KR100762969B1 - 기능성 실리카 코팅 자성 나노입자를 이용한 고효율의 핵산및 단백질의 선택적 분리정제 방법 - Google Patents

기능성 실리카 코팅 자성 나노입자를 이용한 고효율의 핵산및 단백질의 선택적 분리정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고순도 및 고용량으로 핵산과 단백질을 분리 정제할 수 있는 아미노 치환기 또는 알킬기와 아미노 치환기를 동시에 가지는 실리카 코팅 자성나노입자와 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 핵산에 특이적으로 결합할 수 있도록 실리카 코팅된 자성나노입자에 모노아민기, 다이아민기, 트라이아민기 또는 알킬기와 아미노기가 동시에 치환되어 핵산 및 단백질을 고순도 및 고용량으로 분리, 정제할 수 있는 기능성 자성나노입자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 아미노기가 치환된 자성나노입자는 종래의 자성입자 보다 다양한 크기로 제조될 수 있어서 크기별로는 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, PCR 등에 다양하게 적용할 수 있다. 또한, 종래의 자성입자에 비해서 in-situ 로 즉, 하나의 입자로서 핵산(DNA) 및 단백질을 초고속/고효율로 분리할 수 있는 장점이 있으며, 목적 DNA 및 단백질에 대한 결합성 및 수득율이 높아 단위 시간당 필요한 시료 생체시료 물질들을 많이 확보할 수 있으며, 기존의 분리 정제 공정을 획기적으로 개선할 수 있다. 목적 분자의 특성에 따라 자성나노입자를 임의로 가공하면 DNA를 고순도로 정제할 수 있으므로 기존의 HPLC, FPLC, 전기영동 등과 같은 시간 소모가 많은 생화학적 방법의 속도를 현저히 줄일 수 있다.
자성나노입자, DNA 분리정제, 실리카 코팅 자성나노입자, 아미노 및 알킬기가 치환된 실리카 코팅 자성나노입자, BSA 흡착

Description

기능성 실리카 코팅 자성 나노입자를 이용한 고효율의 핵산 및 단백질의 선택적 분리정제 방법{High Efficient Separation for Nucleic Acids and Proteins with Functionalized Silica-coated Magnetic Nanoparticles}
도 1은 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자(Magnetite)의 전자투과현미경(TEM)사진 및 XRD(X-ray diffraction pattern)이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 실리카 크기 제어형 자성나노입자(Magnetite)의 전자주사현미경(SEM) 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 실리카 크기 제어형 자성나노입자(Magnetite)의 전자투과현미경(TEM) 사진이다.
도 4는 분산제인 폴리비닐피롤리돈의 첨가 유무에 따른 자성나노입자의 SEM 사진이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 실리카 크기 제어형 자성나노입자(Magnetite)의 FT-IR 분석 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자와 실리카 코팅 후의 XRD 패턴이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자와 크기 제어형 실리카 코팅 후 의 자화율(magnetic moment) 변화를 나타내는 VSM(Vibrational Sample Magnetometer) 분석을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자와 크기 제어형 실리카 코팅 후의 기공구조에 대한 비표면적 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자와 크기 제어형 실리카 코팅 후의 VSM을 오버레이한 그래프 이다.
도 10은 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자와 크기 제어형 실리카 코팅 후의 자화율(magnetic moment), 표면적(surface area), 기공 부피(pore volume), 입자 크기를 오버레이한 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자와 아미노기가 치환된 실리카 코팅 마그네타이트의 CV(Cyclic Voltammetry)를 분석한 그래프이다. 도 11에서 갈색선은 마그네타이트, 적색선은 트라이아민, 청색선은 다이아민, 녹색은 모노아민기가 치환된 자성나노입자를 나타낸다.
도 12는 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자와 사람 DNA와 아미노기가 치환된 실리카 코팅된 자성나노입자의 CV(Cyclic Voltammetry) 분석 그래프이다. 도 12에서 적색선은 DNA가 흡착된 트라이아민, 청색선은 DNA가 흡착된 다이아민, 녹색선은 DNA가 흡착된 모노아민기가 치환된 자성나노입자를 나타낸다.
도 13은 본 발명에 따라 제조된 모노-, 다이- 및 트라이아미노기가 치환된 실리카 자성나노입자(Magnetite)의 FT-IR을 분석한 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따라 제조된 아미노 치환기를 붙인 실리카 자성나노입 자(Magnetite)의 XPS(X-ray Photoelectron spectrometer)이다.
도 15는 본 발명에 따라 제조된 아미노 치환기를 붙인 실리카 자성나노입자(Magnetite)의 XPS에 따른 성분 분석표이다.
도 16은 순수한 사람 DNA(R), 모노아민기가 치환된 자성나노입자(1, 4, 7, 10), 다이아민기가 치환된 자성나노입자(2, 5, 8, 11)와 트라이아민기가 치환된 자성나노입자(3, 6, 9, 12)를 이용하여 사람 DNA 흡착 실험을 실시한 후의 전기영동사진이다.
도 17은 순수한 사람 DNA(R), 모노아민기가 치환된 자성나노입자(M), 다이아민기가 치환된 자성나노입자(D)와 트라이아민기가 치환된 자성나노입자(T)를 이용하여 사람 DNA 흡착 실험을 실시한 후의 재현성 입증 전기영동사진과 흡착효능을 나타낸 그래프이다.
도 18은 순수한 사람 DNA(R), 트라이아민기가 치환된 10 mM 크기의 자성나노입자(1), 20 mM 크기의 자성나노입자(2), 30 mM 크기의 자성나노입자(3), 40 mM 크기의 자성나노입자(4), 50 mM 크기의 자성나노입자(5)를 이용하여 사람 DNA 흡착 실험을 실시한 후의 전기영동사진과 흡착효능을 나타낸 그래프이다.
도 19는 도 18의 결과에서 가장 효과가 좋은 20 mM을 사용하여 탈착 실험을 실시한 후의 전기영동 사진이다. 순수한 사람 DNA(R), 모노아민기가 치환된 자성나노입자(M), 다이아민기가 치환된 자성나노입자(D)와 트라이아민기가 치환된 자성나노입자(T)를 이용하여 사람 DNA 탈착 실험을 실시한 후의 전기영동사진과 탈착효능을 나타낸 그래프이다.
도 20에서 왼쪽 그림은 필터 방식과 자성 방식 핵산 소재의 분리능 비교 전기영동 사진과 오른쪽 사진은 왼쪽사진에서 분리 정제한 세포벽 파괴가 일어나지 않은 혈액 DNA에서 인간 베타 엑틴 유전자의 PCR 증폭 결과의 전기영동 사진이다.
