KR20060061494A - 핵산(ｄｎａ/ｒｎａ) 분리정제용 기능성 실리카자성나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 분리정제용 기능성 실리카 자성나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 실리카 코팅된 자성나노입자의 표면에 아민(amino)기 또는/및 클로로(chloro)기를 도입하여 제조되는 기능성 실리카 자성나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
실리카, 자성나노입자, 마그네타이트, 핵산, 분리, 정제

Description

핵산(ＤＮＡ/ＲＮＡ) 분리정제용 기능성 실리카 자성나노입자 및 그 제조방법{Functionalized Silica Magnetic Nanoparticles for Separating-Purifying Nucleic Acid(DNA/RNA) and Method for Preparing the Same}
도 1은 본 발명에 따라 제조된 마그네타이트(magnetite) 입자의 SEM 이미지 및 마그헤마이트(maghemite) 입자의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 2a 내지 도 2g는 본 발명에 따라 제조된 마그네타이트(magnetite)를 입자크기 분석기(particle size analyzer)로 측정하여 입자크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 마그네타이트, 마그헤마이트 및 헤마타이트의 XRD 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 실리카 코팅 전/후의 자성나노입자의 기공구조에 대한 등온 패턴(isotherm pattern)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 실리카 코팅된 마그네타이트가 잘 분산되어 있음을 나타낸 SEM 사진이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 마그네타이트 나노입자를 (a)0.05M (b)0.1M, (c)0.5M, (d)1.0M TEOS 농도별로 코팅한 결과를 나타내는 SEM 사진이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 마그네타이트 나노입자의 EDS에 의한 성분 분석을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 실리카 코팅된 마그네타이트와 코팅되지 않은 마그네타이트의 FT-IR 및 UV-Vis.를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 실리카 코팅 자성 나노입자의 XRD 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따라 제조된 실리카가 코팅되지 않은 마그네타이트 및 실리카가 코팅된 자성 나노입자의 VSM 분석을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따라 APTES 또는 CPTES를 적용하여 치환기를 도입한 실리콘 자성나노입자의 표면의 FT-IR을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따라 제조된 (a) 실리카 코팅되지 않은 마그네타이트, (b) 실리카 코팅된 마그네타이트, (c) APTES-코팅된 마그네타이트, (d) CPTES-코팅된 마그네타이트, (e) APTES-CPTES-코팅된 마그네타이트의 제타 포텐셜에 의한 전하의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따라 제조된 (a) -NH2 가 도입된 자성나노입자, (b) -Cl 가 도입된 자성나노입자에 대한 BSA의 형광스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따라 제조된 실리카 자성나노입자의 BSA 흡·탈착에 따른 분리정제 효율을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 핵산(DNA/RNA) 분리정제용 기능성 실리카 자성나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 실리카 코팅된 자성나노입자의 표면에 아민(amino)기 또는/및 클로로(chloro)기를 도입하여 제조되는 기능성 자성나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
나노 구조물은 생체 분자인 단백질과 비슷한 크기로서 탄수화물, 지질, 중합체 등으로 제작될 수 있기 때문에 기능적, 물리적으로 대단히 다양한 특징을 가질 수 있다. 이러한 미세 단위의 구조적 다양성으로 인하여 전통기술로 접근하기 어려웠던 미니세계를 열어 새로운 산업적 적용의 길이 마련되고 신기능의 인조구조물을 개발할 수 있게 되었다.
금속산화물 나노입자를 이용한 새로운 DNA 정제기술은 출발물질인 세포막을 분해하는 과정부터 DNA를 분리하는 과정이 기존의 방법보다 혁신적으로 간편하게 할 수 있다는 점에서 현재 새로운 학문 영역으로 평가되고 있는 게노믹스(genomics)연구에 혁신적으로 응용 가능하다.
DNA는 A,G,C,T 네가지의 뉴클레오티드(nucleotide)로 구성된 폴리머(polymer) 복합체로 양전하(positive charge)를 띠고 있는 생체 고분자 물질로 생명체의 유전정보를 담고 있는 유전물이다. 따라서 유전자의 구성, 내용, 성질 등을 분석하기 위해서는 1차적으로 고순도의 DNA가 먼저 분리되어야 한다.
