KR20050018663A - 기능성 나노입자 및 사용 방법 - Google Patents

기능성 나노입자 및 사용 방법

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KR20050018663A
KR20050018663A KR10-2004-7016979A KR20047016979A KR20050018663A KR 20050018663 A KR20050018663 A KR 20050018663A KR 20047016979 A KR20047016979 A KR 20047016979A KR 20050018663 A KR20050018663 A KR 20050018663A
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cell
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웨이홍 탄
진 샤우구앙
자이조준 쟈오
로블린타펙 다이타이오코
티모시제임스 드라케
리사르네 힐라드
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유니버시티 오브 플로리다
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    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B82B3/0009—Forming specific nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract

항체 및 뉴클레오티드와 같은 생물학적으로 활성 분자로 기능을 가진 실리카-코팅된 나노입를 세포 라벨에 사용하여 특정 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자를 감지 분지하고, 상이한 핵산 분자 혼합물을 분리하는데 이용한다.

Description

기능성 나노입자 및 사용 방법{FUNCTIONALIZED NANOPARTICLES AND METHODS OF USE}
관련출원
본 출원은 2002년 4월 22일에 출원된 미국 가특허출원 제 60/375,122호 및 제 60/374,405호의 이익을 주장한다.
연방 지원 연구에 대한 언급
본 발명은 해군 연구소에서 수여된 인정 번호 제N00014-98- 1-0621호; 국립 과학 재단에서 수여된 인정 번호 제 DBI-9871880호, CTS-0087676호, 그리고 제CHE-9733650호; 그리고 국립 건강 협회에서 수여된 인정 번호 제 CA92581호 및 제 NS39891호에 의한 미국 정부의 지원 하에서 개발되었다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 일부 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 나노입자 및 나노입자를 제조하고 사용하는 방법의 분야에 관련된다. 특히, 본 발명은 생물학적 활성 물질로 코팅된 나노 입자 및 그러한 나노입자를 사용하는 방법에 관련된다.
나노입자는 일 나노미터에서 수백 나노미터 직경 범위의 크기를 갖는 매우 작은 입자이다. 그들의 작은 크기는 예를 들면, 수많은 다양한 생물학적 및 의학적 용도에 유용한 도구를 포함하는 다양한 제품을 제조하는데 활용되도록 한다.
도 1은 본 발명에서 유용한 나노입자의 단면도이다.
도 2는 본 발명에서 유용한 나노입자를 만드는 방법에 관련된 일반적 단계를 도시하는 흐름도이다.
도 3은 나노입자를 사용하여 세포를 표지(labeling)하는 방법을 도시하는 두 개략도(A 및 B)이다.
도 4는 핵산 분자의 존재를 탐지하는 방법의 개략도이다.
도 5는 특정 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하고 탐지하기 위한 분자 표지 (MB) 용도의 고도의 개략도이다 .
도 6은 핵산 및 단백질의 복합체 혼합물로부터 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(DNA1')를 분리하는 것에 관련된 단계의 개략도이다.
도 7은 본 발명의 핵산 탐지를 위한 방법의 단일-염기 미스매치 선택성을 도시하는 두 그래프이다. (A) 완전히 상보적인 핵산으로 부터의 시그널 vs 단일 염기 미스매치 핵산으로 부터의 시그널 (B) A-T 단일 염기 미스매치로 부터의 시그널 vs G-C 단일 염기 미스매치로부터의 시그널.
도 8은 제노마그네틱 나노캡쳐(geonomagnetic nanocapturers)에 MB 고정 (MB-GMNCs), 또는 용액 내에서 유리된(free) 조건 하에서 표적 DNA 서열에 중복된(duplexed) MB의 녹는 온도 프로필(profiles)을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 9는 복합체 DNA-단백질 혼합물로부터 미량의 DNA 표적의 캡쳐하는 MB-GMNCs의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 10는 세포 라이세이트(lysate)로부터 미량의 표적 mRNA를 캡쳐하는 MB-GMNCs의 능력을 도시하는 그래프이다.
발명의 상세 설명
생물학적 활성 실리카-코팅된 나노입자가 실리카 외피로 둘러싸인 코어로 구성된 균일한 크기의 입자를 산출하는 유중수 마이크로에멀젼(water-in-oil microemulsion) 방법을 사용하여 제조된다. 이 마이크로에멀젼은 등방성의, 열역학적으로 안정한 단일-상 시스템을 형성하기 위하여 물과 같이 비교적 극성 액체와, 액체 알칸과 같이 비교적 비-극성 액체, 그리고 하나 이상의 계면활성제를 조합함으로써 제조된다. 이 시스템은 나노입자 코어를 형성하기 위한 리액터(reactors)로 작용하는 복수의 매우 작은 구형 물 풀(pools) [즉, 역 마이셀(reverse micelles)]로 구성된다. 코어가 형성된 후, 그들은 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS)와 같은 실리케이팅제(silicating agent)를 사용하여 코팅된다. 이들 실리카-코팅된 나노입자를 생물학적 활성으로 만들기 위하여, 실리카 코팅은 핵산 또는 폴리펩티드와 같은 하나 이상의 생물학적 활성 작용기와 접합된다. 이하에서 설명된 바람직한 실시예는 본 발명의 다양한 변형을 도시한다. 그럼에도 불구하고, 이들 실시예의 설명으로부터 본 발명의 다른 측면은 이하에서 설명된 구성요소를 약간 변형 및 조정함으로써 쉽게 형성될 것이다.
나노입자의 특성
간략히, 도 1을 참조하면, 바람직한 본 발명의 나노입자 (10)는 코어 (12), a 코어 (12)를 코팅하는 외피 (14), 그리고 외피 (14)에 유도된 하나 이상의 작용기 (16)를 포함한다. 비록 나노입자 (10)의 직경은 약 1 nm ~ 약 1000 nm의 범위 또는 그 이상일 수 있으나, 많은 용도에서 바람직하게는 약 10 nm ~ 약 300 nm (예를 들면, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 또는 300nm)이다. 복수의 나노입자 (10)의 분산에서, 크기 분포는 바람직하게는 복수의 나노입자 (10)의 평균 직경(또는 최대 직선 치수)의 약 25% (예를 들면, 1,2, 3,5, 10,15, 20, and 25%) 이하의 표준 편차를 갖는다.
도 1에 도시된 나노입자 (10)는 솔리드(즉, 실질적으로 기공이 없음)이다. 이 형태가 많은 용도에서 바람직하나, 본 발명의 나노입자는 또한 다공성일 수 있다. 솔리드 형태는 이하에서 설명되는 것과 같이 코어 (12)를 외피 (14)로 균일하게 코팅함으로써 제조될 수 있다. 다공성 형태는 솔리드 나노입자를 부식제(corrosive agent) [예를 들면, 실리카로 구성된 외피 (14)에 매우 염기성 용액]로 붕괴시키고, 그리고 선택적으로 실리카로 코어 (12)를 재-코팅함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 코어 (12)를 외부 환경으로부터 격리하는 것이 요구되는 경우에 솔리드 형태가 바람직하다. ; 반면 다공성 형태는 외부 환경과 접촉하는 외피 (14)의 표면적을 증가시키는 것이 요구되는 경우 (예를 들면, 나노입자 (10)가 촉매로서 사용되는 경우) 또는 때때로 다양한 물질을 단리 하는데 (예를 들면, 기공 내에 물질을 "포집[trapping]"하기 위하여) 나노입자 (10)가 사용되는 경우에 바람직하다. 나노입자 (10)의 기공은 나노입자 (10)의 직경 보다 작은 어떠한 적절한 크기도 가능하다. 예를 들면, 그러한 기공은 평균 약 0.2, 0.5,1, 2,3, 5,10, 20,50, 또는 100 nm의 크기일 수 있다.
