CN113663658A - 硼酸功能化磁性纳米材料及其一锅法制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种硼酸功能化磁性纳米材料及其一锅法制备方法，其特征在于，利用共沉淀法获得的磁性四氧化三铁纳米粒子表面与苯硼酸基团形成配位作用，采用一种新颖简单的一锅法制备具有分离富集糖蛋白作用的硼酸功能化的磁性纳米材料。这种一锅法制备方法具有方法简单、条反应件温和、后处理过程方便等优点。本发明所制备的硼酸功能化磁性纳米材料对标准糖蛋白和非糖蛋白如转铁蛋白、辣根过氧化物酶蛋白、免疫球蛋白、细胞色素C和溶菌酶蛋白表现出良好的富集选择性。该硼酸功能化纳米材料对蛋清实际样品中的糖蛋白的分离也具有良好的选择性，展现了良好的应用价值。

Description

硼酸功能化磁性纳米材料及其一锅法制备
技术领域
本发明属于纳米材料的制备领域，特别是涉及一种采用一锅法制备的硼酸功能化修饰的磁性纳米材料及其制备方法，可用于糖蛋白的分离富集。
背景技术
糖基化作为蛋白质最重要、普遍和复杂翻译后修饰之一，对蛋白质的结构和功能有重要影响，参与免疫系统应答、细胞信号传导、受体激活和细胞识别等诸多重要生理过程。异常的糖基化修饰与很多疾病有关，如糖尿病、冠心病、神经退行性疾病和癌症。因此，复杂生物样品中的糖蛋白研究不仅有利于癌症早期诊断的生物标志物，而且可以对癌症的治疗和预后提供重要信息。目前，糖蛋白组学是生命科学研究的重要前沿。基于生物质谱技术的分析检测方法是蛋白质研究的重要手段。但由于研究对象多为复杂的生物样品，糖蛋白在生物体内虽然种类繁多但含量甚低，且其低的离子化效率和异质性等都会导致在检测中信号被样品中高丰度非糖蛋白信号干扰和掩盖。糖蛋白研究中有效的预处理技术是克服这一瓶颈问题的必要手段。因此制备新型高选择性、高富集效率的分离富集材料对糖蛋白组学研究至关重要。
糖蛋白的分离富集方法主要有凝集素亲和色谱法、酰肼化学法、硼亲和富集法、亲水作用色谱法等。凝集素能够高特异性的结合糖蛋白上某些特定单糖或者寡糖精细结构，凝集素亲合法是目前最广泛的分离富集方法。但是凝集素价格相对较高，且研究对象相对复杂，需采用多种凝集素组合的方法获得全面的糖蛋白信息。酰肼化学法是利用高碘酸氧化糖链上顺式邻二醇为醛基，从而与含有酰肼基团材料共价结合实现特异性分离富集的方法。但其操作步骤复杂，且破坏糖蛋白结构完整性。亲水作用色谱法利用糖链与固相材料表面基团形成氢键作用，实现非选择性地富集各种类型的糖蛋白。其存在糖蛋白与非糖蛋白共洗脱的问题。硼亲和富集法利用硼酸基团与顺式邻二醇在不同pH环境下可逆的共价结合或解离，可实现快速捕获或释放目标糖蛋白，具有广谱性、质谱兼容性的特点。
磁性纳米材料(magnetic nanoparticles，MNPs)，具有良好的生物相容性、分散性、粒径可调性的优势，最大的优势则是快速的分离特性。在外加磁场作用下，可以快速的从溶液中分离，相对于离心、过滤等其他方式，节省了大量的分离时间，同时也可以减少样品处理中损失。硼酸功能化磁性材料在糖蛋白分离富集检测方面的应用异常活跃。但材料的特异性、抗干扰能力和键合容量等仍有待于进一步提高。为此，本项目引入三维纳米粒子-倍半硅氧烷，与磁性纳米粒子组装成新型磁性倍半硅氧烷杂化材料，来增加材料的接枝率、亲水性，以满足实际应用需求。
低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomeric silsesquioxane，POSS)，是由Si-O-Si组成内部无机骨架，外围接有有机官能团的纳米级三维笼型分子，化学结构简式为[RSiO1.5]n(n＝6，8，10，12)，R为有机基团，比如：惰性的烷基和苯基、具有反应活性的乙炔基、氨基、叠氮基等。POSS的结构特点如下：(1)分子内杂化结构：POSS具有分子内杂化结构，内部有纳米级Si-O-Si组成，构成具有六面体无机框架核心，外部接有有机取代基团，因此其本身就是在分子水平上的有机-无机分子内杂化体系。无机内核使其具有无机材料的强度，有机官能团使其具有有机材料的功能性。POSS弥补了无机材料与有机材料之间的性能空白区。(2)纳米尺寸：在POSS结构中，Si-O-Si中相邻两个硅原子的直线距离为1.5nm，被认为是最小的氧化硅粒子。它可以与聚合物复合，形成纳米复合材料。(3)结构可设计性：使用不同的前体，可通过简单的反应使POSS外围上带上各种反应性基团，使其具有反应性与功能性。获得的功能性POSS可以在熔融状态下与聚合物共混，也可以通过自由基聚合、开环聚合、缩聚反应等方法引入到聚合物中。功能化POSS材料在分析化学样品分离领域固相萃取中已得到一些应用，但磁性分离仅有极少量相关文献报道。