이상과 같이 자성나노입자 기술의 이용은 생명과학 전반에 필수적으로 필요한 생체내 핵산 고분자의 분리의 차세대 기술로 평가되고 있다. 또한, 향후 기능유전학 즉, 유전정보의 발현 단계인 단백질의 기능 규명 시 필요한 고순도 단백질 정제에도 응용 및 적용이 가능하여 향후 생체 고분자 분리 시 대표적 기술로서 각광을 받으며 큰 부가가치를 창출할 것으로 예상된다.
대한민국특허출원 제10-2003-0010279호는 γ-Fe2O3 및 테트라 에톡시 실란[TEOS; Si(OC2H4)4]을 사용하여 제조되는 실리카가 코팅된 상자성 나노입자의 제조방법에 대하여 개시하고 있는데, 이는 단백질을 분리 정제하기 위한 것으로서 DNA를 선택적으로 분리하기 위한 것은 아니다.
또한, 미국특허 제5,945,525호는 초상자성 산화철 Fe2O3 또는 γ-Fe2O 3와 테트라 에톡시 실란[TEOS; Si(OC2H4)4]로 제조된 실리카가 코팅된 자성입자를 사용하여 핵산을 분리하는 방법에 대하여 개시하고 있는데, 이는 핵산을 분리 정제하기 위한 것으로서 여기서 사용되는 약 0.5 내지 15 ㎛ 정도의 직경을 갖는 초상자성 산화철로는 DNA를 선택적으로 분리할 수 없는 단점이 있다.
또한, 미국특허 제6,027,945호는 실리카 자성입자를 이용한 핵산, DNA, RNA와 같은 생물학적 목적물을 분리하기 위한 방법에 대하여 개시하고 있는데, 여기서 사용되는 실리카 자성입자의 크기는 1 내지 15 ㎛ 정도로서 나노입자를 사용하는 경우에 비하여 선택적인 분리 정제를 하는데 있어서 수율이 떨어지는 단점이 있다.
이러한 종래 기술의 문제점으로 인하여, 핵산, DNA, RNA 등을 선택적으로 분 리할 수 있으며, 종래기술에 비하여 고순도 정제가 가능하며, 그리고 수득율을 높일 수 있는 기술이 요구되고 있다.
종래 기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 분자 단위 구조제어의 장점을 갖고 있는 금속산화물 나노입자를 합성한 후, 분자들을 분자레벨에서 자기 조립 단분자층 (self-assembled monolayer, SAM)을 형성시켜 선택적으로 DNA를 분리 할 수 있는 고기능성의 나노입자 소재 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 DNA, RNA, 단백질 등을 분리 정제하기 위한 기능성 자성 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 실리카 코팅된 자성나노입자에 유기 작용기를 도입하여 제조되는 기능성 자성나노입자에 관한 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 자성나노입자를 제조하는 단계; 상기 자성나노입자를 에탄올에 분산시킨 후, 0.5∼2M의 TEOS(tetraethyl orthosilicate)를 첨가하여 교반하면서, NH4OH 용액을 이용하여 pH를 11∼5 로 유지하며, 20∼24 시간 동안 110∼130℃에서 환류시킨 후, 건조시켜 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 실리카 코팅 자성나노입자를 에탄올에 분산시킨 후, 분산된 용액에 올가노(organo) 실란(silane) 결합제를 가하고 110∼130℃로 승온하여, 빠른 교반과 함께 혼합물을 6∼8 시간 동안 환류시켜 반응시킨 후, 세척 건조하여 유기 작용기를 갖는 기능성 자성나노입자를 제조하는 단계로 이루어지는 기능성 자성나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
바람직한 양태로서, 상기 자성나노입자는 마그네타이트(magnetite) 나노입자, 헤마타이트(hematite) 나노입자 및 마그헤마이트(maghemite) 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 양태로서, 상기 올가노 실란 결합제는 아미노(amino)-실란(silane) 결합제, 염소(chloro)-실란(silane) 결합제(coupling agents) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직한 양태로서, 상기 아미노-실란 결합제는 3-아미노프로필트리에톡시 실란(aminopropyltriethoxy silane; APTES)이며, 상기 염소-실란 결합제는 3-클로로프로필트리에톡시 실란(chloropropyltriethoxy silane; CPTES) 일 수 있다.
바람직한 양태로서, 본 발명에서 사용되는 상기 유기 작용기는 아민(amino)기 및 클로로(chloro)기 일 수 있다.