코어 (12)는 외피 (14)와 친화성인 어떠한 물질로도 구성될 수 있다. 코어 (12)가 나노입자 (10)에 작용 특성을 부여하므로, 이 분야의 당업자는 조성물의 공지된 특성에 기초하여 나노입자 (10)의 의도된 특정 용도에 적합한 코어 (12)의 조성을 선택할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 실시예에서 나노입자 (10)가 자성을 띠는 경우, 코어 (12)는 자철광 (Fe304), 마게마이트 (γFe203), 또는 그레이지트 (Fe3S4)와 같은 자성을 띤 금속을 제조된다. 이 예에서, 코어 (12)의 조성은 나노입자 (10)에 자성 성질을 부여하므로 나노입자 (10)는 예를 들면, 세포 분리/정제와 같은 자성에 기초한 용도에 사용될 수 있다.
다른 용도를 위하여, 코어 (12)는 비-자성 금속 또는 금속 염 (예를 들면, 금, 은, 카드뮴 설파이드 등)으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 실리카로 코팅된 CdS 코어를 갖는 나노입자는 고도의 형광 또는 발광 프로브(probes)로서 사용될 수 있다. 다른 예로서, 염료 또는 안료 나노입자의 제조를 위하여, 코어 (12)는 예를 들면, 유로피움 염, 트리스(2,2'-비피리딜)디클로로루테니움 (Ru/Bpy), 과망간산칼륨, 중크롬산가리, 니켈 황산염, 염화 코발트, 염화 철 (III), 질산 동, 등과 같은 "안료 없는(pigmentless)"안료의 제조에 유용한 무기 염을 포함할 수 있다.
코어 (12)는 형광 또는 발광유기 염료로 구성될 수 있다. 많은 그러한 유기 염료가 공지되어 있다. 예를 들면, Handbook of fluorescent probes and Research product, 8th Edition, Molecular probes Inc를 참조한다. 유용한 염료의 특정 예에는 로다민 6G (R6G),카복시-테트라메틸-로다민 (TMR), 그리고 플루오레세인이 포함된다. 광안정(photostability) 실험에서, 순수한 R6G의 강도는 급격히 감소하는 것으로 나타났으며, 나노입자 내의 동일한 R6G의 형광 강도는 동일한 조건 하에서 현저히 변화하지 않았다. 그러한 염료-도프된(doped) 나노입자의 개선된 광안정성은 광표백(광표백)을 감소시키고 그러한 형광발색단을 이용하는 분석의 정확성을 개선한다. 코어 (12)는 또한 여러 물질의 혼합물로 구성될 수 있다. 예를 들면, 자성을 띤, 염료- 도프된 나노입자의 제조가 요구되는 경우, 코어 (12)는 자성을 띤 금속 및 염료 모두로 구성될 수 있다.
코어 (12)는 나노입자 (10) 크기보다 작은 어떠한 크기도 가능하다. 그러므로 코어 (12)는 1 내지 1000 nm 미만의 직경을 가질 수 있다. 많은 용도에서, 코어 (12)는 바람직하게는 약 1 ~ 약 200nm 범위의 직경을 갖는다. 일예로서, 동물은 약 100nm 미만의 크기의 나노입자는 배설할 수 있으나, 100 nm 이상의 입자는 보유하므로(일차적으로 간 및 비장), 100 nm 미만의 크기인 나노입자에 편입될 수 있는 정도로 작은 코어가 나노입자가 대상 내에 보유되지 않을 것이 요구되는 진단 또는 치료적 용도에 바람직하다.
마이크로에멀젼 나노입자-제조 기술(이하 참조)를 사용하여 제조되는 경우, 코어 (12)는 일반적으로 편구 모양(전통적인 역 마이셀은 편구이다)를 갖는다. 그러나 코어 (12)는 편구 모양에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 완전히 둥근 것 보다는, 나노입자 (10)는 많은 자성 용도에서 바람직한 타원형 또는 관-유사 모양일 수 있다. 코어 (12)가 결정질 형태인 경우, 나노입자 (10)는 입방형과 같은 규칙적인 또는 불규칙적인 다면체 모양일 수 있다.
외피 (14)는 코어 (12)를 코팅하는 물질이다. 이것은 본 발명의 방법을 사용하여 코어 (12)에 코팅 가능한 어떠한 친화성의 물질로도 구성될 수 있다. 외피는 (14) 예를 들면 중합체 (예를 들면, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 아크릴성 중합체 등), 덱스트린과 같은 다당체, 알루미나 또는 실리카와 같은 무기 산화물, 또는 그들의 혼합물로 구성될 수 있다. 제공된 바람직한 실시예에서, 외피 (14)는 부분적으로 또는 전체적으로 실리카로 구성된다. 많은 환경에서 비교적 불활성이므로 다양한 용도에서 바람직한 실리카는 생체적합성이며, 분산에서 다른 나노입자와의 응집을 방지하며, 다양한 작용기로 쉽게 유도(derivatized)될 수 있다. 도 1은 단일 층으로 배열된 외피 (14)를 도시하나, 이것은 또한 다중-층일 수 있다. 예를 들면, 외피 (14)는 실리카 코팅의 그리고 코어에 직접 인접한 제 1층, 그리고 실리카 층을 코팅하는 제 2 층 코팅을 포함할 수 있다. 제 2 층은 제 1 층에 코팅될 수 있는 어떠한 물질로도 구성될 수 있다. 예를 들면, 제 2 층은 약물과 함께 편입되는 생분해성(biodegradable) 물질 (예를 들면, 당 또는 중합체)로 구성될 수 있다. 동물에 도입되는 경우, 생분해성 물질 및 약물은 점차 동물로 용해될 것이다. 다른 용도에서, 외피 (14)는 3,4, 5 또는 그 이상의 분리 층으로 구성될 수 있다.
도 1의 바람직한 실시예에서 외피 (14)는 완전히 코어 (12)를 둘러싸며 코어 (12)를 외부 환경으로부터 격리한다. 이 형태는 코어 (12)와 외부 인자의 상호작용을 방지하는 것이 요구되는 경우에 바람직하다. 예를 들면, 실리카 코팅은 철-기초 코어의 부식을 방지할 수 있다. 유사하게, 완전한 실리카 코팅은 용제 내의 안료의 용해 또는 분해의 방지 또는 산화에 의하여 나노입자-기초한 안료의 저장 기간을 증진시킬 수 있다. 일부 변형에서, 나노입자 (10)는 외피 (14)를 포함하지 않거나 또는 오직 부분적으로 외피 (14)로 코팅된다(예를 들면, 외피 (14)가 코어 (12)로부터 부분적으로 용해되거나 분해되는 경우).
외피 (14)는 나노입자 (10)를 만드는 방법과 조화되는 어떠한 두께[즉, 코어 (12)의 외부 표면으로부터 외피 (14)의 외부 표면까지의 길이]일 수 있다. 본 발명의 바람직한 방법을 사용하여, 외피 (14)는 약 1 nm미만 내지 약 300nm이상의 범위의 두께를 갖도록 제조될 수 있다. 나노입자 (10)가 사용되는 특정의 용도에 따라, 바람직한 외피 (14)의 두께도 달라질 것이다. 예를 들면, 비교적 두꺼운 외피가 나노입자의 응집(코어가 서로를 당기는 경우) 또는 외피의 분해(예를 들면, 부식성 용제에서)를 감소시키는 것이 요구되는 경우 일반적으로 바람직하다. 한편, 코어의 속성을 증대시키는 것이 요구되는 경우 (예를 들면, 안료의 색), 비교적 얇은 외피가 일반적으로 바람직하다.
도 1에 도시된 바와 같이, 작용기 (16)는 외피 (14)의 표면에 유도될 수 있다. 작용기 (16)는 나노입자 (10)에 외피 (14)를 통하여 부착할 수 있는 어떠한 화학적 또는 생물학적 그룹의 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 작용기 (16)는 생물학적 활성 물질, 예를 들면, 항체(모노클로날, 폴리클로날), 효소, 바이오틴, 그리고 스트렙타비딘과 같은 단백질; 핵산 분자 (예를 들면, RNA, DNA); 그리고 아민 및 카복실레이트와 같은 생화학 그룹일 수 있다.