鉴于此，本发明结合POSS、磁性分离的优点，通过一锅法制备硼酸功能化的新型磁性纳米材料，并应用于复杂生物样品中糖蛋白的分离富集。本发明的研究能进一步拓展倍半硅氧烷POSS的应用领域，为硼酸功能化磁性纳米材料的制备及糖蛋白的富集提供新思路。
本发明中的名词解释：NPs是纳米颗粒(英文名称Nanoparticles)的简称；POSS是低聚倍半硅氧烷(英文名称Polyhedral oligomeric silsesquioxane)的简称。
发明内容
本发明的目的是提供一类硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法，通过一锅法得到的硼酸功能化磁性纳米材料具有糖蛋白选择性富集能力，可用于实际样品中糖蛋白的分离和富集。
本发明提供了一种硼酸功能化磁性纳米材料及其一锅法制备方法，其特征在于，利用共沉淀法获得的磁性四氧化三铁纳米粒子表面与苯硼酸基团形成配位作用，采用一种新颖简单的一锅法制备具有分离富集糖蛋白作用的硼酸功能化的磁性纳米材料，它包括：1)硼酸修饰的倍半硅氧烷复合物的制备；2)四氧化三铁纳米粒子的制备；3)硼酸功能化磁性纳米材料的制备。利用硼酸功能化磁性纳米材料进行糖蛋白的分离富集。
本发明所采用的技术方案为：一锅法制备硼酸功能化磁性纳米材料，所述的该磁性纳米材料是将POSS单体与戊二醛反应形成纳米基质，然后通过化学键共价结合4-氨基苯硼酸，Fe3O4纳米颗粒利用Fe与苯硼酸的螯合作用负载到纳米材料表面而制得。具体包括如下步骤：
将4-氨基苯硼酸加入到含有八氨基丙基倍半硅氧烷(POSS-(NH2)8，250mg)的30mLDMSO溶液中，超声分散均匀后，缓慢加入250μL三乙胺，室温搅拌12h后，缓慢滴加戊二醛。室温搅拌12h后冰浴，加入5mL甲醇，分批加入100mg NaBH4，搅拌自然升至室温，加入2mL超纯水，继续搅拌5h，得POSS@PBA混悬液。移取3mL POSS@PBA于离心管中，再加入Fe3O4混悬液，超声9min后，离心，依次用水和乙醇洗涤，40℃真空干燥，得到硼酸功能化磁性纳米材料POSS@PBA/Fe3O4。
上述步骤中，所述的八氨基丙基倍半硅氧烷的制备：取40mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷于320mL甲醇溶液中，缓慢滴加54mL浓盐酸，室温搅拌7天，抽滤得白色粗产物，用四氢呋喃多次洗涤提纯，真空干燥。
上述步骤中，所述的Fe3O4混悬液的制备：称取1.18g FeCl3·6H2O、0.43g FeCl2·4H2O溶解于20mL超纯纯水中，机械搅拌下，快速加入2.5mL的氨水，继续搅拌30min后，将反应体系转移到50mL离心管内。
上述步骤中，所述滴加的4-氨基苯硼酸与戊二醛的比例为150-300mg：39.0-7.50mg。
上述步骤中，所述滴加的Fe3O4混悬液的体积为30-120μL。
上述一锅法制备的硼酸功能化磁性纳米材料可应用于标准蛋白(转铁蛋白、辣根过氧化物酶蛋白、免疫球蛋白、细胞色素C和溶菌酶蛋白)，以及蛋清实际样品的分离富集。
本发明的有益效果：利用一锅法制备硼酸功能化磁性纳米材料，该制备方法成本低廉、条件温和、操作简便快捷、产物后处理简单，制备得到的硼酸功能化磁性纳米材料对糖蛋白具有富集选择性，并能应用于蛋清实际样品的处理。
本发明所制备的硼酸功能化磁性纳米材料对标准糖蛋白和非糖蛋白如转铁蛋白、辣根过氧化物酶蛋白、免疫球蛋白、细胞色素C和溶菌酶蛋白表现出良好的富集选择性。该硼酸功能化纳米材料对蛋清实际样品中的糖蛋白的分离也具有良好的选择性，展现了良好的应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例2、3、4、5制备的POSS@PBANPs对Trf的吸附图；