상기 마그네타이트(Magnetite) 나노입자는 여러 가지 방법으로 합성이 가능하나, 이들 중에서 습식법을 이용하여 합성할 수 있다. 먼저 FeCl2와 FeCl3를 물에 녹여 수용액을 만든다. FeCl2 용액과 FeCl3 용액을 함께 섞는다. 혼합된 용액을 교 반하면서 NH4OH 용액을 한방울씩 떨어뜨린다. 이 때 반응이 일어나면서 색깔은 점점 검정색으로 변하게 되며, 반응 후에 생긴 생성물은 원심분리한다. 원심분리 후 물과 에탄올로 세척한 다음 건조시켜 마그네타이트를 제조한다.
상기 헤마타이트(Hematite) 나노입자의 제조는 Fe(NO3)3·9H2O을 에탄올에 용해시킨다. 용해된 Fe(NO3)3 용액에 아세트산 무수물(acetic anhydride)로 가한다. 서서히 열을 가한 후 반응용액을 냉각시킨다. 얻어진 침전물은 여과하여 진공 건조시킨다. 건조된 생성물은 열처리를 통하여 α-Fe2O3를 제조한다.
상기 마그헤마이트(Maghemite) 나노입자의 제조는 옥틸에테르(Octyl ether)와 올레산(oleic acid)를 혼합시키고, 이 혼합물에 Fe(CO)5를 넣고 환류시키면서 반응을 시킨다. 이 반응이 개시되는 동안 색깔은 오랜지색에서 검정색으로 변화된다. 반응 후의 용액을 실온에서 냉각시킨 다음 (CH3)3NO를 첨가한다. (CH3) 3NO가 첨가된 혼합물을 아르곤 가스 분위기 하에 에이징(aging)한다. 이 때 혼합물의 색은 갈색으로 변한다. 반응 온도를 서서히 올려주면서 환류시킨다. 혼합물의 색은 다시 갈색에서 검정색으로 변하게 되며, 반응이 끝난 용액은 실온에서 냉각시킨 후 원심분리 한다. 원심분리 된 검은 침전물은 에탄올을 이용하여 세척 건조하여 마그헤마이트를 제조한다. 결과적으로 얻어진 침전물은 헥산이나 옥탄, 그리고 톨루엔 같은 탄화수소(hydrocarbon) 용매에 쉽게 분산시킨다.
본 발명에서 상기 자성나노입자에 실리콘을 코팅하는 방법은 제조된 마그네 타이트(magnetite)를 에탄올에 초음파 분산기(ultrasonification)를 이용하여 분산시키고, 분산된 용액에 0.5∼2M, 바람직하게는 1M의 TEOS(tetraethyl orthosilicate)를 넣고 교반한다. 교반상태에서 NH4OH 용액을 이용하여 pH를 10∼12, 바람직하게는 11로 유지하면서 20∼24시간, 바람직하게는 24시간 동안 110∼130℃에서 환류시킨다. 반응이 끝난 후, 원심분리를 하고 얻어진 침전물은 에탄올을 이용하여 세척 건조시켜 실리카가 코팅된 자성나노입자를 제조한다.
본 발명에서 실리카 코팅된 자성나노입자에 아민기 또는 클로로기와 같은 작용기를 도입하기 위한 방법은 제조된 실리카로 코팅된 자성나노입자를 에탄올에 분산시킨 후, 에탄올과 증류수로 희석시킨다. 이 용액을 초음파 분산기(ultrasonification)를 이용하여 분산시키고, 분산된 용액에 10 ml의 3-아미노프로필트리에톡시 실란(aminopropyltriethoxy silane; APTES) 및 3-클로로프로필트리에톡시 실란(chloropropyltriethoxy silane; CPTES)를 가한 뒤 온도를 110∼130℃, 바람직하게는 120℃로 올려준다. 이 때 빠른 교반과 함께 혼합물을 6∼8, 바람직하게는 7 시간 동안 환류시킨다. 반응이 끝나면 원심분리한 후, 물과 에탄올을 이용하여 3∼4번 세척한 후, 얻어진 분말은 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시킨다.