나노입자 제조방법
도 2을 참조하여, 나노입자를 만드는 바람직한 방법은 단계를 포함한다.: 마이크로에멀젼을 제공하는 단계(5); 반응물의 수성용액을 제공하는 단계(52) ; 마이크로에멀젼의 개별적인 분취량(aliquots)에 수성 용액을 첨가하는 단계(54) ; 나노입자 코어를 생성하는 반응 혼합물을 형성하기 위하여 분취량을 혼합하는 단계(56); 그리고 코팅된 나노입자를 형성하기 위하여 코어에 코팅제를 첨가하는 단계(58).
단계 (50)의 마이크로에멀젼은 하나 또는 두 액체 모두의 다른 액체 내의 나노크기 방울(droplet)의 열역학적으로 안정한, 광학적으로 등방성의 분산을 형성하기 위하여 적어도 하나의 계면활성제의 존재 하에서 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이 분산은 두 액체의 계면의 표면장력을 감소시키는 계면활성제에 의하여 안정화된다.
마이크로에멀젼은 유중수 (즉, 오일에 분산된 역 마이셀 또는 물 방울), 수중유 (즉, 물에 분산된 마이셀 또는 오일 방울), 또는 두 혼합할 수 없는 유체의 거의 유사한 용량을 함유하는 두-연속적(bi-continuos) 시스템일 수 있다. 일부 경우, 마이크로에멀젼은 무시할 만 한 상호 용해도를 갖는 다른 극성의 두 비-수성 액체를 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 용도를 위하여, 유중수 마이크로에멀젼이 수성 용액 내에 고체를 침전시키는 많은 공지된 화학적 반응과 친화적이므로 목하 바람직하다.
단계 (50)에서 사용될 수 있는 혼합할 수 없는 액체는 대체로 비교적 극성 (즉, 소수성) 액체 및 비교적 비-극성 (즉, 친수성) 액체를 포함한다. 다양한 극성/비극성 액체 혼합물이 본 발명에 유용한 마이크로에멀젼의 형성에 사용될 수 있으나, 사용될 특정 액체의 선택은 제조될 나노 입자의 타입에 따를 것이다. 당업자는 본원 발명의 용도를 위하여 공지된 마이크로에멀젼의 제조 방법을 적용함으로써 특정 용도를 위한 특이적 액체를 선택할 수 있을 것이다. 비록 다른 극성 액체 또한 유용하지만, 현재로서 바람직한 비교적 극성 액체는 물이다. 물은 비싸지 않고, 쉽게 이용할 수 있으며, 비-독성이며, 취급과 저장이 용이하고, 많은 다른 침전 반응과 친화성이며, 많은 비극성 용제와 혼합할 수 없으므로 바람직하다. 적절한 비-극성 액체의 예에는 알칸 (예를 들면, 어떠한 액체 형태의 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 운데칸, 도데칸, 등.), 사이클로알칸 (예를 들면, 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 등.), 방향족 탄화수소 (예를 들면, 벤젠, 톨루엔, 등.), 그리고 이들의 혼합물(예를 들면, 석유 및 석유 유도체)이 포함된다. 일반적으로, 마이크로에멀젼의 형성에 사용된 다른 성분과 친화성이며 침전 반응에 간섭하지 않는 한 어떠한 그러한 비- 극성 액체도 사용될 수 있다.
단계 (50)은 마이크로에멀젼을 형성하기 위하여 적어도 하나의 계면활성제를 요구한다. 계면활성제는 마이크로에멀젼에서 매우 작은 분산된 마이셀 또는 역 마이셀을 열역학적으로 안정화시키는 표면 활성제이다. 대체로, 계면활성제는 오일성 및 수성 상 사이에서 매우 낮은 계면 장력으로 필름을 형성하도록 허용하는 양친매성(amphipathic) 구조를 보유한다. 그러므로 비교적 극성 및 비교적 비-극성 액체의 계면에서 표면 장력을 감소시키고 본 발명의 다른 측면과 친화성인 어떠한 물질도 나노입자의 제조에 사용된 마이크로에멀젼을 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 계면활성제의 선택은 사용되는 특정 액체 및 제조되는 나노입자의 타입에 의존할 것이다. 특정 용도에 적절한 특이적 계면활성제는 공지의 마이크로에멀젼 제조방법 또는 공지된 계면활성제의 특성으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 마이크로에멀젼 공정에 사용되고 그리고 이온성 세제(detergent)가 이온성 반응물에 결합하거나 또는 간섭하는 경우, 비-이온성 계면활성제가 일반적으로 바람직하다.
수많은 적절한 계면활성제가 공지되어 있다. 그 수많은 리스트에는 포타슘 올레이트, 소듐 올레이트, 등과 같은 비누; 에어로졸?T, 소듐 콜레이트, 소듐 카프릴레이트, 등과 같은 이온성 세제; 세틸피리디늄 클로라이드, 알킬트리메틸암모늄 브로마이드, 벤잘코늄클로라이드, 세틸디메틸에틸암모늄 브로마이드, 등과 같은 양이온성 세제; N-알킬-N,N-디메틸암모니오-l-프로판술포네이트 및 CHAPS와 같은 양쪽성 이온성 세제; 그리고 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌솔비탄 에스테르, 솔비탄 에스테르, 그리고 다양한 트리톤 (예를 들면, (TX-100, TX-114, 등.)과 같은 비-이온성 세제가 포함된다.
단계 (50)에 사용되는 계면활성제의 농도는 선택된 특정한 계면활성제, 사용된 액체, 그리고 제조되는 나노입자의 타입을 포함하는 많은 인자에 의존할 것이다. 적절한 농도는 경험적으로, 즉 특정한 용도에 최상으로 수행하는 농도가 발견될 때까지 다른 농도의 계면활성제를 시도함으로서 결정될 수 있다. 적절한 농도 범위는 또한 알려진 임계(critical) 마이셀 농도로부터 결정될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 비스 2-에틸헥실)술포숙시네이트 소듐 염(에어로졸? OT, AOT)가 물과 이소옥탄의 마이크로에멀젼을 생성하기 위하여 사용된다.; 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)가 n-헥산, n-헥산올, 그리고 물의 마이크로에멀젼을 생성하기 위하여 사용된다. 그리고 트리톤 X-100 (TX-100)가 사이클로헥산, n-헥산올, 그리고 물의 마이크로에멀젼을 만들기 위하여 사용된다. 비록, 본 발명의 대부분의 용도에서, 단계 (50)는 마이크로에멀젼을 안정화하기 위하여 오직 하나의 계면활성제만을 사용하지만, 하나 이상의 보조계면활성제(cosurfactant) 또한 사용될 수 있다. 보조계면활성제의 사용은 역 마이셀 시스템의 안정화에 종종 유용하다. 예를 들면, 오일 및 물의 혼합물에 비누와 같은 수성 계면활성제를 첨가하는 것은 우유 같은 유화를 산출한다. 중간 사슬 길이의 알코올과 같은 보조계면활성제의 첨가는 명백히 자발적으로 오일 내에 분산된 물 방울의 매우 작은 구의 형성에 기인하여 우유 같은 유화를 일으킨다. 상 사이의 계면 장력을 추가로 감소시킴으로써 그러한 보조계면활성제는 분산된 상의 매우 작은 입자의 형성을 촉진하는 작용을 한다. 본 발명에 사용하기 위하여 적절한 보조계면활성제에는 헥산올, 부탄올, 펜탄올, 옥탄올 및 유사한 중간 사슬 길이 알코올이 포함된다. 단계 (50)의 마이크로에멀젼은 단순히 비교적 극성 액체, 비교적 비-극성 액체, 그리고 하나 이상의 계면활성제를 함께 혼합함으로써 제조된다. 유중수 마이크로에멀젼 (수성 역 마이셀을 갖는)을 제조하기 위하여, 비교적 비-극성 액체의 부피는 비교적 극성 액체 의 그것을 훨씬 초과한다.(예를 들면, 비-극성 액체: 극성 액체 부피 비가 약 10000:1 ~ 100:1) 계면활성제의 첨가로 종종 더 이상의 교반 없이 마이크로에멀젼의 형성을 일으킬 수 있지만, 일반적으로 혼합물은 기계적으로 (예를 들면, 자력으로) 교반되거나 또는 울트라소니케이트되어 마이크로에멀젼을 형성한다. 본 발명에 유용한 많은 마이크로에멀젼은 실온(즉, 약20 ℃)에서 가열 없이 제조될 수 있다. 다른 경우, 액체 내의 계면활성제의 용해도를 증가시킴으로써 마이크로에멀젼 형성을 서두르기 위하여, 성분들의 혼합물은 종종 (예를 들면, 열판을 사용하여) 약 5-80 ℃로 가열된다.