图2是本发明实施7、8、9、10制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对Trf的吸附图；
图3是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的TEM图；
图4是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的VSM图；
图5是本发明实施例6制备的Fe3O4(A)，实施例4制备的POSS@PBA(B)及实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs(C)的FT-IR图；
图6是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的XRD图；
图7是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的XPS图；
图8是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对三种蛋白的(Trf，Lyz，Cyt C)的等温吸附曲线；
图9是不同的孵育时间下本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对浓度为0.5mg/mL的Trf的吸附图；
图10是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对浓度为0.5mg/mL的五种蛋白(Trf、HRP、IgG、Cyt C、Lyz)吸附图；
图11是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对蛋清实际样品吸附的SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明不受下述实施例的限定。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可通过市售购买得到的常规产品。
实施例1八氨基丙基倍半硅氧烷的制各
取40mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷于320mL甲醇溶液中，缓慢滴加54mL浓盐酸，室温搅拌7天，抽滤得白色粗产物，用四氢呋喃多次洗涤提纯，真空干燥。
实施例2本发明POSS@PBA的制备
称取150mg 4-氨基苯硼酸加入到含有250mg八氨基丙基倍半硅氧烷(POSS-(NH2)8)的30mL DMSO溶液中，超声分散均匀后，缓慢加入250μL三乙胺，室温搅拌12h后，缓慢滴加39.0mg戊二醛。室温搅拌12h后冰浴，加入5mL甲醇，分批加入100mgNaBH4，搅拌自然升至室温，加入2mL超纯水，继续搅拌5h，得POSS@PBA混悬液。
实施例3本发明POSS@PBA的制备
称取200mg 4-氨基苯硼酸加入到含有250mg八氨基丙基倍半硅氧烷(POSS-(NH2)8)的30mL DMSO溶液中，超声分散均匀后，缓慢加入250μL三乙胺，室温搅拌12h后，缓慢滴加23.2mg戊二醛。室温搅拌12h后冰浴，加入5mL甲醇，分批加入100mgNaBH4，搅拌自然升至室温，加入2mL超纯水，继续搅拌5h，得POSS@PBA混悬液。
实施例4本发明POSS@PBA的制备
称取250mg 4-氨基苯硼酸加入到含有250mg八氨基丙基倍半硅氧烷(POSS-(NH2)8)的30mL DMSO溶液中，超声分散均匀后，缓慢加入250μL三乙胺，室温搅拌12h后，缓慢滴加7.5mg戊二醛。室温搅拌12h后冰浴，加入5mL甲醇，分批加入100mg NaBH4，搅拌自然升至室温，加入2mL超纯水，继续搅拌5h，得POSS@PBA混悬液。
实施例5本发明POSS@PBA的制备
称取300mg 4-氨基苯硼酸加入到含有250mg八氨基丙基倍半硅氧烷(POSS-(NH2)8)的30mL DMSO溶液中，超声分散均匀后，缓慢加入250μL三乙胺，室温搅拌12h后，缓慢滴加7.5mg戊二醛。室温搅拌12h后冰浴，加入5mL甲醇，分批加入100mg NaBH4，搅拌自然升至室温，加入2mL超纯水，继续搅拌5h，得POSS@PBA混悬液。