본 발명에서 사용되는 아미노 기능성 실란(amino functional silane)은 결합제(coupling agent)로서 활성화 물질의 고정에 사용된다. 실리카(silica) 표면에 형성된 수산(hydroxyl)기는 Si-O-Si와 같은 공유결합 형식에 의해 적당히 여러 실란(silane)기들 중 하나와 결합한다. 실란화(silanization) 반응은 두가지 단계로 나타난다. 첫째로, 실란 결합제(silane coupling agent)는 실란(silane) 고분자로 응축된다. 둘째, 이러한 고분자들은 실리카 코팅 자성 나노입자의 표면의 Si-OH와 연결된다. 이것은 탈수반응을 통해서 표면의 OH 그룹과 공유결합을 형성한다. 실란화(silanization) 과정에서 가장 중요한 면은 실리카 자성 나노입자(magnetic silica nanospheres)에 실란(silane) 고분자의 흡착 또는 공유결합에 사용된 탈수화 반응방법이다. 이러한 분자들의 회합은 유기용매와 물 사이에서 실란(silane) 고분자가 반응온도에 의해 결정된다. 아미노(amino)-실란(silane)/염소(chloro)-실란(silane) 결합제(coupling agents)는 두가지 특징을 가지고 있다. 그것은 실리카로 코팅된 마그네타이트(magnetite)에 흡착 또는 공유결합 할 수 있고, 또한 탈수화 반응에 의해 공유결합을 형성할 수도 있다. 치환그룹인 알데히드(aldehyde) 그룹은 단백질, 모노클로날(monoclonal) 항체 등에 생체친화적인 흡착제와 연결될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 자성나노입자의 합성
1. 마그네타이트(Magnetite) 나노입자 제조
먼저 FeCl2와 FeCl3를 물에 녹여 2M과 1M의 수용액을 제조하였다. 2M의 FeCl2 용액 1.0 ml와 1M의 FeCl3 용액 4.0 ml를 함께 혼합하였다. 혼합된 용액에 준비된 0.7M의 NH4OH 용액 50 ml를 교반(stirring) 하면서 한방울씩 적가하였다. 이 때 반응이 일어나면서 색깔은 점점 검정색으로 변하였고, 5 분 정도 반응 후에 생긴 생성물을 원심 분리하였다. 원심분리 후 2∼3번 물로 세척하고 마지막으로 에탄올을 이용하여 세척한 다음 건조시켰다.
2. 헤마타이트(Hematite) 나노입자 제조
Fe(NO3)3·9H2O(40.4g, 0.1mol)를 25 ml의 에탄올(ethanol)에 용해시켰다. 용해된 Fe(NO3)3 용액에 아세트산 무수물(acetic anhydride)(70ml, 0.74mol)을 가하였다. 서서히 열을 가한 후 반응용액을 0 ℃로 냉각시켰다. 얻어진 침전물은 여과하여 24 시간 동안 80 ℃에서 진공 건조시켰다. 건조된 생성물은 400 ℃에서 20 시간 동안 열처리를 통해 α-Fe2O3로 전환시켰다.
3. 마그헤마이트(Maghemite) 나노입자 제조
옥틸에테르(Octyl ether)(10 ml, 30 mmol)와 올레산(oleic acid)(1.28 g, 4.56 mmol)를 혼합시켰다. 이 혼합물에 Fe(CO)5(0.2 ml, 1.52 mmol)를 넣고 100 ℃에서 1 시간 동안 환류시켰다. 이 반응이 개시되는 동안 색깔은 오랜지색에서 검정 색으로 변하였다. 반응 후의 용액을 실온에서 냉각시킨 다음 (CH3)3NO(0.34g, 4.56mmol)를 첨가하였다. (CH3)3NO가 첨가된 혼합물을 130℃에서 아르곤 가스 분위기 하에 2 시간 동안 에이징(aging)하였다. 이 때 혼합물의 색은 갈색으로 변하였다. 반응온도를 서서히 300℃ 까지 올려주면서 1 시간 동안 환류시켰다. 혼합물의 색은 다시 갈색에서 검정색으로 변하였다. 반응이 끝난 용액은 실온에서 냉각시킨 후 원심분리 하였다. 원심분리 된 검은 침전물은 에탄올을 이용해 2∼3번 정도 세척하였다. 결과적으로 얻어진 침전물은 헥산, 옥탄, 톨루엔 등과 같은 탄화수소(hydrocarbon) 용매에 쉽게 분산시킨다.
