CN101684005A

CN101684005A - 表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101684005A
Application number: CN200810200779A
Authority: CN
Inventors: 邓春晖; 姚宁; 姚国平; 张祥民
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2008-09-28
Filing date: 2008-09-28
Publication date: 2010-03-31

Abstract

本发明属无机材料和分析技术领域，涉及一种表面修饰氨基苯硼酸的磁性材料及其制备方法和应用。本发明先合成表面富含氨基的四氧化三铁的磁性纳米材料，采用氨基苯硼酸对其进行表面化学修饰。本发明的合成方法简单有效，制得的磁性材料具有很好的磁场感应性，作为微吸附剂，比表面积大，特异性强，可直接放入肽段中，无需特殊处理，络合到磁性纳米材料上后，无需离心分离，采用简单磁场作用即可实现糖蛋白和糖肽的特异性分离富集。该材料在蛋白组学等领域有良好的实用价值和应用前景。

Description

表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属无机材料和分析技术领域，涉及纳米材料，具体涉及一种表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料及其制备方法和应用。

背景技术

众所周知，蛋白质组成具有多样性和可变性，即在同一物种的不同细胞中或同一细胞在不同时期，其蛋白质组成都是在不断变化的，造成蛋白质组成异常复杂。同时由于蛋白质存在翻译后修饰，所以一个mRNA往往对应多个蛋白质，也就是说，蛋白质的数量远远多于基因的数量，蛋白质在大小、相对丰度、酸碱度和疏水性方面差异很大，尤其对于翻译后修饰蛋白，种类很多，丰度又常常很低，但却往往是生物体生命活动的关键物质。近年来，翻译后修饰蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一。因此要从分子水平上，深入研究生命过程的规律，探索生命现象的奥秘，必须对一些具有重要生理功能的翻译后修饰蛋白质进行分析监测，这对目前的分析技术和手段不能不说是一个严峻的挑战。

糖基化是蛋白的翻译后修饰中非常重要的一种。在真核生物细胞中，寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式的共价键连接，构成糖蛋白的糖肽链。糖蛋白是许多生物过程的基本物质，包括细胞的生长、信息传导、免疫、病变和感染反应等过程，它也可以作为一些疾病的标记物质。随着人类基因组计划的完成以及蛋白组计划的发展，糖基化蛋白质组的研究也受到了广泛重视。研究显示，由于在质谱中糖蛋白和糖肽的电离比较困难，糖基化蛋白和肽链的信息很容易被非糖基化蛋白、肽段干扰或覆盖，糖蛋白的特异性分离成为糖蛋白分析中的重要环节，为了得到完整的糖基化位点，糖链结构等信息，需要特异性强，高效简便的糖蛋白、糖肽分离方法。目前最常用的分离方法有常规色谱和电泳分离法，以及特异性的凝集素色谱、酰肼或硼酸材料辅助等分离方法。常规的色谱和电泳分离可以减轻生物样品的复杂程度，但并不能特异性分离糖基化蛋白和肽链。凝集素色谱只对某种结构的糖链可以起一定的分离作用；酰肼基团可以与经氧化的糖结构稳定键合，但反应不可逆，键合的糖蛋白和糖肽不易洗脱下来进行分析。而硼酸由于在碱性条件下普遍性地与糖结构生成比较稳定的共价键，在酸性条件下又可以可逆地将完整的糖蛋白或糖肽洗脱下来，所以成为比较理想的糖蛋白分离方法。近年来，纳米材料以其发展快速和应用潜力而被越来越多地应用于在蛋白质组学分析中。有研究成功地将沸石纳米粒子应用于痕量肽段的富集，但是该方法需要高速离心分离样品和沸石混合物，操作相对繁琐。因此发展一种简单便捷而又有效的分离富集糖蛋白和糖肽的方法成为蛋白质组学研究的一个重要方面。

磁性聚合物微球以其易于表面修饰、溶液分散性好以及灵敏的磁场感应性为其应用于蛋白质组学分析中痕量肽段的分离富集方面提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、特异性好，能对糖蛋白和糖肽进行分离富集的表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料。

本发明的另一目的是提供上述纳米磁性材料的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述纳米磁性材料的应用。

本发明合成了四氧化三铁磁性聚合物微球，进而合成了新型的表面修饰硼酸基团的磁性聚合物材料。利用该磁性聚合物材料作为吸附剂，进行低丰度糖蛋白和糖肽的分离富集以及MALDI-TOF/MS直接分析，从而解决了样品的分析困难；也为磁性聚合物微球的应用开辟了新的途径。

本发明首先采用水热法合成胺基修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，然后分别与己二酰氯、3-氨基苯硼酸反应，制得其结构如下式所示的表面修饰硼酸基团的磁性纳米粒子：