도 21은 입체장애 효과를 이용하여 알킬 치환기의 사슬 길이에 따른 자성나노입자의 DNA 전기영동사진 및 흡착율을 나타낸 그래프이다.
도 22는 도 21에서 흡착시킨 DNA를 탈착시킨 후의 전기영동 사진이다.
도 23은 pH별 단백질 흡착정량 그래프이다.
도 24는 아미노기만이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자의 BSA 흡착률을 나타낸 그래프이다.
도 25는 모노아민, 다이아민, 트라이아민 치환기와 C3, C 12 , C8, C18을 각각 치환시킨 자성나노입자, 알킬기 없이 아민기만 치환된 자성나노입자 및 아민기 없이 알킬기만 치환된 자성나노입자의 BSA 흡착률을 나타낸 그래프이다.
도 26은 아민기와 알킬기가 동시에 치환되어 있는 실리카 자성나노입자의 탈착율을 나타낸 그래프이다.
도 27은 도 25의 샘플을 Confocal Imaging System 으로 촬영한 사진이다. 알킬기의 길이가 길어질수록 BSA가 더욱 많이 흡착되고 더욱 밝은 녹색으로 나타나고 있다.
본 발명은 고순도 및 고용량으로 핵산과 단백질을 분리 정제할 수 있는 아미노 치환기 또는 알킬기와 아미노 치환기를 동시에 가지는 실리카 코팅 자성나노입자와 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 핵산에 특이적으로 결합할 수 있도록 실리카 코팅된 자성나노입자에 모노아민기, 다이아민기, 트라이아민기 또는 알킬기와 아미노기가 동시에 치환되어 핵산 및 단백질을 고순도 및 고용량으로 분리, 정제할 수 있는 기능성 자성나노입자에 관한 것이다.
나노 구조물은 생체 분자인 단백질과 비슷한 크기로서 탄수화물, 지질, 중합체 등으로 제작될 수 있기 때문에 기능적, 물리적으로 매우 다양한 특징을 가질 수 있다. 이러한 미세 단위의 구조적 다양성으로 인하여 전통기술로 접근하기 어려웠던 초미세 세계를 열어 새로운 산업적 적용의 길이 마련되고 신기능의 인조구조물을 개발할 수 있게 되었다.
생명체의 유전정보를 담고 있는 유전물질인 DNA는 A, G, C, T의 네 가지 염기를 포함하는 뉴클레오티드로 구성된 고분자 복합체로서 양전하를 띠고 있는 생체 고분자 물질이다. 따라서 유전자의 구성, 내용, 성질 등을 분석하기 위해서는 1차적으로 고순도의 DNA가 먼저 분리되어야 한다.
금속산화물 나노입자를 이용한 새로운 DNA 정제기술은 출발물질인 세포막을 분해하는 과정부터 DNA를 분리하는 과정이 기존의 방법보다 혁신적으로 간편하게 할 수 있다는 점에서 현재 새로운 학문 영역으로 평가되고 있는 게노믹스 연구에 혁신적으로 응용 가능하다.
이처럼 자성나노입자 기술은 생명과학 전반에 필수적으로 필요한 생체 내 핵산 고분자 분리를 위한 차세대 기술로 평가되고 있다. 또한 기능유전학 즉, 유전정보의 발현 단계인 단백질의 기능 규명 시 필요한 고순도 단백질 정제에도 응용 및 적용이 가능하여 향후 생체 고분자 분리를 위한 대표적 기술로서 각광을 받으며 큰 부가가치를 창출할 것으로 예상된다.
대한민국 특허출원 제2003-10279호는 γ-Fe2O3 및 테트라에톡시실란[TEOS; Si(OC2H4)4]을 사용하여 제조되는 실리카가 코팅된 상자성 나노입자의 제조방법에 대하여 개시하고 있는데, 이는 단백질을 분리 정제하기 위한 것으로서 DNA를 선택적으로 분리하기 위한 것은 아니다.
미국 특허 제5,945,525호는 초상자성 산화철 Fe2O3 또는 γ-Fe2O3와 테트라 에톡시실란[TEOS; Si(OC2H4)4]으로 제조된 실리카가 코팅된 자성입자를 사용하여 핵산을 분리하는 방법에 대하여 개시하고 있는데, 이는 핵산을 분리 정제하기 위한 것으로서 여기서 사용되는 약 0.5 내지 15 ㎛ 정도의 직경을 갖는 초상자성 산화철로는 DNA를 선택적으로 분리할 수 없는 단점이 있다.
또한 미국 특허 제6,027,945호는 실리카 자성입자를 이용한 핵산, DNA, RNA와 같은 생물학적 목적물을 분리하기 위한 방법에 대하여 개시하고 있는데, 여기서 사용되는 실리카 자성입자의 크기는 1 내지 15 ㎛ 정도로서 나노입자를 사용하는 경우에 비하여 선택적인 분리 정제를 하는데 있어서 수율이 떨어진다.
이러한 종래 기술의 문제점으로 인하여, 핵산, DNA, RNA 등을 선택적으로 분리할 수 있고 종래기술에 비하여 고순도 정제가 가능하며 수득률을 높일 수 있는 기술이 요구되고 있다. 또한 단백질 및 DNA를 함께 정제할 수 있는 기술이 요구된다.
본 발명에서는 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 분자 단위 구조제어의 장점을 갖고 있는 금속산화물 나노입자를 합성한 후, 분자들을 분자레벨에서 자기 조립 단분자층(self-assembled monolayer, SAM)을 형성시켜 선택적으로 핵산과 단백질을 분리할 수 있는 고기능성의 자성나노입자 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 실리카 코팅된 자성나노입자에 아미노기가 치환된 기능성 자성나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 실리카 코팅된 자성나노입자에 알킬기와 아미노기가 동시에 치환된 기능성 자성나노입자 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기한 기능성 자성나노입자를 이용하여 핵산과 단백질을 각각 또는 동시에 고순도 및 고용량으로 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은
자성나노입자를 분산시키는 단계;
여기에 폴리비닐피롤리돈을 첨가하여 교반하고 아세톤 수용액을 첨가하여 원심분리한 후 유기용매로 세척하는 단계;
10 내지 50 mM의 테트라에틸 오쏘실리케이트를 첨가하고 교반 하에 염기를 첨가하여 pH를 11로 유지하면서 20 내지 24 시간 동안 100 내지 120 ℃에서 환류시킨 후 건조하여 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하는 단계;
상기 실리카 코팅된 자성나노입자를 분산시킨 후, 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 및 N'-[3-(트리메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 첨가하여 130 ℃까지 승온하고 급속 교반 하에 6 내지 8 시간 동안 환류시켜 반응시키는 단계; 및 생성된 반응물을 세척 건조하여서 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자의 제조방법을 제공한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은
자성나노입자를 분산시키는 단계;
여기에 폴리비닐피롤리돈을 첨가하여 교반하고 아세톤 수용액을 첨가하여 원심분리한 후 유기용매로 세척하는 단계;
10 내지 50 mM의 테트라에틸 오쏘실리케이트를 첨가하고 교반 하에 염기를 첨가하여 pH를 11로 유지하면서 20 내지 24 시간 동안 100 내지 120 ℃에서 환류시킨 후 건조하여 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하는 단계;
상기 실리카 코팅된 자성나노입자를 분산시킨 후, 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 및 N'-[3-(트리메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물 과 탄소원자수가 3 내지 18인 알킬기를 가지는 알킬트라이에톡시실란을 첨가하여 130 ℃까지 승온하고 급속 교반 하에 6 내지 8 시간 동안 환류시켜 반응시키는 단계; 및
생성된 반응물을 세척 건조하여서 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 알킬기와 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자의 제조방법을 제공한다.