실시예 2 : 자성나노입자의 실리카 코팅
실시예 1에서 제조된 0.5g의 마그네타이트(magnetite)를 에탄올 50ml에 초음파 분산기(ultrasonification)를 이용하여 30분간 분산시켰다. 분산된 용액에 1 M의 TEOS(tetraethyl orthosilicate)를 넣고 교반하였다. 교반상태에서 0.7 M의 NH4OH 용액을 이용하여 pH를 11로 유지하면서 24시간 동안 120 ℃에서 환류시켰다. 반응이 끝난 후, 원심분리를 하고 얻어진 침전물은 에탄올을 이용하여 2∼3번 세척한 후, 진공오븐을 이용하여 24 시간 동안 건조시켜 실리카가 코팅된 자성나노입자를 제조하였다.
실시예 3 : 기능성 자성나노입자의 제조
실시예 2에서 제조된 실리카로 코팅된 자성나노입자를 에탄올에 분산된 상태에서 25 ml를 취한 뒤 에탄올 100 ml와 증류수 1 ml로 희석시켰다. 이 용액을 초음파 분산기(ultrasonification)를 이용하여 30분간 분산시켰다. 분산된 용액에 10 ml의 3-APTES/3-CPTES를 가한 뒤 온도를 120℃로 올려주었다. 이 때 빠른 교반과 함께 혼합물을 7 시간 동안 환류시켰다. 반응이 끝나면 원심분리한 후, 물과 에탄올을 이용하여 3∼4번 세척한 후, 얻어진 분말은 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시켰다.
실시예 4 : BSA(Bovine Serum Albumin)의 흡ㆍ탈착 실험
아민(amino)기(3-APTES)와 염소(chloro)기(3-CPTES)의 유기실란 분자들로 치환된 자성나노입자를 0.05g, 0.025g, 0.125g씩 각각 취한 다음 0.033 wt%의 BSA/PBS 완충용액(buffer solution)에 가하였다. 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅(incubating) 시킨 후, 자석을 이용하여 BSA가 흡착된 실리카 코팅 자성나노입자 만을 분리하고, BSA가 흡착된 실리카 코팅 자성나노입자에 다시 일정량의 PBS를 가해 인큐베이팅(incubating)을 통해 탈착시켰다. 흡착된 BSA는 FP-640 스펙트로플루오로미터(spectroflurorometer) (JASCO)에 의해 280nm에서 표준 검량선법을 이용하여 정량분석을 하였다. (방출슬릿: 0.5nm, 흡수슬릿: 0.5 nm)
실시예 5 : 입자 크기별 나노입자 제조(Particle Size Analyzer)
수십-수백 나노미터의 나노입자를 제조하기 위해 마그헤마이트(maghemite) 및 헤마타이트(hematite), 그리고 마그네타이트(magnetite)를 크기별로 제조하였다. 마그네타이트(Magnetite) 나노입자는 습식법에 의해 제1철(ferrous)와 제2철(ferric) 이온용액으로부터 2 : 1의 몰비율에 의해 제조되었다. 마그네타이트(Magnetite) 나노입자는 습식법으로 제조했을 시 수용상에서 침전시키며, 침전물의 표면에 많은 수산(hydroxyl)기가 존재한다.
도 1의 SEM 이미지는 마그네타이트(magnetite) 입자를 보여주며, TEM 이미지는 마그헤마이트(maghemite) 입자를 보여주는 데, 각각 잘 분산되어 있음을 확인할 수 있다.
도 2a 내지 도 2g는 입자크기 분석기(particle size analyzer)에 의해 측정된 마그네타이트(magnetite)의 입자크기 분포를 나타낸 것이며, 마그네타이트의 입자크기는 150∼800nm의 분포를 나타내고 있음을 알 수 있다. 그리고 마그헤마이트는 8∼20nm, 헤마타이트는 30∼200nm의 크기를 지니고 있다.
자성나노입자의 제조에 있어서 Fe3O4의 스피넬(spinel) 구조를 가지고 있는지를 확인하기 위해 XRD 패턴을 분석하였다. 도 3에서 (220), (311), (400), (422), (511), (440)의 총 6개의 회절(diffraction) 피크를 가지고 있었으며, 마그헤마이트(maghemite)의 경우 (111)의 회절(diffraction) 피크에 의해 확인되었다. 헤마타이트(Hematite)의 경우 결정상은 열처리 온도에 의존함을 알 수 있었다.