图1是本发明实施例2、3、4、5制备的POSS@PBA对0.5mg/mL的Trf吸附效果图，吸附量分别为36.7、40.1、47.2、43.6mg/g。4-氨基苯硼酸在0.150～0.250g范围内，随着用量逐渐增多，材料中硼酸基团的含量线性升高，纳米材料对Trf的吸附量增加。而4-氨基苯硼酸的用量为0.300g时，材料的吸附量反而下降。
实施例6本发明Fe3O4纳米颗粒的制备
称取1.18g FeCl3·6H2O、0.43g FeCl2·4H2O溶解于20mL超纯纯水中，机械搅拌下，快速加入2.5mL的氨水，继续搅拌30min后，将反应体系转移到50mL离心管内。
实施例7本发明POSS@PBA/Fe3O4的制备
移取3mL POSS@PBA于离心管中，再加入30μL的Fe3O4混悬液，超声9min后，离心，依次用水和乙醇洗涤，40℃真空干燥，得到硼酸功能化磁性纳米材料POSS@PBA/Fe3O4。
实施例8本发明POSS@PBA/Fe3O4的制备
移取3mL POSS@PBA于离心管中，再加入60μL的Fe3O4混悬液，超声9min后，离心，依次用水和乙醇洗涤，40℃真空干燥，得到硼酸功能化磁性纳米材料POSS@PBA/Fe3O4。
实施例9本发明POSS@PBA/Fe3O4的制备
移取3mL POSS@PBA于离心管中，再加入90μL的Fe3O4混悬液，超声9min后，离心，依次用水和乙醇洗涤，40℃真空干燥，得到硼酸功能化磁性纳米材料POSS@PBA/Fe3O4。
实施例10本发明POSS@PBA/Fe3O4的制备
移取3mL POSS@PBA于离心管中，再加入120μL的Fe3O4混悬液，超声9min后，离心，保留固体，依次用水和乙醇洗涤，40℃真空干燥，得到硼酸功能化磁性纳米材料POSS@PBA/Fe3O4。
图2是本发明实施例7、8、9、10制备POSS@PBA/Fe3O4对0.5mg/mL的Trf吸附效果图，吸附量分别为43.3、38.8、34.7、29.6mg/g。Fe3O4混悬液加入量在10～40μL范围内，随着混悬液体积的增加，材料的吸附量呈线性减少。
实施例11本发明POSS@PBA/Fe3O4的制备：
移取3mL POSS@PBA于离心管中，再加入90μL的Fe3O4混悬液，超声9min后，离心，依次用水和乙醇洗涤，40℃真空干燥，得到硼酸功能化磁性纳米材料POSS@PBA/Fe3O4。
实施例12 POSS@PBA/Fe3O4NPs的TEM图测定
图3是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的TEM图。如图3所示，材料呈片状，粒径约为700nm左右，Fe3O4磁性纳米粒子均匀的分散于纳米材料表面。
实施例13 POSS@PBA/Fe3O4NPs的VSM图测定
图4是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的VSM图。如图4所示，POSS@PBA/Fe3O4NPs的饱和磁化强度值(Ms)为7.18emu/g，且具有超顺磁性。虽然POSS@PBA/Fe3O4NPs的磁饱和强度值相比于Fe3O4NPs有明显降低，但依然保有很强的磁响应性，在外磁场的作用下，分散在蛋白溶液中的磁性纳米材料可以快速分离。
实施例14红外表征
图5是本发明实施例6制备的Fe3O4(A)，实施例4制备的POSS@PBA(B)及实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs(C)的FT-IR图。Fe3O4、POSS@PBA和POSS@PBA/Fe3O4NPs的红外表征如图5所示。图5A中，3391cm-1和1612cm-1处为N-H键的伸缩振动和弯曲振动吸收峰；570cm-1处为Fe-O的伸缩振动吸收峰。图5B中，2928cm-1和2840cm-1处为CH2-中C-H键的对称伸缩振动和非对称伸缩振动吸收峰；1083cm-1处为Si-O-Si键的伸缩振动吸收峰，1338cm-1处为B-O键的伸缩振动吸收峰，1408cm-1处为C-B键的伸缩振动吸收峰；1564、1514、1408cm-1处为苯环骨架的特征吸收峰。图5C中可以找到上述吸收峰，说明4-氨基苯硼酸和Fe3O4成功地修饰到纳米材料上。