다시 도 2를 참조하여, 반응물의 수성 용액을 제공하는 단계 (52) 및 단계 (52)의 수성 용액을 마이크로에멀젼의 분리된 분취량에 첨가하는 단계 (54)는 전술한 바와 같이 제조된 유중수 마이크로에멀젼을 사용하여 수행될 수 있다. 단계 (52) 및 (54)는 제 1 수용성 반응물 (반응물 A) 및 제 2 수용성 반응물 (반응물 B)를 제공하고, 그 후 반응물 A를 유중수 마이크로에멀젼의 제 1 분취량에 가하고 반응물 B는 유중수 마이크로에멀젼의 제 2 분취량에 가함으로써 수행될 수 있다. 두 분취량은 반응물 A가 제 1 분취량의 각 역 마이셀(역 마이셀은 마이크로에멀젼에서 계속적으로 형성하고, 합체하고 분해되어, 함유된 어떠한 반응물이 역 마이셀 중에 동일하게 분포되도록 한다.)에서 평형 분포에 도달하고, 반응물 B가 제 1 분취량의 각 역 마이셀에서 평형 분포에 도달할 때까지 개별적으로 혼합된다. 단계 (56)에서, 용해된 종의 분포가 평형을 이루도록 한 후, 두 분취량은 함께 혼합된다. 역 마이셀의 충돌 및 분해에 의하여, 반응물 A의 양이온과 반응물 B의 음이온은 서로 접촉하고 반응하여 나노입자 코어로 작용하는 침전을 형성한다.
반응물 A 및 B는 일반적으로 마이크로에멀젼의 역 마이셀 내에서 침전을 형성하도록 반응할 수 있도록 선택된다. 그들은 대체로 수성 역 마이셀에 용해되며 고체, 액체, 또는 가스이다. 바람직한 실시예, 반응물 A는 마이크로에멀젼의 제 1 분취량의 역 마이셀 내에서 가용성 양이온 (예를 들면,A+)에 용해되는 염(예를 들면, 가정적 화학식 A+X - )이며, 반응물 B는 마이크로에멀젼의 제 2 분취량의 역 마이셀 내에서 가용성 음이온(예를 들면, Y-)에 용해되는 다른 염(예를 들면, 가정적 화학식 B+Y-)이다. 반응물 A의 양이온 및 반응물 B의 음이온은 수성 용액에서 함께 혼합되는 경우 침전(A+Y-)을 형성하도록 선택된다. 전술한 것의 본 발명의 바람직한 방법이나. 마이크로에멀젼을 사용하여 나노입자 코어를 제조하는 다른 방법 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 많은 방법이 전술한 바람직한 방법의 약간의 변형에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 마이크로에멀젼의 두 다른 분취량을 함께 섞기 보다는, 코어-형성 반응은 마이크로에멀젼의 단일 분취량을 사용하여 수행될 수 있다. 이 경우, 반응물은 단일 분취량에 첨가될 수 있으며 마이크로에멀젼의 역 마이셀 중에서 용해되어 평형을 이루도록 할 수 있다. 순차적으로, 침전제(예를 들면,환원 또는 산화제는 액체 또는 가스(예를 들면, 수소, 하이드라진, NH40H)의 형태로 역 마이셀 내에 용해된 반응물을 침전시키기 위하여 단일 분취량에 첨가된다.
나노입자 코어는 아세톤 또는 에탄올과 같은 용제를 마이크로에멀젼에 첨가하고 그 후 나노입자의 단리를 위하여 혼합물을 여과하거나 그리고/또는 원심분리함으로써 마이크로에멀젼으로부터 단리될 수 있다. 여과를 위하여, 필터는 나노입자보다 작은 크기의 기공을 갖는다. 원심분리를 위하여, 혼합물은 나노입자를 뭉치기 위하여 마이크로 원심분리기에서 10,000 RPM 또는 그 이상으로 15분 또는 그 이상동안 회전될 수 있다. 그리고 상층액은 따라낸다. 이 방식으로 단리된 나노입자는 어떠한 계면활성제 또는 다른 마이크로에멀젼 성분을 제거하기 위하여 아세톤 또는 에탄올/물 용액으로 한번 이상 세척될 수 있다. 단리 및 세척된 나노입자는 아세톤으로 건조될 수 있다. 사용 또는 기능화(functionalization)전에, 나노입자는 적절한 액체에 재-현탁될 수 있다.
유중수 마이크로에멀젼 기술을 사용하여, 나노입자 코어 크기 고도로 제어가능하다. 비록 코어 크기는 일반적으로 역 마이셀 크기에 연관되나, 코어 크기가 항상 각각의 역 마이셀에 원래 존재하는 반응물의 용량과 상호관련되는 것은 아니므로 이것은 반드시 엄격한 상호관계가 있는 것은 아니다. 예를 들면, 심지어 작은 나노입자 코어 (예를 들면, 직경 2 nm ~ 5 nm를 갖는)는 약 300 ~ 1000원자를 함유하며, 이 원자는 대부분의 경우 반응 전에 각각의 마이셀에 본재하는 반응물 분자의 숫자보다 상당히 크다. 이것은 나노입자 코어 핵이 우선 마이셀의 작은 분획에서 형성되고; 이것이 그 후 충돌-합체 공정을 통하여 다른 마이셀의 반응물을 소모한다는 것을 지시한다.
그러므로 나노입자 코어 제조에서 고려되는 인자는 나노입자 코어가 형성되는 속도이다. 나노입자 코어가 형성되는 속도는 역 마이셀 합체 속도에 직접 관련된다. 그러므로 선택된 특이적 계면활성제는 역 마이셀 합체의 속도를 제어하는 코어 형성 속도에 강력하게 영향을 준다. 즉, 마이크로에멀젼의 두 혼합할 수 없는 액체 사이에 비교적 단단한 계면을 초래하는 계면활성제는 코어 형성 속도를 감소시키는 반면, 유체 계면을 초래하는 계면활성제는 그 속도를 증가시킨다. 이온 강도, pH, 그리고 온도와 같은 마이크로에멀젼의 다른 속성 또한 코어 형성 속도의 제어를 위하여 조작될 수 있다.
초기 반응물 농도 및 마이크로에멀젼 조성 매개변수의 경험적 조정을 통하여, 균일한 크기 분포 (예를 들면, 코어 크기의 퍼센트 표준 편차가 약 1 ~ 5% (예를 들면, 1,2, 3,4, 그리고 5%)) 및 약 1 nm ~ 약 300 nm 또는 그 이상의 평균 직경을 갖는 나노입자 코어가 제조될 수 있다. 보다 큰 크기의 코어(예를 들면, 약 1 마이크론)가 : (i) 보다 고농도의 시약을 반응 매질 (예를 들면, 마이크로에멀젼의 역 마이셀)에 첨가하고, 그리고/또는 (ii) 균일한 코어 현탁액을 제조하기 위하여 음향화학적으로(즉, 울트라소니케이션에 의하여) 마이크로에멀젼이 아닌 적절한 용제에 단리된 코어를 분산시키고, 그 후 분산에 부가적 시약을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 후자의 방법에서, 개별적 코어가 종종 융화된다.
대부분의 경우, 전술한 유중수 마이크로에멀젼 기술에 따라 제조된 나노입자 코어는 편구 모양을 갖는다. (전통적인 역 마이셀은 편구이다). 코어 형성 공정의 다양한 매개변수를 변경함으로써, 다른 모양을 갖는 코어를 제조하는 것이 가능하다. 예를 들면, 타원형 또는 튜브-모양 코어가 매우 고 농도의 소듐 도데실 설페이트를 마이크로에멀젼에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시예로서, 형성된 코어가 결정질 구조의 나노입자 코어를 형성하도록 반응물이 선택되는 경우, 규칙적인 또는 불규칙적인 다면체의 모양을 갖는 나노입자 코어가 제조될 수 있다.
