
称取一定量多乙烯多胺和SiO2-CHO纳米粒子溶于甲醇，超声分散均匀，室温反应8-24h，每4小时加入一定量的硼氢化钠，反应结束后，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤3次，最后在真空干燥，得到SiO2-多乙烯多胺；
(5)4-甲酰基苯硼酸修饰的纳米粒子SiO2-FPBA的制备：
将步骤(4)制得的SiO2-多乙烯多胺与一定量4-甲酰基苯硼酸分散溶解于甲醇中，室温下磁力搅拌反应8-24h，每4小时加入一定量的硼氢化钠，反应结束后，将产物离心分离，并用无水乙醇与双蒸水分别洗涤3次，最后真空干燥，得到产物SiO2-4-甲酰基苯硼酸；
(6)枝状苯硼酸修饰表面印迹聚合物(SiO2-MIPs)的制备
称取步骤(5)制得的SiO2-4-甲酰基苯硼酸纳米粒子，分散于PBS缓冲溶液中，随后加入一定量的模板蛋白卵清白蛋白OVA，静置，使OVA通过硼亲和作用吸附于粒子表面，而后将粒子离心分离并用PBS缓冲溶液洗涤多次除去表面非特异性吸附的OVA，将粒子再次分散于一定量的双蒸水中，并加入一定量的盐酸多巴胺DA，搅拌溶解后缓慢滴入Tris-HCl缓冲溶液，室温反应2-10h，将产物离心分离并用无水乙醇与去离子水分别洗涤三次，随后用含有SDS的醋酸溶液洗涤产物多次直到在UV-vis光谱检测不到OVA的吸收峰，以除去模板分子OVA，用去离子水洗至中性，真空干燥，得到最终产物SiO2-MIPs。
2.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES和SiO2分散液体积比例为1-3：10，SiO2分散液的浓度0.22g/mL。
3.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，水浴中反应的温度为45-55℃，时间为12h。
4.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，SiO2-NH2纳米粒子、甲醇和戊二醛溶液的比例为2.2g：10-50mL：2-6mL，其中，戊二醛溶液的体积百分浓度为25％。
5.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，避光反应的温度为15-35℃，时间为8-24h，真空干燥的温度为25℃。
6.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，多乙烯多胺，SiO2-CHO纳米粒子和每次加入的硼氢化钠比例为(1-5g)：(0.8-1.5g)：(30-100mg)。
7.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，SiO2-多乙烯多胺，4-甲酰基苯硼酸和每次加入硼氢化钠的比例为(0.1-0.3g)：(0.1-0.5g)：(30-100mg)。
8.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，SiO2-4-甲酰基苯硼酸纳米粒子，PBS缓冲溶液，模板蛋白卵清白蛋白OVA，盐酸多巴胺DA，双蒸水和Tris-Hcl缓冲溶液比例为(30-80mg)：(5-20mL)：(5-15mg)：(15-30mg)：(15-50mL)：(1-2mL)，其中，PBS缓冲溶液的pH＝8.5，Tris-Hcl缓冲溶液的pH＝8.8，浓度为1.5M，含有SDS的醋酸溶液的pH＝4.0，SDS的质量百分含量为5％。
9.如权利要求1所述的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)中，所述的真空干燥的条件为45℃真空干燥箱中干燥12h；步骤(6)中，静置的条件为：在4℃环境中静置1h。
10.将权利要求1～9任一项所述制备方法制得的一种基于枝状硼酸的糖蛋白分子表面印迹聚合物用于分离提纯蛋白卵清白蛋白OVA的用途。
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