실시예 6 : 실리카 코팅 자성 나노입자의 분석
실리카 코팅 자성 나노입자는 먼저 BET(Bruner-Emmet-Teller)의 비표면적[m2/g]에 의해 코팅여부를 확인할 수 있다. 실리카 코팅 자성 나노입자는 실리카 소스(silica source)에 의해 자성나노입자 표면의 -OH 기와 결합을 하면서 실리카(silica) 코팅층을 형성하게 되고, 이것은 자성나노입자 자체의 -OH 기보다 코팅층을 형성한 입자의 -OH가 감소하게 된다. 실험결과, 자성나노입자의 비표면적은 30∼124 m2/g을 갖는데, 실리카로 코팅된 후에는 0∼28 m2/g의 비표면적으로 감소하였다.
도 4는 실리카 코팅 전/후의 기공구조에 대한 등온 패턴(isotherm pattern)을 나타내고 있는데, 실리카 코팅 전에는 기공구조가 메조포러스 영역의 H4 이력곡선(hysteresis loop)을 잘 나타내고 있으나, 실리카 코팅 후에는 마이크로포러스(micorporous)한 패턴(pattern)을 나타내고 있다. 실리카는 NH4OH를 가하여 TEOS 용액에서 가수분해(hydrolysis) 시켰으며, SiO2 코팅층을 형성하기 위해 마그네타이트(magnetite) 표면에 형성시켰다. 도 4에서 X1은 30nm, X2는 100nm, X3는 600nm의 크기를 나타내는 것이다.
도 5는 실리카 코팅된 마그네타이트의 SEM 사진을 나타낸 것이며, SEM 이미지는 잘 분산되어 있는 실리카 코팅 자성 나노입자를 보여주고 있다.
또한, TEOS의 농도에 의한 입자의 코팅 두께 조절 실험을 수행하였으며, TEOS의 농도를 0.05∼1.0 M 까지 변화 시켜가면서 코팅막의 두께를 조절하였는데, TEOS의 농도가 적을수록 코팅막의 두께가 작아졌으며, 농도가 진할수록 코팅막의 두께가 증가하여 전체 입자의 크기가 증가하였다. 도 6은 181nm의 마그네타이트 자성나노입자를 (a)0.05M (b)0.1M, (c)0.5M, (d)1.0M TEOS 농도별로 코팅한 결과를 나타내는 SEM 이미지로서, 입자의 전체 크기가 200∼500 nm 크기로 증가하였음을 보여주고 있다.
코팅된 자성나노입자의 정성분석에서 중요한 것은 코팅의 확인여부이다. 이를 확인하기 위해 SEM에서의 EDS를 통해서 분석하였다. 도 7은 EDS 분석을 나타낸 것으로서 Fe, Si, O 등의 원소들이 검출됨을 나타내는데, 실리카 코팅에서 중요한 Si 원소가 7%의 조성비를 갖고 검출되었으며, 실리카 농도를 0.1M로 증가시킨 경우, 11%의 조성비를 갖는 것으로 확인되었다. 이를 통해 농도별에 따라 실리카(silica)의 코팅층의 양 및 코팅의 유무를 확인할 수 있었다.
코팅의 유무를 확인하기 위해서는 또 다른 방법으로 FT-IR 및 UV-Vis.로 분석을 할 수 있다. 도 8은 실리카 코팅된 마그네타이트와 코팅되지 않은 마그네타이트의 FT-IR 및 UV-Vis.를 나타낸 것으로서, FT-IR의 경우 1150cm-1에서 실리카(silica) 고유의 피크가 나타나게 되고, UV-Vis.의 경우 실리카 코팅 자성 나노입자에서 실리카 코팅층에 의한 흡수 분해능의 크기가 코팅되지 않은 나노입자 보다 훨씬 크기 때문에 쉽게 판별 할 수 있었다. 그러나 분광학적인 방법들은 실리카 코팅 유무에 대한 간접적인 판단법이다.