바람직한 양태로서, 상기 자성나노입자는 마그네타이트(magnetite) 나노입자, 헤마타이트(hematite) 나노입자 및 마그헤마이트(maghemite) 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 마그네타이트(Magnetite) 나노입자는 여러 가지 방법으로 합성할 수 있으며, 이들 중에서 습식법을 이용하여 합성할 수 있다: 습식법에 따르면, 먼저 FeCl2와 FeCl3를 물에 용해하여 수용액을 만들고 FeCl2 용액과 FeCl3 용액을 함께 혼 합한다. 혼합된 용액을 교반하면서 NH4OH 용액을 한방울씩 적가한다. 반응이 진행되면서 점점 검정색으로 변하게 되는데 수득되는 생성물을 원심분리한다. 원심분리 후 물과 에탄올로 세척하고 건조시켜 마그네타이트를 제조한다.
이외에, 헤마타이트 나노입자의 제조는 Fe(NO3)3·9H2O을 에탄올에 용해시키고, 용해된 Fe(NO3)3 용액에 아세트산 무수물을 가한다. 서서히 열을 가한 후 반응 용액을 냉각시키고, 얻어진 침전물을 여과하여 진공 건조시킨다. 건조된 생성물은 열처리를 통하여 α-Fe2O3를 제조한다.
마그헤마이트 나노입자의 제조는 옥틸에테르와 올레산을 혼합시키고, 이 혼합물에 Fe(CO)5를 넣고 환류시키면서 반응시킨다. 이 반응이 개시되는 동안 색깔은 오랜지색에서 검정색으로 변화된다. 반응 후의 용액을 실온에서 냉각시킨 다음 (CH3)3NO를 첨가한다. (CH3)3NO가 첨가된 혼합물을 아르곤 가스 분위기 하에 에이징(aging)한다. 이 때 혼합물의 색은 갈색으로 변한다. 반응 온도를 서서히 올려주면서 환류시킨다. 혼합물의 색은 다시 갈색에서 검정색으로 변하게 되며, 반응이 끝난 용액은 실온에서 냉각시킨 후 원심분리한다. 원심분리된 검은 침전물은 에탄올을 이용하여 세척 건조하여 마그헤마이트를 제조한다. 얻어진 침전물은 헥산이나 옥탄, 그리고 톨루엔 등의 탄화수소 용매에 쉽게 분산된다.
본 발명에 따르면 자성나노입자는 다음과 같은 방법으로 실리콘 코팅 처리된다: 상기한 방법으로 얻어진 자성나노입자를 에탄올에 초음파 분산 기(ultrasonification)를 이용하여 분산시키고 폴리비닐피롤리돈을 첨가하여 실온에서 교반한다. 분산된 용액에 10 내지 50 mM의 테트라에틸 오쏘실리케이트(TEOS, tetraethyl orthosilicate)를 첨가하고 교반한다. 교반 상태에서 NH4OH 용액을 이용하여 pH를 10 내지 12, 바람직하게는 11로 유지하면서 20 내지 24시간, 바람직하게는 24시간 동안 100 내지 120 ℃에서 환류시킨다. 반응이 끝난 후, 원심분리하여 얻어진 침전물은 에탄올을 이용하여 세척 건조시켜 실리카 코팅된 자성나노입자를 제조한다.
도 1의 이미지는 마그네타이트의 제조 후 격자(cubic) 구조를 가지는 TEM 이미지와 그에 따른 XRD 분석이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 본 발명에서 제조된 마그네타이트는 문헌에 기재된 값과 일치하는 격자구조를 가진다.
도 2와 3의 SEM 이미지 및 TEM 이미지는 TEOS 농도에 따른 실리카 코팅된 자성나노입자의 크기를 나타낸 것으로, TEOS의 농도가 증가할수록 각각 크기가 상대적으로 커지는 것을 확인할 수 있다. TEOS의 농도가 적을수록 코팅막의 두께는 얇고 농도가 진할수록 코팅막의 두께가 증가하여 전체 입자의 크기도 증가한다. 본 발명의 방법에 따른 실리카 코팅층 형성을 확인하고 실리카층에 의한 자성나노입자 두께의 변화를 나타낸 투과전자현미경 사진들로, SEM과 TEM 모두 20만 배율의 사진이다. 이 사진들의 분석 결과에 따르면, 자성나노입자와 실리카 코팅된 자성나노입자의 크기는 TEOS 10 mM 당 약 2 nm씩 두께가 증가되었음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 방법에 따르면 실리카 코팅 자성나노입자의 크기를 임의로 제어할 수 있다
본 발명에서는 자성나노입자에 분산을 위해 폴리비닐피롤리돈(PVP)이 첨가된다. PVP의 첨가 유무에 따라 TEOS 코팅 분산 정도가 달라질 수 있는데, 하나하나씩 코팅되는 경우와 크게 덩어리져서 코팅되는 경우가 있다. 도 4는 분산제 PVP의 첨가 유무에 따른 전자주사현미경 사진이다.
도 5는 자성나노입자를 실리카 코팅한 후 분광학적인 방법으로 FT-IR을 측정한 그래프이다. Si-O 결합과 Si-H 결합이 생성되어 있음을 알 수 있다. 실리카의 함량이 많을수록 강도가 증가하며, 실리카 코팅된 마그네타이트와 코팅되지 않은 마그네타이트의 IR 피크를 1050 cm-1 근처에서 실리카 고유의 피크를 확인할 수 있다.