其中M为带有氨基的四氧化三铁纳米粒子。

本发明通过下述方法和步骤制备所述的表面修饰硼酸基团的磁性材料：

(1)用水热法合成表面带有氨基的四氧化三铁的超顺磁性纳米粒子：

采用FeCl₃·6H₂O为原料，以80-90mL乙二醇为分散体系，添加无水乙酸钠，1，6-己二胺，反应温度为195-200℃，反应时间为4-6小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子，其粒径是20-100nm；

(2)首先，将由步骤(1)合成的Fe₃O₄氨基磁性微球反复用去离子水洗涤，除去水溶性杂质，最后将产物真空干燥得到黑色粉末；其次，对Fe₃O₄氨基磁性微球进行表面修饰，先将磁球表面用己二酰氯修饰：取干燥的两颈瓶，加入无水氯仿，称取干燥的Fe₃O₄氨基磁性微球粉末，得到纳米粒子的分散液；将两颈瓶置于冰水浴中密封搅拌20-30分钟，保持冰水浴，向瓶中滴入己二酰氯，继续密封搅拌4-5小时；然后通过酰氯在磁球上接3-氨基苯硼酸，先在磁铁辅助下用无水氯仿洗去未反应的己二酰氯，再加入无水氯仿分散；在分散液中加入3-氨基苯硼酸粉末，机械搅拌5-6小时，停止搅拌，在磁铁辅助下用丙酮和水洗掉多余的3-氨基苯硼酸，并收集合成好的磁性纳米材料，40-50℃烘干备用。

本发明的表面修饰硼酸基团的磁性材料合成方法简单有效，制得的磁性材料具有很好的磁场感应性，作为微吸附剂，比表面积大，特异性强，可对生物体中具有的糖基化蛋白和肽段进行特异性分离富集，该固定硼酸基团的磁性纳米材料可直接放入肽段中，无需特殊处理，络合到磁性纳米材料上后，无需离心分离，采用简单磁场作用即可实现糖蛋白和糖肽的特异性分离富集。

本发明的表面修饰硼酸基团的磁性材料的合成及应用为生物体中低丰度糖蛋白、肽段的特异性分离富集提供了新的方法，并扩展了磁性纳米材料的实际应用，在生物分析研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1为表面修饰硼酸基团的磁性纳米粒子的合成方法图示。

图2为水热法合成的表面修饰氨基的Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜图(a)和扫描电镜图(b)，图中显示它具有很好的均一性和分散性。

图3为氨基磁性钠米粒子(a)与用氨基苯硼酸修饰的氨基磁性钠米粒子(b)红外图对比，在(b)中，出现了明显的C-B振动峰(1376cm^-1)的峰的，并且可看到3000左右苯的振动峰，证实本发明成功地在磁性钠米粒子表面键和了氨基苯硼酸。

图4为表面修饰硼酸的磁性纳米材料对标准糖蛋白(去唾液酸胎球蛋白)酶解肽溶液的处理效果，对比(a)未处理；(b)处理后(图上*标示糖肽)可知该材料可以很好地特异性分离糖肽，并且对低丰度糖肽有明显的富集效果。

图5为表面修饰硼酸的磁性纳米材料蛋白质混合溶液的分离结果，

其中，(a)蛋白混合溶液由血清白蛋白(非糖基化蛋白，BSA)和辣根过氧化物酶(糖蛋白，HRP)组成，经材料处理后仅可看到HRP的条带；

(b)蛋白混合溶液由肌红蛋白(非糖基化蛋白，MYO)和核糖核酸酶B(糖蛋白，RNB)组成，经材料处理后仅可看到RNB的条带；

图中标示的糖蛋白在经过材料处理后均得到纯化，证实本发明材料对蛋白混合溶液也有明显的特异性分离效果。

具体实施方式

通过下述实施例对本发明所提供的超顺磁性的表面修饰氨基硼酸的磁性材料进行糖蛋白、糖肽的分离富集分析过程的进一步说明。

实施例1表面修饰Cu²⁺的磁性材料的合成

表面修饰Cu2+的磁性材料的合成通过下述步骤：

用水热法合成表面带有氨基的四氧化三铁的超顺磁性纳米粒子：

采用3.0克FeCl3·6H2O为原料，以80-90mL乙二醇为分散体系，添加6-12克无水乙酸钠，10-20克1，6-己二胺，反应温度为195-200℃，反应时间为4-6小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子，其粒径是20-100nm；