자성나노입자의 실리카 코팅에서 중요한 점은 코팅에 의한 자성나노입자의 구조적 변화이다. 즉, 자성 나노입자의 고유한 XRD 패턴이 변한다는 것이다. XRD 패턴의 변화가 일어나는 것은 자성나노입자가 가진 고유의 결정상의 변화를 의미하며 이는 자성의 세기에도 큰 영향을 미치게 된다. 이것은 DNA, RNA, 단백질 등의 분리 정제시 흡·탈착 효과에 매우 큰 영향을 미치게 된다. 도 9에 나타난 바와 같이, 실리카 코팅 자성 나노입자의 XRD 패턴은 코팅 전 자성나노입자 고유의 XRD 패턴을 그대로 유지하고 있어 구조적 변화가 없음을 잘 보여주고 있다.
도 10은 실리카가 코팅되지 않은 마그네타이트 및 실리카가 코팅된 자성 나노입자의 VSM 분석을 나타낸 것이다. 마그네타이트(magnetite)는 상자성체로서 외부 자성의 힘에 의해 반응을 하는 입자로써 이는 자화율을 통해 알 수 있다. 자화율은 VSM(Vibrational Sample Magnetometer)을 이용하여 측정하였다. 도 10은 자화율 측정을 보여주는 데, (a)는 실리카가 코팅되지 않은 마그네타이트(magnetite)의 자화율 및 자화곡선을 보여주며, (b)는 실리카가 코팅된 자성 나노입자의 자화곡선을 나타내고 있다. 또한 실리카 코팅 전후의 자화율 변화를 살펴보면, 코팅전에는 54 amu에서 17 amu로 감소하는 것으로 나타났다. 이는 코팅 되지 않은 자성 나노입자의 고유 자화율에서 실리카 층으로 코팅이 되면서 감소하게 되는 것으로 해석 되어지며, 전체적으로 값이 작은 이유는 크기가 나노화되면서 갖는 현상에 기인한다.
실시예 7 : APTES/CPTES를 적용하여 제조된 자성나노입자의 분석
실리콘 코팅된 자성나노입자의 표면에 APTES 또는 CPTES를 적용하여 치환기를 도입한 결과의 정성분석은 도 11에서와 같이 FT-IR을 이용하여 확인되었으며, 2700∼2900㎝-1사이에서 APTES와 CPTES의 알킬체인(alkyl chain) 피크가 잘 나타남으써 -NH4 및 -Cl이 치환되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 8 : 자성나노입자의 제타 포텐셜(Zeta Potential) 측정
제타 포텐셜 분석기(Zeta potential analyzer)에 의한 분석시 알 수 있는 결과는 표면의 변형(modification)을 통한 치환기 중 -NH2 기와 -Cl 기에 존재하는 전자쌍에 의해 전하(charge)의 크기가 커지거나 작아짐을 알 수 있다.
도 12는 제타 포텐셜에 의한 전하의 변화를 나타낸 것이다: (a) 실리카 코팅되지 않은 마그네타이트, (b) 실리카 코팅된 마그네타이트, (c) APTES-코팅된 마그네타이트, (d) CPTES-코팅된 마그네타이트, (e) APTES-CPTES-코팅된 마그네타이트. (d) -Cl의 경우는 비공유 전자쌍에 의해 음의 값을 띄어 -48.2mV의 수치를 갖게되는 반면, (c) -NH2는 질소원자가 가진 비공유 전자쌍보다 수소원자가 많으므로 양의 값을 띄게 되어 +42.17mV의 수치를 갖게 된다. 또한 -Cl은 자성나노입자 표면에 존재하는 -OH기보다 비공유 전자쌍 및 전기음성도가 더 크기 때문에 (a) 자성나노입자가 가진 -34.86mV 보다 큰 값을 띄게 되는 것이다. 따라서 (e) -NH2과 -Cl이 공존하는 실리카 자성나노입자(magnetic silica nanospheres)의 경우, 그 값은 -NH2만 결합된 입자와 -Cl만 결합된 입자의 중간값(2.24mV)을 띄게 된다.
실시예 9 : BSA 흡/탈착 정량적 평가
BSA는 제한효소와 함께 사용할 때 제한효소를 안정화 시키는 단백질로서 이는 효소의 농도와 관련이 있는데 일반적으로 효소는 낮은 농도에서는 활성도가 떨어지게 되므로 아주 적은 양의 제한효소를 사용할 때 반응용기 내의 작은 단백질 농도를 보완해 줄 수 있는 단백질이다.
도 13은 (a) -NH2 가 도입된 자성나노입자, (b) -Cl 가 도입된 자성나노입자에 대한 BSA의 형광스펙트럼을 나타낸 것이다.