자성나노입자의 실리카 코팅에서 중요한 점은 코팅에 의한 자성나노입자의 구조적 변화이다. 즉, 자성나노입자의 고유한 XRD 패턴의 변화는 자성나노입자가 가진 고유의 결정상의 변화를 의미하며 이는 자성 세기에도 영향을 주어 DNA, RNA, 단백질 등의 분리 정제시 흡ㆍ탈착 효과에 매우 큰 영향을 미칠 수 있다. 도 6에서 보이는 바와 같이 본 발명에 따른 실리카 코팅 자성나노입자의 XRD 패턴은 코팅 전 자성나노입자 고유의 XRD 패턴을 그대로 유지하고 있어 구조적 변화가 없음을 나타낸다.
도 7은 실리카 코팅되지 않은 마그네타이트와 실리카 코팅된 자성 나노입자의 VSM(Vibrational Sample Magnetometer) 분석을 나타낸 것이다. 초상자성인 마 그네타이트는 외부 자성의 힘에 의해 반응을 하는 입자로써 이는 자화율을 통해 알 수 있으며 자화율은 VSM을 이용하여 측정된다. 도 7에서 ⓐ는 자성나노입자의 자화율 및 자화곡선을 보여주며, ⓑ, ⓒ, ⓓ, ⓔ, ⓕ는 실리카가 코팅된 자성나노입자의 자화곡선을 나타내고 있다. 또한 실리카 코팅 전후의 자화율 변화를 살펴보면, Ms(magnetic moment)의 값이 63.73 > 61.42 > 52.83 > 45.48 > 37.91 > 33.87 emu/g 의 크기를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 코팅되지 않은 자성나노입자의 고유 자화율이 실리카 코팅층이 형성되면서 감소하는 것으로 해석되며, 전체적으로 값이 작은 이유는 크기가 나노화되면서 갖는 현상이다.
본 발명에 있어서, 실리카 코팅된 자성나노입자는 도 8의 BET (Bruner-Emmet-Teller)의 비표면적[m2/g]에 의해서도 코팅층의 형성을 확인할 수 있다. 실리카 코팅 자성나노입자는 실리카 공급원에 의해 자성나노입자 표면의 -OH기가 결합되면서 실리카 코팅층을 형성하고, 이로 인하여 자성나노입자 자체의 -OH기보다 코팅층을 형성한 입자의 -OH기가 감소하게 된다. 그 결과, 자성나노입자의 비표면적이 65 m2/g인데 비하여 실리카로 코팅된 후에는 55 내지 20 m2/g의 비표면적으로 감소한다. 이러한 비표면적의 감소는 실리카 코팅층 형성에 대한 직접적 증거로서 반응을 통한 1차적 코팅효과를 암시한다
도 9는 자성나노입자와 크기 제어형 실리카 코팅 후의 자성나노입자의 VSM 측정데이타를 하나의 그래프로 오버레이한 그래프이다. 가열 곡선(heating run)과 냉각 곡선(cooling run)의 히스테리시스 루프(hysteresis loop)가 같아서 초상자성 을 가지고 있음을 알 수 있다.
도 10은 입자 코팅전후의 크기가 커짐에 따라 가지는 고유의 성질을 나타낸 그래프이다. 입자의 크기가 커질수록 표면적, 기공크기, 자화율이 감소함을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기한 방법으로 실리카 코팅된 자성나노입자에 기능성을 제공하기 위해 아미노 작용기 및/또는 알킬기가 치환된다. 본 발명의 한 구현예에 있어서, 아미노 작용기를 치환하기 위하여 실리카 코팅 자성나노입자를 유기용매에 분산시킨 후, 분산된 용액에 3-아미노프로필트라이에톡시 실란(3-Aminopropyltriethoxy silane), N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 (N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylene diamine), N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민 (N'-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]diethylene triamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 첨가한다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 아미노 작용기와 알킬기를 실리카 코팅된 자성나노입자에 동시에 치환하기 위하여 실리카 코팅 자성나노입자를 유기용매에 분산시킨 후, 3-아미노프로필트라이에톡시 실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민, N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물과 탄소원자수가 3 내지 18인 알킬기를 가지는 알킬트라이에톡시실란을 첨가한다. 본 발명에서 사용가능한 알킬트라이에톡시실란으로는 바람직하기로는 n-프로필트라이에톡시실란, n-옥틸트라이에톡시실란 또는 n-옥타데실트라이에톡시실란이 있다.
상기 혼합물의 온도를 고온으로, 바람직하게는 110 내지 130 ℃, 더욱 바람직하게는 130 ℃로 승온한다. 급속 교반 하에 혼합물을 6 내지 8 시간, 바람직하게는 7 시간 동안 환류시킨다. 반응이 끝나면 원심분리하고 물과 에탄올을 이용하여 3 내지 4번 세척한 후, 얻어진 분말은 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시켜서 아미노기가 치환된 실리카 코팅 자성나노입자를 제조한다.
본 발명에서 사용되는 아미노 기능성 실란(amino functional silane)은 결합제(coupling agent)로서 활성화 물질의 고정에 사용된다. 실리카 표면에 형성된 수산기는 Si-O-Si와 같은 공유결합 형식에 의해 적당히 여러 실란 기들 중 하나와 결합한다. 실란화(silanization) 반응은 두가지 단계로 나타난다. 첫째로, 실란 결합제는 실란 고분자로 응축된다. 둘째, 이러한 고분자들은 실리카 코팅 자성 나노입자의 표면의 Si-OH와 연결되는데, 탈수반응을 통해서 표면의 OH기와 공유결합을 형성한다. 실란 고분자들은 실리카로 코팅된 마그네타이트에 흡착 또는 공유결합할 수 있고, 또한 탈수화 반응에 의해 공유결합을 형성할 수도 있다. 치환그룹인 알데하이드 그룹은 단백질, 모노클로날(monoclonal) 항체 등에 생체친화적인 흡착제와 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 실리카 코팅된 자성나노입자와 3-아미노프로필트라이에톡시실란과 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민, N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민의 치환반응을 하기 반응식 1에 나타내었다 :
Figure 112006072542213-pat00001
도 11은 Cyclic voltammetry 분석 그래프이다. 마그네타이트의 경우 전극의 전하를 (+), (-)를 걸어주었을 때 그래프 변화가 심하여 표면에서 산화 환원이 활발하게 일어남을 알 수 있고 아민기가 함유된(모노아민:적색, 다이아민:청색, 트라이아민:녹색) 실리카 입자는 표면에서 산화환원 반응이 일어나지 않음을 알 수 있어서 산화 환원에 안정적이고 마그네타이트 표면을 모두 감싸고 있다는 것을 의미한다.