实施例15 XRD谱图测定
图6是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的XRD图。如图6所示，Fe3O4的特征峰(2θ＝30.10°，35.47°，43.31°，57.19°，62.72)在POSS@PBA/Fe3O4NPs的XRD谱图中出现，这些2θ值所对应的晶面指数分别为(220)，(311)，(400)，(511)和(440)，与JCPDS卡(19-629)中磁铁矿的数据一致。结果表明，分布于纳米材料表面的Fe3O4NPs具有较好的晶型。
实施例16 POSS@PBA/Fe3O4NPs的XPS图测定
图7是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs的XPS图。如图7所示，POSS@PBA/Fe3O4NPs在C1s(284eV)，O 1s(530eV)，B 1s(190eV)，Si 2s(153eV)，si 2p(101eV)以及Fe3p(53eV)，Fe 2p(710eV)有特征峰，这表明C，O，B，Si，Fe元素都在POSS@PBA/Fe3O4NPs表面，表明硼酸基团、Fe3O4纳米粒子成功的修饰到纳米材料表面。
实施例14对蛋白样品的吸附量测定
图8是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对三种蛋白的(Trf，Lyz，Cyt C)的等温吸附曲线。为考察POSS@PBA/Fe3O4NPs对蛋白样品的吸附饱和时间，分析了0～180min内不同孵育时间，材料对0.5mg/mL的Trf的吸附量。如图8所示，0～60min，POSS@PBA/Fe3O4NPs对糖蛋白的吸附量逐渐增加，60min时达到吸附平衡。因此，60min作为蛋白分离富集的孵育时间。
实施例15选择性吸附实验
对三种模板蛋白的等温吸附线如图9所示，相比于非糖蛋白Lyz和CytC，POSS@PBA/Fe3O4NPs对糖蛋白Trf展现出较好的选择吸附性。图9是不同的孵育时间下本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对浓度为0.5mg/mL的Trf的吸附图。在Trf浓度为0.5mg/mL时，纳米材料对Trf的吸附量为34.8mg/g，对Lyz和CytC的吸附量分别为5.95mg/g和9.49mg/g。当蛋白浓度为0.6mg/mL时，POSS@PBA/Fe3O4NPs对糖蛋白和非糖蛋白的吸附容量明显增加，表明蛋白浓度为0.6mg/mL时，材料对蛋白的吸附存在非特异性吸附。所以，选择0.5mg/mL标准蛋白对POSS@PBA/Fe3O4NPs的选择吸附性进行研究。
实施例16进一步地吸附量和选择性测定
为研究POSS@PBA/Fe3O4NPs选择吸附性，分析了材料对五种0.5mg/mL标准蛋白溶液(Trf、HRP、IgG、Cyt C和Lyz)的吸附容量。图10是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对浓度为0.5mg/mL的五种蛋白(Trf、HRP、IgG、CytC、Lyz)吸附图。如图10所示，POSS@PBA/Fe3O4NPs对糖蛋白Trf、HRP、IgG的吸附容量明显高于非糖蛋白Cyt C和Lyz。对糖蛋白Trf、HRP与Ig G的吸附量分别为34.8mg/g，26.60mg/g和33.78mg/g，而对非糖蛋白Lyz和Cyt C的吸附量分别为5.88mg/g和9.59mg/g。结果表明，POSS@PBA/Fe3O4NPs对糖蛋白具有较好的吸附选择性。
实施例17对蛋清实际样品进一步分离富集能力测定