자성을 띤 나노입자는 코어의 부분으로서 자철광, 마게마이트, 그리고 그레이지트와 같은 자성을 띤 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 자성을 띤 코어의 전체 크기 및 모양을 변화시킴으로써, 이들은 초상자성(superparamagnetic)을 띤 또는 안정한 단일-도메인 (자기장으로부터 제거된 후 안정한 자성을 보유하는 입자)를 제조할 수 있다. 코어 크기는 자성을 띤 나노입자 가 초상자성을 띄는지 또는 단일-도메인인지에 관련된다. 그러므로 비교적 동등차원(equidimensional) 초상자성을 띤 입자는 일반적으로 50 ~ 80nm미만의 크기의 코어를 갖는다. 상한 이상의 입자 크기에서, 입자의 자화(magnetization)는 내부 자성 에너지를 최소화하기 위하여 다른 자화 벡터의 도메인으로 분열된다. 다시 도 2를 참조하여, 본 발명의 나노입자의 제조방법은 코팅된 나노입자를 형성하기 위하여 코팅제를 첨가하는 단계 (58)의 특징이 있다. 단계 (58)에서 사용된 코팅제는 나노입자 코어의 표면에 실리카(또는 다른 물질)를 침착시키는 어떠한 물질일 수 있다. 현재로서 바람직한 시약에는 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS) 또는 아미노프로필트리메톡시실란(APTS) (모두 Sigma, St. Louis에서 입수 가능)와 같은 반응성 실리케이트가 포함된다. 코어를 코팅하기 위하여, 그러한 반응성 실리케이트는 단순히 암모늄 하이드록사이드 또는 NaOH와 같은 환원제와 함께 나노입자 코어의 용액(예를 들면, 코어가 제조되어 있는 마이크로에멀젼) 에 첨가된다. 이 혼합물은 코어가 실리카로 코팅되도록 적절한 시간 동안 교반될 수 있다.
실리카 코팅의 두께, 그리고 실리카 코팅의 형성을 위한 반응 속도는 첨가된 반응성 실리케이트의 용량, 반응 시간, 첨가된 환원제의 용량, 그리고 역 마이셀 크기 (유중수 마이크로에멀젼에서 코팅이 수행되는 경우)에 의존한다. 반응성 실리케이트 농도 (예를 들면, [TEOS])에 대한 환원제 (예를 들면, [NH40H] )의 농도의 증가는 일반적으로 주어진 반응 시간 후 형성되는 보다 두꺼운 코팅을 초래한다. 극성 액체 (예를 들면, 물) 농도의 반응성 실리케이트 농도에 대한 증가는 일반적으로 주어진 반응 시간 후 형성되는 보다 얇은 코팅을 초래한다. 코팅의 두께를 조절하기 위한 정확한 반응 조건은 사용된 특정 제제, 코어 물질, 등에 따라 변화될 것이다. 그러나 이들은 단순히 시약의 농도 및 반응시간 그리고 조건을 변화시키는 실험으로 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 전술한 바와 같이 제조된 코팅된 나노입자를 기능화 하는(즉, 하나 이상의 화학적 작용기로 유도하여) 단계를 포함할 수 있다. 작용기를 실리카에 부착시키는 많은 공지된 방법이 본원 발명의 용도에 적용될 수 있다. (참조: 예를 들면, Iler, R., The Chemistry of Slilica: Solubility, Polynmerization, Colloid and Surface Properties, and Biochemistry, Wiley-Interscience, NY, 1979; VanDerVoort, P. and Vansant, E. , Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 19:2723-2752, 1996; Weetall,H. ed. , Immobilized Enzymes, Antigens, Antibody, and Peptides: Preparation and Characterization, M. Dekker, NY, 1975.) 작용기를 실리카-코팅된 나노입자에 부가하는 고유의 공정은 나노입자를 나노입자의 실리카 표면과 반응하여 화학적 그룹을 연결(coupling)시키는 실란화제(silanizing agent)로 처리하는 것에 관련된다. 이 화학적 그룹 자체는 작용기일 수 있으며, 또는 작용기가 연결 될 수 있는 기질로서 작용할 수도 있다.
예를 들면, 예시적 방법에서, 실리카-코팅된 나노입자는 전술한 바와 같이 제조되고 입자 표면은 트리메틸시릴프로필-디에틸렌트리아민 (DETA), 실리카 표면의 일차 아민 그룹에 부착하는 실란화제를 사용하여 실란화된다. 항체 또는 다른 단백질이 그 후 사이아노 브로마이드(CNBR) 방법을 사용하여 실란화된 표면에 공유 결합될 수 있다. 일 실시예로서, CNBR-조절 연결(mediated coupling)은 2M 소듐 카보네이트 완충제에서 미리 DETA로 실란화된 실리카-코팅된 나노입자를 현탁하고 입자 현탁액을 생성하기 위하여 혼합물을 울트라소니케이션함으로써 얻을 수 있다. CNBR의 용액 (예를 들면, 2 g CNBR/1 ml 아세토니트릴)이 그 후 입자 현탁액에 첨가되어 나노입자를 활성화 한다. 나노입자를 중성 완충제(예를 들면, PBS, pH8)로 세척 후, 항체 용액이 활성화된 나노입자 현탁액에 첨가되어 항체가 나노입자에 결합되도록 유도된다. 글리세린 용액 또한 항체-코팅된 나노입자에 첨가되어 남아있는 미반응 부위를 차단한다.
다른 방법에서, 바이오틴-스트렙타비딘 결합이 나노입자를 기능화 하기 위하여 사용된다. 예를 들면, 나노입자의 실리카 외피는 우선 실리카 표면상에 아비딘을 안정화하기 위하여 글루터알데하이드-가교를 사용하여 스트렙타비딘으로 코팅된다. 작용기 (예를 들면, 항체 또는 핵산 분자)는 그 후 전통적인 방법으로 바이오티닐레이트화(biotinylated) 된다. 바이오티닐레이트화 된 작용기는 그 후 작용기-코팅된 나노입자를 형성하기 위하여 아비딘-코팅된 나노입자와 혼합된다.
나노입자의 사용 방법
본 발명의 나노입자는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체-코팅된 형광 나노입자는 특이적으로 세포를 표지(label)하기 위하여 사용될 수 있다. 핵산- 코팅된 형광 나노입자는 특이적 폴리뉴클레오타이드를 탐지하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 핵산-코팅된 자성을 띤 나노입자는 DNA 그리고 RNA를 포함하는 특이적 폴리뉴클레오타이드를 혼합물로부터 분리하고 수집하기 위하여 사용될 수 있다.
세포 표지
본 발명의 나노입자는 세포(예를 들면, 진핵 또는 원핵세포)를 표지하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 방법의 하나는 도 3에 도시된다. 도 3A에서, 항체-유도된 염료-도프된 나노입자 (10)가 표적 세포 (20) (예를 들면, 암 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 박테리아 세포, 등) 그리고 비-표적 세포(21)가 용기(30) 내에 혼합되어 있다. 표적 세포 (20)는 그들의 표면에 표적 항원 (22)을 발현하는 반면, 비-표적 세포(21)는 그렇지 않다. 도시된 나노입자에서, 코어 (12)는 R6G, 플루오레세인, Ru/Bpy 또는 TMR와 같은 형광/발광물질 및 결합 표적 항원 (22)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 작용기 (16)를 포함한다. 도 3B에서, 표적 세포(20)에 작용기 (16) 및 표적 항원 (22)의 상호작용을 통하여 물리적으로 결합하는 나노입자(10)가 도시된다. 나노입자 (10)와 표적 세포 (20)가 항체-항원 결합을 허용하는 조건(예를 들면, 약 실내 온도, 낮은 염 완충제에서 중성에서 약 염기성 pH) 하에서 용기(30) 내에 함께 혼합되는 경우 그러한 결합은 자발적으로 일어난다. 비-표적 세포 (21)는 표적 항원 (22)을 발현하지 않으므로 나노입자 (10)에 특이적으로 결합하지 않는다.