BSA는 실리카 자성나노입자(magnetic silica nanospheres)의 표면에 공유결합에 의해 흡착되어지는데, BSA의 흡·탈착 측정은 형광스펙트럼(fluorescence spectroscopy)에 의해서 가능하며, BSA는 280nm에서 방출 파장을 가진다.
BSA의 흡·탈착은 치환기의 변화에 따라 달라지게 되는데, -NH2의 활성화 그룹을 가진 APTS는 BSA의 아민(amino)기와 상호작용에 의해 흡·탈착이 잘 유도되고, 반대로 CPTS는 -Cl과 BSA의 아민(amino)기의 상호작용이 APTS의 -NH2 보다 감소하기 때문에 흡·탈착의 효율은 그만큼 떨어지게 된다.
도 14 및 하기 표 1은 BSA 흡·탈착에 따른 분리 정제 효율을 나타낸 것이다. 아민기는 염소기 보다 더 좋은 흡·탈착 속성을 갖게 된다. 실리카 자성나노입자의 양에 의해서도 흡·탈착율은 차이를 보이게 된다. 실리카 자성나노입자의 양이 많아지면 BSA의 흡착량이 높아지게 되므로 탈착량도 높아지게 되고 반대로 실리카 자성나노입자의 양이 적어지면 BSA의 흡착량도 낮아지게 되므로 탈착량 또한 낮 아지게 된다.
Figure 112004056775570-PAT00001
본 발명에 따른 기능성 자성나노입자는 종래의 자성입자 보다 다양한 크기의 자성나노입자 제조가 가능하여, 크기별로는 플라스미드 DNA, 지노믹 DNA, PCR 등에 다양하게 적용할 수 있으며, 종래의 자성입자 보다 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득율이 높아 단위 시간당 필요한 시료 DNA를 많이 확보할 수 있으며, 목적 분자의 특성에 따라 자성나노입자를 가공하면 단백질, mRNA 등 생체고분자 물질을 고순도로 정제할 수 있어 기존의 HPLC, FPLC, 전기용동 등 생화학적 방법의 장시간의 분리 속도를 획기적으로 개선 할 수 있는 효과가 있다.

Claims (8)

  1. 실리카 코팅된 자성나노입자에 유기 작용기를 도입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 기능성 자성나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 자성나노입자는 마그네타이트(magnetite) 나노입자, 헤마타이트(hematite) 나노입자 및 마그헤마이트(maghemite) 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 자성나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 작용기는 아민(amino)기 또는 클로로(chloro) 임을 특징으로 하는 기능성 자성나노입자.
  4. 자성나노입자를 제조하는 단계;
    상기 자성나노입자를 에탄올에 분산시킨 후, 0.5∼2M의 TEOS(tetraethyl orthosilicate)를 첨가하여 교반하면서, NH4OH 용액을 이용하여 pH를 11∼5로 유지하며, 20∼24 시간 동안 110∼130℃에서 환류시킨 후, 건조시켜 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하는 단계; 및
    상기 실리카 코팅 자성나노입자를 에탄올에 분산시킨 후, 분산된 용액에 올가노(organo) 실란(silane) 결합제를 가하고 110∼130℃로 승온하여, 빠른 교반과 함께 혼합물을 6∼8 시간 동안 환류시켜 반응시킨 후, 세척 건조하여 유기 작용기를 갖는 기능성 자성나노입자를 제조하는 단계;
    로 이루어지는 기능성 자성나노입자의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 올가노 실란 결합제는 아미노(amino)-실란(silane) 결합제, 염소(chloro)-실란(silane) 결합제(coupling agents) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 자성나노입자의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 아미노-실란 결합제는 3-아미노프로필트리에톡시 실란(aminopropyltriethoxy silane; APTES)이며, 상기 염소-실란 결합제는 3-클로로프로필트리에톡시 실란(chloropropyltriethoxy silane; CPTES) 임을 특징으로 하는 기능성 자성나노입자의 제조방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 자성나노입자는 마그네타이트(magnetite) 나노입자, 헤마타이트(hematite) 나노입자 및 마그헤마이트(maghemite) 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 자성나노입자의 제조방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 유기 작용기는 아민(amino) 작용기 또는 클로로(chloro) 작용기 임을 특징으로 하는 기능성 자성나노입자의 제조방법.
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