도 12는 DNA를 결합시킨 후의 CV 측정인데. 아민치환기 입자에 DNA가 흡착된 후에는 전기적 손실(electronic loss)이 증가하여 피크의 감도가 작아진다. 결국 이러한 변화는 DNA가 흡착되었음을 간접적으로 시사한다.
도 13은 실리카 코팅 후 아민기를 치환한 입자의 FT-IR 그래프이다. 2900 cm-1 근처에서 C-H 결합과 1500 cm-1 근방에서 C-N 결합의 피크가 검출된다. 치환기의 길이가 길어지면 각 결합의 수도 증가하기 때문에 강도가 증가한다.
도 14는 XPS 분석을 나타내는 그래프로, 아미노 치환기가 실리카 입자에 결 합되어 있음을 보여준다. 도 14에서 보이는 바와 같이, 마그네타이트에서 검출되지 않는 Si2s, Si2p 전자가 실리카 합성 후 검출되었으며, 실리카 입자에서 검출되지 않던 N1s,C1s 전자가 아민그룹의 합성 후 검출됨을 알 수 있으며 또한 원소의 함량이 증가함을 직접적으로 보여준다(도 15).
도 16에서 (R)레인은 순수한 사람 DNA를 전기영동한 사진이다. 추출된 DNA는 분광광도계(GeneQuant pro)를 이용하여 농도와 순도를 측정하였다. A260/A280 비율은 1.8 내지 1.9 사이였으며 DNA 농도는 242 ng/uL 임을 확인하였다. 도 16의 전기영동사진 상에 나타나는 밴드로부터 각각의 자성나노입자와 추출된 DNA 간의 결합력을 비교할 수 있다. 도 16에서 보이는 바와 같이 R은 대조용으로서 순수한 DNA 레인이며, 아민기의 치환도에 따라 전기영동사진의 밝기가 다른 것으로부터 아민기 치환도에 따른 DNA 결합력을 확인할 수 있다. 즉, 모노아민(1,4,7,10), 다이아민(2,5,8,11) 및 트라이아민(3,6,9,12)의 경우에는 특히 아민기의 수가 많을수록 또한 이미지의 (입자의 양을 늘린)오른쪽으로 갈수록 DNA 밴드가 거의 확인되지 않았다. 따라서, 치환기인 모노아민, 다이아민 또는 트라이아민의 농도가 진할수록 DNA가 더욱 흡착이 잘되는 것을 알 수 있다. 이것은 DNA 5' 말단 인산기가 음전하를 띄고 아민기의 NH2에서는 양전하를 띄어서 서로 정전기적 상호작용이 일어나기 때문이다. 도 17은 치환기로 모노아민(M), 다이아민(D), 트라이아민(T)을 가지는 실리카 코팅된 자성나노입자의 DNA 흡착효능을 동시에 비교한 전기영동 실험결과와 이를 수치로 환산하여 나타낸 그래프로, 트라이아미노 치환기를 가지는 실리카 코 팅된 자성나노입자의 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.
도 18은 흡착율이 가장 우수한 것으로 나타난 트라이아미노기를 가지는 실리카 코팅된 자성나노입자의 크기별 DNA 흡착효능을 나타낸 것으로, 실리카 코팅을 10 내지 50 mM 첨가하였을 때 각각 크기의 입자로 DNA를 흡착시켰다. 이미지와 정량그래프에서 보이는 것처럼 20 mM의 크기가 흡착율이 우수하고, 또한 입자의 양을 많이 첨가할수록 흡착량 또한 증가하였다.
도 19는 기능성 자성나노입자에 DNA를 100% 흡착하고 이것을 다시 탈착한 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 0.1 내지 0.7 M의 NaCl을 사용하였고 흡착율과는 반대로 탈착율의 결과가 나왔다. 모노아민의 경우는 트라이아민 보다 DNA에 대한 결합력이 약하여 상대적으로 빨리 탈착되는 것으로 보인다. NaCl은 수용액 중에서 이온화되어 이 이온들이 자성나노입자들의 표면을 둘러싸는 힘이 정전기적 인력보다 더 강하여 자성나노입자로부터 DNA가 떨어지게 된다.
도 20에서 왼쪽의 사진은 필터 방식과 자성 방식 핵산 소재의 분리능을 비교한 전기영동사진이다(세포벽 파괴가 일어나지 않은 혈액에서 분리 정제한 사람 게놈 DNA).
Lane M : DNA 크기 마커 (1 kb ladder)
Lane 01: 독일 키아젠사 필터 소재
Lane 02: 국산 제너럴바이오시스템사 필터 소재
Lane 03: 독일 빌라텍사 자성 마그네틱 소재
Lane 04: 본 발명의 방법으로 개발된 차세대 고분리 자성 마그네틱 소재
또한, 오른쪽의 사진은 왼쪽 사진에서 분리 정제한 세포벽 파괴가 일어나지 않은 혈액 DNA에서 인간 베타 엑틴 유전자의 PCR (polymerase chain reaction) 증폭 결과이다(인간 베타유전자 약 500 bp).
Lane M : DNA 크기 마커 (100 bp ladder)
Lane 01: 독일 키아젠사 필터 소재에서 분리한 DNA의 인간 베타 엑틴 유전자 PCR 증폭 결과
Lane 02: 국산 제너럴바이오시스템사 필터 소재에서 분리한 DNA의 인간 베타틴 유전자의 PCR 증폭 결과
Lane 03: 독일 빌라텍사 자성 마그네틱 소재에서 분리한 DNA의 인간 베타 엑틴 유전자의 PCR 증폭 결과
Lane 04: 본 발명의 방법으로 개발된 차세대 고분리 자성 마그네틱 소재에서 분리한 DNA의 인간 베타 엑틴 유전자의 PCR 증폭 결과
도 20에서 보이는 바와 같이 본 발명의 방법으로 개발한 차세대 핵산 분리 정제용 고기능성 실리카 코팅된 자성나노입자가 현재 시중에서 가장 범용적으로 사용되는 실리카 막 필터 소재들 보다 순도 및 분리되는 양에 있어서 훨씬 우수한 성능을 보임을 알 수 있다
도 21은 트라이아민과 알킬기(C3,C8,C18)를 동시에 실리카 코팅된 자성나노입자에 치환하므로써 입체장애효과를 나타내는 실리카 자성나노입자와 DNA의 흡착효능을 전기영동으로 측정한 이미지와 흡착율을 나타낸 그래프이다. 실리카 코팅된 자성나노입자에 알킬기를 도입하기 위하여 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민과 n-프로필트라이에톡시실란, n-옥틸트라이에톡시실란, 또는 n-옥타데실트라이에톡시실란을 1:1 비율로 반응시켰다. 알킬기의 길이가 길어질수록 정전기적 인력은 저하되고 입체장애가 발생하여 아민과 DNA의 결합이 어려워져서 아민기만이 치환되어 있을 때와는 반대로 DNA의 흡착율이 저하된다.