本发明进一步考察了POSS@PBA/Fe3O4NPs对蛋清实际样品中的糖蛋白的分离富集能力。图11是本发明实施例11制备的POSS@PBA/Fe3O4NPs对蛋清实际样品吸附的SDS-PAGE图。lane 0，蛋白marker； lane 1，稀释200倍蛋清原液；lane 2，POSS@PBA/Fe3O4NPs吸附200倍蛋清的上清液；lane 3，吸附200倍蛋清的洗脱液；lane 4，稀释400倍蛋清原液；lane 5，POSS@PBA/Fe3O4NPs吸附400倍蛋清的上清液；lane 6，吸附400倍蛋清的洗脱液。
如图11所示，在lane 1和lane 4中，糖蛋白卵转铁蛋白(OVT，76.7kDa)、卵蛋白酶抑制物(49kDa)、卵清蛋白(OVA，46kDa)和非糖蛋白溶菌酶(Lyz，14.4kDa)均出现在稀释200倍和400倍的蛋清原液条带上。当加入POSS@PBA/Fe3O4NPs对蛋清稀释原液进行吸附后，糖蛋白卵转铁蛋白、卵清蛋白条带明显变浅，而溶菌酶条带几乎没有变化。通过酸性洗脱液对吸附的蛋白进行洗脱，两条清晰的糖蛋白(OVT、OVA)条带呈现在lane 3和lane 6上。结果表明，POSS@PBA/Fe3O4NPs可以用于复杂实际样品中糖蛋白的分离富集。

Claims (10)

1.一种一锅法制备硼酸功能化磁性纳米材料的方法：
将4-氨基苯硼酸加入到POSS-(NH2)8中，分散，加入三乙胺，搅拌，加入戊二醛。搅拌，冰浴，加入甲醇，加入NaBH4，搅拌，加入水，继续搅拌，得POSS@PBA混悬液；取POSS@PBA混悬液，加入Fe3O4混悬液，超声，离心，保留固体，干燥，即得。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：
将4-氨基苯硼酸加入到含有POSS-(NH2)8DMSO溶液中，超声分散后，缓慢加入三乙胺，室温搅拌，缓慢滴加戊二醛。室温搅拌后，冰浴，加入甲醇，分批加入NaBH4，搅拌自然升温，加入超纯水，继续搅拌，得POSS@PBA混悬液；取POSS@PBA混悬液中，再加入Fe3O4混悬液，超声，离心，保留固体，洗涤，真空干燥，即得。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于：
将4-氨基苯硼酸加入到含有250mg POSS-(NH2)8的30mL DMSO溶液中，超声分散均匀后，缓慢加入250μL三乙胺，室温搅拌12h后，缓慢滴加戊二醛。室温搅拌12h后冰浴，加入5mL甲醇，分批加入100mg NaBH4，搅拌自然升至室温，加入2mL超纯水，继续搅拌5h，得POSS@PBA混悬液；移取3mL POSS@PBA混悬液于离心管中，再加入Fe3O4混悬液，超声9min后，离心，保留固体，依次用水和乙醇洗涤，40℃真空干燥。
4.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于：
所述的八氨基丙基倍半硅氧烷的制备方法：取40mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷于320mL甲醇溶液中，缓慢滴加54mL浓盐酸，室温搅拌7天，抽滤得白色粗产物，用四氢呋喃多次洗涤提纯，真空干燥。
5.如权利要求1.3所述的方法，其特征在于：
所述的Fe3O4混悬液的制备方法：称取1.18g FeCl3·6H2O、0.43g FeCl2·4H2O溶解于20mL超纯纯水中，机械搅拌下，快速加入2.5mL的氨水，继续搅拌30min后，将反应体系转移到50mL离心管内。
6.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于：
步骤中所述滴加的4-氨基苯硼酸与戊二醛的比例为150-300mg∶39.0-7.50mg。
7.如权利要求1.3所述的的方法，其特征在于：
步骤中所述滴加的Fe3O4混悬液的体积为30-120μL。
8.一种采用权利要求1-3所述方法制备的硼酸功能化磁性纳米材料。
9.权利要求8所述的硼酸功能化磁性纳米材料在糖蛋白的分离纯化中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括转铁蛋白、辣根过氧化物酶蛋白、免疫球蛋白、细胞色素C、溶菌酶蛋白、蛋清实际样品。
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