핵산 탐지
본 발명은 또한 샘플 내에 특이적 표적 핵산 분자의 존재를 탐지하는 방법을 제공한다. 그러한 방법의 하나는 주어진 반응 조건 (예를 들면, 엄격한 하이브리드형성 조건) 하에서 특이적 표적 핵산 분자의 특정한 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드되는 작용기(예를 들면, 표적 핵산의 전부 또는 일부와 상보적인 올리고뉴클레오타이드)와 접합된 발광 또는 형광 나노입자를 이용한다. 이 방법에서, 발광/형광 나노입자가 특정한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산 분자를 함유하는 샘플에 첨가되고, 예를 들면, 발광 또는 형광 분석에 의하여 나노입자와 특정한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산 분자 사이의 결합이 탐지된다.
도 4에서, 샘플 내의 핵산 분자의 존재를 탐지하는 다른 방법은 기질에 고정된 핵산 분자를 이용한다. 이 방법에서, 캡쳐 핵산 분자는 실리카-코팅된 수정(quartz) 표면과 같은 적절한 기질에 고정된다. 샘플이 그 후 기질에 첨가되어 만일 이것이 캡쳐 핵산에 하이브리드되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산 분자를 함유하면, 표적 핵산이 캡쳐 핵산에 결합될 것이다. 이 상호작용을 탐지하기 위하여, 기질이 발광 또는 형광 나노입자에 접합된 프로브 핵산 분자와 접촉된다. 이 프로브 핵산 분자는 표적 핵산에 하이브리드 되나 캡쳐 핵산에는 하이브리드 되지 않는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 만일 표적 핵산이 샘플 내에 존재하면, 형광/발광의 증가가 기질 상에서 (예를 들면, 스펙트로스코피에 의하여)탐지될 것이다.
MBs를 사용하는 핵산 탐지
핵산의 혼합물로부터 핵산의 존재를 탐지하고 그리고/또는 핵산을 분리하는 다른 방법은 유리 플레이트 또는 나노입자와 같은 기질에 고정된 MB를 이용한다. MB는 그들의 표적 DNA 서열의 부재 시에, 이들 분자가 스템-그리고-루프 구조를 보유하도록 설계된 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 프로브이다.(Tyagi S and Kramer FR, Nature Biotechnology, 14,303-308, 1996). 이 분자의 루프 부분은 특이적 상보적인표적 핵산과 하이브리드 되도록 설계된다. 스템을 형성하는 비콘(beacon)의 두 말단의 염기는 서로 상보적이다. 스템의 한 말단은 형광발색단에 접합되며 다른 말단은 켄처에 접합된다. 표적 DNA의 부재 시, 이 분자의 헤어핀 모양은 형광발색단과 켄처를 아주 근접하게 가져온다. 이 배열에서, 형광발색단에 의하여 캡쳐된 빛 에너지가 켄처로 전달된다. 켄처는 바람직하게는 가열에 따라 형광발색단으로부터 받은 에너지를 방산하고 그 결과 헤어핀 배열의 프로브의 형광 강도가 프로브가 개방 또는 선형 배열에 있는 경우보다 훨씬 낮은 비-형광 발색단(chromophore)이다.
스템의 두 말단에 형광발색단과 켄처로 표지된 MB가 도 5에 도시된다. 프로브가 적절한 표적 DNA 분자를 만나면, 루프 부분은 스템보다 길고 안정한 하이브리드를 형성한다. 표적 DNA 서열과 형성된 하이브리드의 길이 및 단단함에 의하여, 스템 하이브리드의 계속적인 존재는 불가능하다. 그러므로 그것의 표적 DNA 서열과의 하이브리드 형성에 따라, MB는 스템이 분리되고, 형광발색단과 켄처가 분리 이동하도록 강제하는 자발적인 배열 재구성을 겪는다. 켄처로부터 형광 발색단의 분리는 그 후 켄칭을 역전시키며(reverses) 형광발색단에 의하여 방사되는 형광을 탐지하도록 한다. 그러므로 MB는 그들의 표적 분자에 하이브리드 된 경우 그렇지 않은 경우보다 강한 형광 시그널을 방사한다. MB는 DNA 하이브리드형성 연구에 성공적으로 사용되어 왔다.(Tyagi S and Kramer FR, Nature Biotechnology,14, 303-308,1996 ; Tyagi S, Bratu D, Kramer FR, Nature Biotechnology, 16,49-53, 1998;Kostrikis LG, Tyagi S,Mhlanga MM, Ho DD, Kramer FR, Science 279,1228-1229, 1998; Giesendorf BAJ, Vet JAM, Tyagi S, Mensink EJMG, Trijbels FJM, Blom HJ, Clinical Chemistry ; 44: 482-486,1998.). 루프의 크기 및 조성은 다른 MB를 설계함으로써 변경될 수 있다. 또한, 켄처 및 형광발색단은 특정한 용도에 따라 변경될 수 있다.
도 5에서, 본 발명은 특정한 뉴클레오타이드 서열를 갖는 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하기 위하여 고체 플레이트 또는 나노입자와 같은 기질에 고정된 MB를 제공한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 이 방법에 사용하기 위한 바람직한 MB는 프로브 올리고뉴클레오타이드 (스템-루프 배열로 도시된)를 포함한다. 이 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 분자에 하이브리드 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 이것은 또한 형광발색단(예를 들면, 플루오레세인 또는 로다민-기초한 염료) 그리고 형광발색단의 켄처(예를 들면, DABCYL) 모두에 접합된다. 형광발색단이 켄처의 근접하는 경우 형광 에너지 공명 전이 (FRET)가 발생하는 그리하여 형광발색단의 방사 스펙트럼 변화가 탐지 가능한 한, 예를 들면, TMR 및 DABCYL (이하 실시예 참조)와 같은 어떠한 적절한 형광발색단-켄처 조합이 사용될 것이다. DABCYL[4-(4'-디메틸아미노페닐아조 벤조익 애시드)], 비-형광 발색단은 MB의 어떤 형광발색단을 위한 광범위 켄처로서 작용하므로 많은 용도에 바람직하다 (Tyagi S, Bratu D, Kramer FR, Nature Biotechnology, 16,49-53, 1998).
도 5의 모델에서, 형광발색단은 프로브 올리고뉴클레오타이드 의 한 말단(예를 들면, 5'말단)에 접합되며 켄처는 올리고뉴클레오타이드의 반대 부위 말단(예를 들면, 3'말단)에 접합된다. 표적 핵산 분자의 부재 시에, 프로브 올리고뉴클레오타이드는 스템-루프 구조 (자체-하이브리드형성에 의하여)로 배열하고, 여기서 형광발색단은 켄처에 인접한다. - FRET가 형광발색단으로부터 감소된 형광 방사를 일으키는 배열. 그러한 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 설계 방법은 잘 알려져 있다. 표적 핵산 분자가 존재하는 경우, 이것은 프로브에 하이브리드되어 프로브가 선형 배열로 재배열하도록 하며, 여기서 형광 방사가 형광발색단과 켄처가 분리되는 경우 나타나는 FRET의 제거 또는 감소로 인하여 감소된다. 그러므로 표적 핵산의 존재는 형광의 증가를 관찰함에 의하여 결정된다.
MB의 고정
MB는 공지된 화학적 방법으로 나노입자 또는 슬라이드와 같은 기질에 고정될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 분자는 고체 표면에 바이오틴-아비딘 시스템을 사용하여 고정될 수 있다. (Anzai, J. , Hoshi, T. and Osa, T. Trends in Analytical Chemistry, 13,205-210, 1994; Narasaiah, D.,Nowall, W. B. and Kuhr, W. G. Anal. Chem. 69,2619-2625, 1997). 예를 들면, 본 발명의 일 실시예에서, 바이오틴 분자는 MB의 구조 내로 편입된다. 바이오티닐레이트화 된 MB는 그 후 바이오틴-아비딘 결합을 통하여 아비딘-코팅된 표면에 부착될 수 있다.