본 발명에 따른 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자와, 소수성 알킬 주머니에 의한 입체장애 효과를 내는 알킬기 및 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자는 상기한 바와 같은 정전기적 인력과 입체장애에 의해 고순도 및 고용량으로 핵산 및 단백질을 분리 정제할 수 있다.
도 22는 도 21에서 DNA가 흡착된 자성나노입자의 탈착율을 나타낸 전기영동사진이다. 기존의 방법보다 농도가 좀 더 진한 0.7 M의 NaCl 수용액을 첨가하여 탈착하였다. 그러나 알킬 사슬 사이에 흡착이 어려운 경우는 DNA 탈착에서도 좋지않은 결과를 보인다.
본 발명에 따르면, 실리카 코팅된 자성나노입자에 치환되는 알킬기는 바람직하기로는 탄소원자수가 3 내지 18인 알킬기이며, 더욱 바람직하기로는 n-프로필기, n-옥틸기 또는 n-옥타데실기이다.
N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민과 n-프로필트라이에톡시실란, n-옥틸트라이에톡시실란, 또는 n-옥타데실트라이에톡시실란을 첨가하여 실리카 코팅된 자성나노입자에 치환된 알킬기와 트라이아민기는 하기 그림과 같이 도시될 수 있다:
Figure 112006072542213-pat00002
도 23은 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 흡착율을 나타낸 것이며 도 21에서 실험한 입자를 사용하였다. 알킬 사슬의 길이가 길어질수록 알킬기가 치환된 입자의 소수성이 증가한다. 폭 5 nm, 길이 14 nm 정도의 BSA(MW 66,000) 단백질은 정전기적 성질보다 소수성이 더 크게 작용한다. 따라서 가장 소수성이 큰 C18 에서 가장 높은 흡착율을 나타내었다. 또한 pH에 따라서도 흡착율이 영향을 받는데 BSA는 음전하를 갖는 단백질이며 등전점인 pH 4.65에서 단백질 흡착율이 가장 우수한 것으로 나타났다. 이는 등전점 부근에서 자성나노입자와 단백질의 반발력이 최소가 되기 때문임에 기인한다.
도 24는 자성나노입자에 아미노기만을 치환하였을 때 BSA와의 흡착율을 나타낸 것이다. 트라이아민, 다이아민, 모노아민으로 갈수록 흡착율이 증가함을 확인할 수 있다. 단백질은 정전기적 인력이 작용하는 DNA의 흡착 성질과 달라 아미노 치환기가 적을수록 흡착이 잘된다. 본 발명에 따라 제조되는 아미노기 또는 알킬기와 아미노기가 치환된 실리카 코팅된 자성나노입자의 이러한 성질은 in-situ 방식으로 단백질과 DNA를 분리하는데 이용된다.
도 25는 모노아민, 다이아민, 트라이아민 치환기와 C3, C12, C8, C18을 각각 치환시킨 입자와 아미노기 없이 알킬기만 치환된 자성나노입자의 BSA 흡착을 나타낸 그래프이다. 알킬기의 길이가 길어질수록 소수성이 증가하여 소수성 효과가 커져서 BSA의 흡착률이 증가함을 볼 수가 있으며 모노아민이 치환된 입자의 효과가 가장 우수하였다.
도 26은 아민기와 알킬기가 동시에 치환되어 있는 실리카 자성나노입자의 탈착율을 나타낸 그래프로, 흡착 그래프와 반대되는 경향을 보인다. 소수성 효과가 크게 작용하여 흡착율이 높을수록 상대적으로 탈착율이 저조한 것으로 나타났다. NaCl은 수용액에서 이온화가 일어나며 이온들이 입자들의 표면을 둘러싸는 힘이 정전기적 인력보다 더 강하여 DNA가 떨어지게 된다. 이 실험에서는 1.0 M NaCl이 사용되었다.
도 27은 도 25의 샘플을 Confocal Imaging System 으로 촬영한 것이다. 알킬기의 길이가 길어질수록 BSA가 더욱 많이 흡착되고 더욱 밝은 녹색으로 나타나고 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 자성나노입자의 합성
먼저 FeCl2와 FeCl3를 물에 녹여 2M과 1M의 수용액을 제조하였다. 2M의 FeCl2 용액 60 ml와 1M의 FeCl3 용액 320 ml를 함께 혼합하였다. 혼합된 용액에 준비된 0.7M의 NH4OH 용액 400 ml를 교반하면서 한 방울씩 적가하였다. 이 때 반응이 일어나면서 색깔은 서서히 갈색에서 검정색으로 변하였고, NH4OH를 완전히 적가한 다음 5 분 정도 반응 후에 생긴 생성물을 원심분리하였다. 원심분리한 후 2 내지 3회 물로 세척하고 마지막으로 에탄올을 이용하여 2 내지 3회 세척하고 진공오븐에서 24시간 동안 건조시켜 자성나노입자를 제조하였다.
실시예 2 자성나노입자의 실리카 코팅
실시예 1에서 제조된 3 g의 마그네타이트를 초음파 분산기를 이용하여 분산(3 g/150 ml 수용액)시킨 후, 폴리비닐피롤리돈(Mw 55,000, 25.6 g/L 수용액) 6 ml를 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 다음으로, 아세톤 수용액(H20/아세톤=1/10, v/v)을 첨가하여 원심분리하여 상층액은 버리고 에탄올로 2 내지 3회 세척하였다. 다시 에탄올 300 ml에 분산시킨 다음, 분산된 용액에 10 내지 50 mM의 TEOS(tetraethyl orthosilicate)를 첨가하여 교반하였다. 교반 상태에서 0.7 M NH4OH 용액을 이용하여 pH를 11로 유지하면서 24시간 동안 100 ℃에서 환류시켰다. 반응이 끝난 후, 에탄올로 2 내지 3회 세척하고 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시 켜 실리카가 코팅된 자성나노입자를 제조하였다.
상기에서 얻어진 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM 및 50 mM의 TEOS를 사용한 각각의 자성나노입자의 전자주사현미경(SEM) 이미지를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보이는 바와 같이 SEM 이미지는 TEOS 농도에 따라 입자의 크기가 상대적으로 커지는 것을 알 수 있다. TEOS의 농도가 적을 수록 코팅막의 두께가 작아졌으며, 농도가 클수록 코팅막의 두께가 증가하여 전체 입자의 크기가 증가하였다.