将由步骤(1)合成Fe₃O₄氨基磁性微球反复用去离子水洗涤以除去水溶性杂质，最后将产物以40-50℃真空干燥得到黑色粉末；其次，对Fe3O4氨基磁性微球进行表面修饰，先将磁球表面用己二酰氯修饰。取干燥的100mL两颈瓶，加入25-30mL无水氯仿，称取100毫克干燥的Fe3O4氨基磁性微球粉末，得到纳米粒子的分散液；将两颈瓶置于冰水浴中密封搅拌20-30分钟，保持冰水浴，向瓶中滴入0.2-0.3mL己二酰氯，继续密封搅拌4-5小时；然后通过酰氯在磁球上接3-氨基苯硼酸，先在磁铁辅助下用无水氯仿洗去未反应的己二酰氯，再加入25-30mL无水氯仿分散。在分散液中加入300-500毫克3-氨基苯硼酸粉末，机械搅拌5-6小时，停止搅拌，在磁铁辅助下用丙酮和水洗掉多余的3-氨基苯硼酸，并收集合成好的磁性纳米材料，40-50℃烘干。

使用该材料进行分离富集前，称取10-20毫克烘干的纳米材料黑色粉末，将其分散在1mL去离子水中备用。

实施例2表面修饰Cu2+的磁性材料用于肽段富集

(1)蛋白溶液酶解：

取100μg去唾液酸胎球蛋白溶于50mM NH4HCO3溶液中(pH 8)，浓度为50ng μl-1，经过10mM的二硫苏糖醇变性(60℃，30min)，100mM碘乙酰胺烷基化(37℃，45min)，胰蛋白酶37℃过夜酶解，酶解液置于-80℃冰箱冷冻待用。

(2)肽段的分离富集：

将100μL浓度为5ng μL-1的糖蛋白酶解液与约100ng磁性纳米材料在持续震荡下反应90分钟，反应体系为pH约8.5的NH4HCO3溶液。然后将反应后键和了糖肽的材料用pH约8.5的NH4HCO3溶液冲洗2-3次，每次20μL。吸干冲洗溶液，用10μL三氟乙酸的20％乙腈溶液洗脱(三氟乙酸浓度0.5-5％，洗脱时间1小时)。最后将1μL洗脱液与基质一起点到靶板上，待干后进行MALDI-MS分析。未经材料分离浓缩处理的原酶解1μL也同样进行MS分析作为对比。以上实验过程都在室温下进行。

(3)MALDI-MS的检测

依序分别将1μL DHB基质(12.5mg/ml的DHB溶于0.1％(v/v)TFA and 20％(v/v)乙腈溶液)，1μL样品点于MALDI靶板上，待靶板上的点样液干燥、结晶后，将靶板放进质谱仪，进行MALDI-TOF质谱测定。MALDI-TOF MS质谱实验在MALDI-QIT-TOF MS(AXIMA QIT；Shimadzu/Kratos，Manchester，UK)上完成；激光器波长337nm，激光脉冲频率10Hz，正离子模式下检测。

实施例3表面修饰硼酸基团的磁性材料用于糖蛋白的分离

取2μL糖蛋白(1μg μL-1)，和2μL非糖蛋白(1μg μL-1)混合，在pH约8.5的溶液中以实验例2的条件与纳米材料反应，所得洗脱液与未处理的原对照溶液一起进行12％SDS-聚丙烯酸电泳分离。所得胶条银染显色后进行扫描并分析。

Claims

1、表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料，其特征在于，具有下式的结构：

其中，M为带有氨基的四氧化三铁纳米粒子。

2、一种如权利要求1所述的表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料的制备方法，其特征在于，首先采用水热法合成胺基修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，然后分别与己二酰氯、3-氨基苯硼酸反应，生成表面修饰硼酸基团的磁性纳米材料。

3、按权利要求2所述的表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

采用FeCl₃·6H₂O为原料，以乙二醇为分散体系，添加无水乙酸钠，1，6-己二胺，反应温度为195-200℃，反应时间为4-6小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子；

(2)首先，将由步骤(1)合成的Fe₃O₄氨基磁性微球用去离子水洗涤，除去水溶性杂质后，将产物以40-50℃真空干燥得到黑色粉末；

其次，对Fe₃O₄氨基磁性微球进行表面修饰，先将磁球表面用己二酰氯修饰：取干燥的两颈瓶，加入无水氯仿，取干燥的Fe₃O₄氨基磁性微球粉末，得纳米粒子的分散液；将两颈瓶置于冰水浴中密封搅拌20-30分钟，保持冰水浴，向瓶中滴入己二酰氯，继续密封搅拌4-5小时；然后通过酰氯在磁球上接3-氨基苯硼酸：先在磁铁辅助下用无水氯仿洗去未反应的己二酰氯，再加入无水氯仿分散；在分散液中加入3-氨基苯硼酸粉末，机械搅拌5-6小时，在磁铁辅助下用丙酮和水洗掉多余的3-氨基苯硼酸，收集合成所得的磁性纳米材料，40-50℃烘干备用。

4、按权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(1)制得的表面带有氨基的磁性纳米粒子其粒径是20-100nm。

5、权利要求1的表面修饰硼酸基团的纳米磁性材料在制备特异性分离富集糖蛋白和糖肽制剂中的用途。