바이오틴 작용기를 MB에 부착하는 것은 MB의 단일-가닥 루프 영역 내에 그것의 상보적인 DNA를 갖는 표적 DNA 분자의 최적의 하이브리드 형성을 허용하는 부착 부위의 배치를 요구한다. 바이오틴의 결합을 위한 다른 위치들이 테스트되었다. : 루프 서열, 스템의 형광발색단 측면의 제 2 염기쌍 위치, 그리고 스템의 켄처 측면의 동일한 위치. 스템의 켄처 측면에 바이오틴이 결합된 배열은 바이오틴의 MB의 형광, 켄칭 및 하이브리드형성 능력에 대한 영향을 최소화시켰다. 18 염기 쌍 루프 서열을 갖는 MB를 사용하여, 스페이서(spacer)가 바이오틴 그리고 이 서열 사이에 삽입되었다. 바이오틴-dT가 루프 서열과 하이브리드되는 표적 DNA의 분자가 쉽게 접근하도록 하기 위하여, 그리고 아비딘 및 DNA 서열 사이의 잠재적 상호작용을 최소화하기 위한 적절한 분리를 제공하기 위하여 사용되었다.
제노마그네틱 나노캡쳐기(Genomagnetic Nanocapturers)
샘플, 예를 들면, 오직 단일 염기가 표적과 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것 또는 DNA 및 단백질의 혼합물을 함유하는 것으로부터 특정한 표적 핵산 분자를 단리하기 위하여 MB-접합된 나노입자를 사용하는 방법 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이 방법의 한 형태에서, 자성을 띤 나노입자는 (예를 들면, 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서) 표적 핵산에 하이브리드 되는 MB와 접합된다. 이들 접합된 자성을 띤 나노입자는 제노마그네틱 나노캡쳐기 (GMNC)로 명명되었다. 도 6에서, MB-GMNCs가 MB와 표적 핵산(즉,DNA1')과의 그리고 단일 염기가 다른 표적(즉 DNA2')과의 하이브리드 형성을 허용하는, 그리고 형광 이미징[imaging]에 의하여 하이브리된 서열의 탐지를 허용하는 조건 하에서(이하의 특이적 실시예 참조) 샘플에 첨가된다. 이 방법의 다른 실시예에서, MB-GMNCs가 세포 라이세이트(lysate)를 포함하는 복합체 혼합물로부터 미량의 RNA (예를 들면,mRNA)의 분리에 사용될 수 있다. DNA 또는 RNA 표적을 선택하기 위한 MB의 하이브리드 형성 후, 자석(magnet)이 그 후 샘플로부터 표적핵산에 결합된 MB-GMNCs를 분리하기 위하여 사용된다. 표적 핵산은 그 후 전통적인 하이브리드된 핵산 분리 기술을 사용하여, 예를 들면, MB-GMNCs 함유 용액의 온도 또는 염 농도를 증가시킴으로써 분리될 수 있다. 전술한 단계는 형광발색단 또는 켄처에 접합되지 않은 MB를 사용하여 수행될 수 있으나, 그러한 접합된 MB의 사용은 분리 공정이 형광 분석에 의하여 감시될 수 있도록 한다.
요약
본 발명은 핵산, 항체, 그리고 효소와 같은 하나 이상의 생물학적 분자에 접합되는(conjugated) 나노 입자의 개발에 기초한다. 본 발명의 나노입자는 극히 민감한 세포 표지(labeling) 및 핵산 분석 그리고 단리를 위한 단리 도구 및 시그널링 프로프(signaling probes)로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 나노입자를 표적 분자에 유도하는(directing) 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 작용기가 접합된 실리카 표면을 갖는 나노입자를 제공하는 단계; 그 후 적어도 하나의 작용기가 표적 분자에 결합하도록 하는 조건 하에서 나노입자와 표적 분자를 혼합하는 단계를 포함한다.
사용되는 나노입자는 실리카 표면으로 둘러싸인 코어를 가질 수 있다. 코어는 금속 (예를 들면, 자성을 띤 금속) 또는 염료 (예를 들면, 유기 또는 무기 염료)일 수 있다. 실리카 표면에 접합된 작용기는 항체, 효소, 아비딘, 또는 바이오틴과 같은 단백질일 수 있다. 이것은 또한 DNA와 같은 핵산일 수 있다. 핵산은 예를 들면 형광발색단 그리고 형광발색단의 켄처(quencher)와 접합된, 분자 표지(molecular beacon)의 형태일 수 있다. 작용기는 실리카 표면에 바이오틴-아비딘 결합을 통하여 접합될 수 있다.
나노입자가 유도되는 표적분자는 세포 내, 세포 표면 위 또는 세포 내부의 것일 수 있다. 세포는 포유류 세포 (예를 들면, 암 세포)와 같은 진핵세포, 또는 박테리아와 같은 원핵세포일 수 있다. 표적 분자는 또한 액체 내에 함유된 것일 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들면, 나노입자의 성질의 변화(예를 들면, 빛 방사)를 관찰하여 표적 분자에 대한 나노입자의 결합을 탐지하는, 표적 분자에 결합한 나노입자를 탐지하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 표적 분자가 혼합물 내에 함유된 경우, 이 방법은 혼합물로부터 표적 분자에 결합된 나노입자를 포함하는 복합체를 단리(isolating) 하는 단계, 복합체로부터 표적분자를 분리(separating)하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서 사용된, "나노입자"라는 말은 약 1 ~1000 nm 사이의 직경을 갖는 입자를 의미한다. 나노입자의 "크기"는 나노입자의 가장 큰 직선 치수의 길이를 의미한다. 예를 들면, 완전히 구형 나노입자의 크기는 그것의 직경이다.
여기서 사용된, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 RNA (리보핵산) 및 DNA (데옥시리보핵산)과 같은 둘 이상의 뉴클레오타이드의 사슬을 의미한다. "정제된" 핵산 분자는 핵산이 천연적으로 존재하는 세포 또는 유기체 내의 다른 핵산 서열로부터 실질적으로 분리된 또는 단리된 것이다. (예를 들면, 30,40, 50,60, 70,80, 90,95, 96,97, 98,99, 오염물이 없는 100%).
여기서 사용된, "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 예를 들면, 당화 또는 인산화와 같은 단백질 합성 후 변형(post-translational modification) 또는 길이와 무관하게 아미노산의 펩티드-결합된 사슬을 의미한다.
하나의 핵산을 다른 것에 하이브리드형성(hybridization)하는 경우, "저도의 엄격한(stringency) 조건"은 42℃에서 10% 포름아마이드, 5X 덴하트(Denhart's) 용액, 6X SSPE, 0.2% SDS, 그 후 50 ℃에서 1X SSPE, 0.2% SDS로 세척하는 것을 의미한다. "중간의 엄격한 조건"은 42 ℃에서 50% 포름아마이드, 5X 덴하트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS, 그 후 65 ℃에서 0.2X SSPE, 0.2% SDS로 세척하는 것을 의미한다. 그리고 "고도의 엄격한 조건"은 42 ℃에서 50% 포름아마이드, 5X 덴하트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS, 그 후 65 ℃에서 0. 1X SSPE, 그리고 0.1% SDS로 세척하는 것을 의미한다. "엄격한 하이브리드형성 조건"은 저도의, 중간의, 또는 고도의 엄격한 조건을 의미한다.
여기서 사용된, "서열의 동질성(identity)"은 소단위 매치(matching)를 최대화 하도록 두 서열이 배열되는 경우에, 즉, 갭(gaps ) 및 삽입(insertions)을 고려하여, 두 서열의 대응되는 위치에서 동일한 소단위의 퍼센트를 의미한다. 서열 동질성은 두 서열 모두의 소단위(subunit) 위치가 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의하여 점유되는 경우에 존재한다. 예를 들면, 만일 각각의 두 DNA 분자에서 주어진 위치가 아데닌에 의하여 점유되는 경우, 그 분자들은 그 위치에서 동질하다. 예를 들면, 만일 한 서열 10 길이의 뉴클레오타이드에서 7 위치가 대응 되는 제 2의 10-뉴클레오타이드 서열과 동일한 경우, 두 서열은 70% 서열 동질성을 갖는다. 서열 동질성은 대체로 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, Genetics Computer 그룹, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison,WI 53705의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정된다.