실시예 3 아미노기가 치환된 기능성 자성나노입자의 제조
실시예 2에서 제조된 실리카로 코팅된 자성나노입자를 0.1 g씩 3개를 취하고 톨루엔에 분산된 상태에서 0.1g의 3-아미노프로필트라이에톡시실란과 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민, N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민을 각각 첨가하였다. 전체 샘플의 온도를 130 ℃로 승온하고 이 때 빠른 교반과 함께 혼합물을 7 시간 동안 환류시켰다. 반응이 끝나면 원심분리한 후, 톨루엔을 이용하여 3 내지 4회 세척한 후, 원심분리하여 얻어진 분말을 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시켰다.
실시예 4 알킬기와 아미노기가 치환된 기능성 자성나노입자의 제조
실시예 2에서 제조된 실리카로 코팅된 자성나노입자를 0.1 g씩 3개를 취하고 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민 0.05 g과 n-프로필트라이에톡시실란, n-옥틸트라이에톡시실란, n-옥타데실트라이에톡시실란 0.05 g씩을 각 각 첨가하여 반응시켰다. 전체 샘플의 온도를 130 ℃로 승온하고 이 때 빠른 교반과 함께 혼합물을 7 시간 동안 환류시켰다. 반응이 끝나면 원심분리한 후, 톨루엔을 이용하여 3 내지 4회 세척한 후, 원심분리하여 얻어진 분말을 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시켰다.
실시예 5 입자 크기별 나노입자 제조
다양한 크기를 가지는 나노입자를 제조하기 위해 마그네타이트를 크기별로 제조하였다. 마그네타이트 나노입자는 습식법에 의해 제 1철(ferrous)과 제 2철(ferric) 이온 용액으로부터 2 : 1의 몰비율에 의해 제조되었다. 마그네타이트 나노입자는 습식법으로 제조했을때 수용상에서 침전시키며, 침전물의 표면에 많은 수산기가 존재한다.
자성나노입자의 제조에 있어서 Fe3O4의 스피넬(spinel) 구조를 가지고 있는지를 확인하기 위해 XRD 패턴을 분석하였다. 도 1에 보이는 바와 같이 (210), (311), (400), (422), (511), (440)의 총 6개의 회절 피크를 가지고 있었다.
실시예 6 사람 DNA에 대한 흡착/탈착 정량적 평가
1) DNA 추출
DNA와 자성나노입자의 결합력을 비교하기 위하여 먼저 박테리아(E.coli)로부터 하기한 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다 : 먼저 멸균한 LB 배지에 균주를 접종 한 후 37℃, 200 rpm에서 하루 동안 배양하고, 충분히 배양된 균주 1 mL를 취하여 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮긴 후 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버린 다음, 여기에 세포 용해 완충액 300 uL를 첨가하고 피펫으로 침전된 펠릿을 고르게 현탁하였다. 또한 세포를 완전히 분해하기 위하여 80 ℃에서 5분 동안 반응시켰다.
5분 후 용액을 실온에서 냉각하고 용액 속의 RNA를 제거하기 위하여 3 uL의 RNase A (5 mg/mL)를 첨가하여 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 100 uL의 PPT 용액을 첨가하고 20초 동안 고르게 섞이도록 교반하였으며 교반 후 빙냉 하에 5분 동안 정치하였다. 반응이 끝난 튜브를 다시 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.
원심분리 후 펠릿을 제외한 상층액을 조심스럽게 취하여 새로운 1.5 mL 마이크로 튜브에 옮기고 600 uL의 DNA 결합용 완충액을 첨가하여 고르게 교반하였다. 미리 준비된 스핀 컬럼을 수집 용기에 넣고 DNA 결합 완충액이 혼합된 샘플 650 uL를 취하여 스핀 컬럼의 중앙부에 조심스럽게 첨가한 후 12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 이때 용액은 스핀 컬럼의 멤브레인을 통과하게 되고 용액 속의 DNA는 필터 멤브레인에 결합하게 된다.
원심분리가 끝난 후 수집 용기에 담긴 용액을 제거하고 스핀 컬럼을 다시 장착한 다음 준비된 세척용액 600 uL를 넣은 후 동일하게 12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 멤브레인에 존재하는 염을 제거하였으며 이를 2회 반복하였다.
세척이 끝난 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣은 후 100 uL의 멸균 증류수 또는 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)을 멤브레인의 중앙에 조심스럽게 넣고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 멤브레인에 결합된 DNA를 용출하였다. 얻어진 DNA는 다음 실험까지 4 ℃에 보관하였다.
2) 자성나노입자와 DNA의 결합
하기 표 2에 기재된 조성의 자성나노입자 50 mg을 정확하게 취하여 각각 1.5 mL 마이크로 튜브에 투여하고 멸균 증류수 500 uL를 첨가하여 자성나노입자 용액을 준비하였다.
상기한 1)의 방법으로 미리 준비된 DNA 용액을 96 웰 플레이트에 일정량을 각각 첨가하고 피펫으로 자성나노입자 용액을 위하여 각 웰에 접종하였다. 자성나노입자와 DNA와의 접촉성을 높이기 위하여 1분간 고르게 교반하였으며 충분한 반응을 위하여 교반 후 5분간 정치하였다. 이때 DNA 및 자성나노입자의 농도에 따른 결합력을 비교하기 위하여 DNA 농도는 100 ng/uL가 되게 하였으며 자성나노입자의 농도는 5 uL를 첨가하였다.
자성나노입자를 용액으로부터 분리하기 위하여 자성 분리기에 96 웰 플레이트를 올려 놓은 후 자성나노입자가 완전히 자석에 고정될 수 있도록 약 5분 동안 정치하였다. 자성나노입자가 완전히 분리된 후 피펫으로 96 웰 플레이트로부터 용액만 조심스럽게 취하여 새로운 마이크로 튜브에 분주하였다.
모아진 용액은 자성나노입자와 DNA와의 결합력을 확인하기 위하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 그 결과를 도 16, 17, 18에 나타내었다.
또한 탈착율의 결과는 0.1 내지 0.7 M NaCl 수용액을 사용하여 도 19에 나타내었다.
실시예 7 단백질에 대한 흡착 정량적 평가
1) 단백질로는 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, 분자량 66,000, Aldrich사 제품)을 사용하였다. 실시예 4에서 제조된 트라이아미노기와 n-프로필기, n-옥틸기 또는 n-옥타데실기가 치환된 실리카 코팅된 자성나노입자의 소수성을 이용하여 단백질을 흡착시켰다.
2) 완충액의 제조
pH 4.65 0.1M PBS 완충액은 Sodium phosphate monobasic monohydrate 6.876 g과 Sodium phosphate dibasic 0.0465 g을 증류수 500 mL를 첨가하고 스터링 바(stirring bar)로 잘 교반하여 제조하였다. pH 7.5 0.1M PBS 완충액은 Sodium phosphate monobasic monohydrate 1.5585 g과 Sodium phosphate dibasic 10.3735 g을 증류수 500 mL에 첨가하고 잘 교반하여 제조하였다. pH 11의 PBS 완충액은 증류수 500 mL에 Sodium phosphate dibasic 3.549 g(0.05M)를 첨가하고 잘 교반하여 제조하였다. 증류수 250 mL에 1 g의 NaOH를 넣은 용액 41 mL를 취해 상기한 0.05 M Na2HPO4와 잘 혼합하였다.
3) BSA 흡착
BSA 0.033 g을 상기에서 제조한 pH 4.65, pH 7.5, pH 11 완충액 50 mL에 각각 첨가하여 잘 교반하였다. 총 3개의 1.0×10-5M BSA 용액을 제조하였다. 합성한 입자 각각을 40 mg씩 취하여 4 mL 셀(cell)에 pH별로 제조한 BSA 용액 3 mL에 넣고 vortex로 잘 섞어주었다. 각 pH 용액 마다 3개씩 총 9개의 용액을 제조하여 24 시간동안 vortex mixing 하였다. 자석을 이용하여 자성나노입자를 고정시키고 여액을 추출하여 UV-분광기로 정량적 평가를 수행하고, 그 결과를 도 25와 도 27에 나타내었다.
도 25에서 보이는 바와 같이, 모노아민 치환기를 가지며 치환된 알킬기의 길이가 길수록 BSA의 흡착률이 높은 것으로 나타났다.
4) BSA 탈착
증류수 100 mL에 NaCl 5.844 g을 용해하여 1 M NaCl 100 mL 용액을 제조하였다. 3)에서 pH 4.65에서 흡착시킨 여액을 제거하고 자석으로 고정시킨 자성나노입자 만을 취하여 완충액으로 세척하였다. 상기에서 제조한 1 M NaCl 3 mL를 각각의 셀에 넣고 vortex로 잘 섞어주었다. 24시간 동안 vortex mixing 하였다. 자석을 이용하여 자성나노입자를 고정시키고 여액을 추출하여 UV-분광기로 정량적 평가를 수행하고, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에서 보이는 바와 같이, 치환된 알킬기의 사슬이 길고 모노아민기가 치 환된 실리카 코팅된 자성나노입자는 소수성 효과가 커서 BSA 흡착률이 우수하지만 탈착율은 저조한 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 아미노기가 치환된 자성나노입자는 종래의 자성입자 보다 다양한 크기로 제조될 수 있어서 크기별로는 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, PCR 등에 다양하게 적용할 수 있다.
또한, 종래의 자성입자 보다 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득률이 높아 단위 시간당 필요한 시료 DNA를 많이 확보할 수 있으며, 목적 분자의 특성에 따라 자성나노입자를 가공하면 DNA를 고순도로 정제할 수 있으므로 기존의 HPLC, FPLC, 전기영동 등과 같은 시간 소모가 많은 생화학적 방법의 속도를 획기적으로 개선할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따른 탄소원자수가 3 내지 18인 알킬기와 아미노기가 치환된 실리카 코팅된 자성나노입자는 소수성 효과를 이용하여 DNA와 단백질이 혼합된 상태에서도 이들을 선택적으로 분리가능하다.

Claims (8)

  1. 자성나노입자를 분산시키는 단계;
    여기에 폴리비닐피롤리돈을 첨가하여 교반하고 아세톤 수용액을 첨가하여 원심분리한 후 유기용매로 세척하는 단계;
    10 내지 50 mM의 테트라에틸 오쏘실리케이트를 첨가하고 교반 하에 염기를 첨가하여 pH를 11로 유지하면서 20 내지 24 시간 동안 100 내지 120 ℃에서 환류시킨 후 건조하여 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하는 단계;
    상기 실리카 코팅된 자성나노입자를 유기용매에 분산시킨 후, 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 및 N'-[3-(트리메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 첨가하여 130 ℃까지 승온하고 급속 교반 하에 6 내지 8 시간 동안 환류시켜 반응시키는 단계; 및
    생성된 반응물을 세척 건조하여서 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 자성나노입자가 마그네타이트 나노입자, 헤마타이트 나노입자 및 마그헤마이트 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자의 제조방법.
  3. 자성나노입자를 분산시키는 단계;
    여기에 폴리비닐피롤리돈을 첨가하여 교반하고 아세톤 수용액을 첨가하여 원심분리한 후 유기용매로 세척하는 단계;
    10 내지 50 mM의 테트라에틸 오쏘실리케이트를 첨가하고 교반 하에 염기를 첨가하여 pH를 11로 유지하면서 20 내지 24 시간 동안 100 내지 120 ℃에서 환류시킨 후 건조하여 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하는 단계;
    상기 실리카 코팅된 자성나노입자를 유기용매에 분산시킨 후, 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 및 N'-[3-(트리메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물과 탄소원자수가 3 내지 18인 알킬 치환기를 가지는 알킨트라이에톡시실란을 첨가하여 130 ℃까지 승온하고 급속 교반 하에 6 내지 8 시간 동안 환류시켜 반응시키는 단계; 및
    생성된 반응물을 세척 건조하여서 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 알킬기와 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자의 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 자성나노입자가 마그네타이트 나노입자, 헤마타이트 나노입자 및 마그헤마이트 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 알킬트라이에톡시실란이 n-프로필트라이에톡시실란, n-옥틸트라이에톡시실란 또는 n-옥타데실트라이에톡시실란인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 따른 방법에 의해 제조되는 3-아미노프로필트라이에톡시실라노기 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아미노기 및 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아미노기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 치환기를 가지는 실리카 자성나노입자.
  7. 제 3항에 따른 방법에 의해 제조되는 아미노기와 탄소원자수가 3 내지 18인 알킬기가 치환된 실리카 자성나노입자.
  8. 핵산 또는 단백질을 함유하는 용액과 제 6항 또는 제 7항에 따른 자성나노입자의 용액을 반응시키고 자성 분리기를 이용하여 반응 용액으로부터 핵산 또는 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 자성나노입자를 이용한 핵산 또는 단백질의 선택적 분리정제방법.
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