여기서 사용된, "항체"라는 용어는 완전한(intact) 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 항체 단편을 포함한다.
"특이적으로 결합한다."는 한 분자가 샘플 내의 특정의 제 2 분자를 인식하고 부착되나 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 부착되지 않는 것을 의미한다. 일반적으로, 제 2 분자에 "특이적으로 결합하는" 제 1 분자는 약 105 ~ 106 몰/리터 이상의 결합 친화도로 제 2분자에 결합한다.
여기서 사용된, "작용기(functional 그룹)"은 화학적 그룹을 보유하는 물품 (예를 들면, 나노입자)에 특정 작용을 부여하는 화학적 그룹을 의미한다. 예를 들면, 작용기는 특정 분자에 결합하는 것으로 알려진 항체, 올리고뉴클레오타이드, 바이오틴, 또는 스트렙타비딘과 같은 생물학적 활성 물질; 또는 아민, 카복실레이트, 등과 같은 작은 화학 그룹을 포함할 수 있다.
"~와 접합된"은 공유 또는 비-공유 결합된 또는 예를 들면, 직접 또는 간접 결합에 의하여 다른 안정하게 인접하여 연결되는 것을 의미한다. 예를 들면, 아비딘-코팅된 나노입자는 아비딘-바이오틴 결합에 의하여 바이오틴화된 항체와 접합될 수 있다.
다른 정의가 없는 한, 여기서 사용된 기술 용어들은 본 발명의 속하는 분야의 통상의 당업자에게 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
비록 여기서 설명된 것과 유사한 또는 등가의 방법 및 물질이 본원 발명을 수행하거나 테스트하는데 사용될 수 있으나, 적절한 방법 및 물질인 이하에서 설명된다. 여기서 인용된 모든 문헌, 특허 출원, 특허권, 그리고 다른 참조 문헌은 여기 그 전문이 편입된다. 혼동되는 경우, 정의를 포함하는 본원 명세서로 조정된다. 또한, 이하의 특정 실시예는 발명을 상세히 설명하기 위한 것일 뿐 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
도프된 나노입자의 제조
(A) 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)/n-헥산/n-헥산올 (보조계면활성제)/물 유중수 마이크로에멀젼 내의 Eu/Bpy(Eu3+/2,2'-디피리딜)-도프된 실리카 나노입자의 제조
90 ml의 유중수 마이크로에멀젼 저장(stock) 용액이 2.916 g CTAB, 75 ml n-헥산, 15 ml n-헥산올 그리고 880㎕의 물을 자성 교반기를 사용하여 함께 교반함으로써 제조되었다. 10 ml의 이 저장 용액이 동일하게 두 5 ml 분취량으로 나뉘었다. 50 ㎕ TEOS 및 5㎕ 0.1 M Eu/Bpy (수성 용액)이 5 ml 분취량 중 하나에 첨가되고 이 혼합물이 1시간 동안 교반되어 TEOS/Eu/Bpy 용액을 형성하였다. 137㎕ NH40H가 다른 5 ml 분취량에 첨가되었고 이 혼합물 1시간 동안 교반되어 NH40H 용액을 형성하였다. NH40H 용액은 그 후 TEOS/Eu/Bpy 용액에 액적으로 첨가되고 결과물인 혼합된 용액은 하룻밤동안 교반되었다. 혼합된 용액의 물 대 계면활성제 몰 비율은 15 (물: 계면활성제)이었다. Eu/Bpy-도프된 실리카 나노입자는 25 ml의 아세톤을 혼합된 용액의 마이크로에멀젼에 첨가하고, 결과물인 혼합물을 15 분 동안 10,000 RPM으로 마이크로원심분리기에서 나노입자를 모으기 위하여 원심분리하고, 상층을 제고하고 남은 나노입자를 아세톤 또는 에탄올/물 용액으로 계면활성제 및 다른 마이크로에멀젼 성분을 더욱 제거하기 위하여 세척함으로써 분말 형태로 단리 되었다. 세척된 나노입자는 그 후 아세톤이 건조되었다.
(B) Ru/Bpy[RuⅡ(Bpy) 3]-도프된 나노입자의 제조
10 ml의 유중수 마이크로에멀젼이 7.5 ml 사이클로헥산, 1.8 ml n-헥산올, 1.77 ml TX-100, 340㎕ 물 그리고 140 ㎕ 0.1 M RuⅡ(Bpy) 3 (수성 용액)을 1시간 동안 자성 교반기로 혼합함으로써 제조되었다. 결과 용액은 그 후 두 5 ml 분취량으로 나뉘었다. 100㎕ TEOS가 분취량에 첨가되고 혼합물은 30분 동안 교반되어 TEOS 용액을 형성하였다. 60㎕의 NH40H이 다른 5 ml 분취량 에 첨가되고 혼합물은 30분 동안 교반되어 NH40H 용액을 형성하였다. NH40H 용액은 그 후 TEOS 용액에 액적으로 10분 동안 첨가되고 결과물인 혼합된 용액은 하룻밤동안 교반되었다. Ru/Bpy 도프된 실리카 나노입자가 전술한 실시예1A에서와 같이 단리 되었다.
(C) 테트라메틸로다민 (TMR) -도프된 나노입자의 제조.
유중수 마이크로에멀젼 용액이 1.77 ml의 트리톤 X 100 (계면활성제), 1.8 ml의 n-헥산올 (보조계면활성제), 7.5 ml의 사이클로헥산 (오일), 그리고 아세트산(물)내의 0.48 ml의 1.2mM TMR를 혼합함으로써 제조되었다. 전구체(100㎕의 TEOS)가 이 마이크로에멀젼 용액에 첨가되고, 30분 동안 교반되었다. 실리카 중합 반응이 24시간 동안 교반함으로써 완결되었다. 마이크로에멀젼 시스템을 분해하고 또한 용액으로부터 나노입자를 분리하기 위하여, 20 ml의 아세톤이 마이크로에멀젼 용액에 첨가되었다. 소니케이션 및 볼텍싱(vortexing) 후, 용액이 원심분리되어 TMR-도프된 나노입자를 얻었다. 결과물인 나노입자는 95% 에탄올 4회 및 아세톤으로 1회 세척되었다. 각각의 세척 후, 나노입자는 소니케이션 및 교반을 사용하여 용액 내에 완전히 분산되었다.
나노입자의 형성 동안 TMR 분자의 도핑에서 아세트산의 작용을 명확히 하기위하여, 유기 산, 즉 염산(HCl)이 아세트산에 비교되었다. 일정 용량의 TMR가 물 풀(pool)을 형성하기 위하여 다른 농도의 HCl에 첨가되었다. 순수한 물의 경우에서와 같이, 물 풀에 HCl의 사용은 TMR를 함유하지 않는 실리카 나노입자를 초래하였다. 이 결과는 실리카 매트릭스 내에 잡혀있는 TMR은 pH 변화에 의한 것이 아니라, 유기산에서 TMR 용해도의 결과라는 것을 입증하였다.
아세트산은 또한 마이크로에멀젼 시스템에서 TMR-도프된 나노입자의 합성 동안 TEOS의 가수분해 촉매로서 작용하였다. 중합 공정은 60㎕의 NH40H를 마이크로에멀젼 시스템에 첨가함으로써 개선되었다. 큰 입자 형성의 가능성을 더욱 낮추기 위하여, 에탄올 및 아세톤이 합성 공정 후 결과물인 나노입자의 세척에 사용되었다. 마이크로에멀젼 방법으로 제조된 TMR-도프된 실리카 나노입자의 TEM 관찰 결과는 나노입자의 최종 크기는 구형 물 풀의 크기에 상당히 의존한다는 것을 보여주었다. 물 대 계면활성제(W0) 값의 배율을 변화시킴으로써, 다른 크기의 나노입자를 얻을 수 있다. 일 실시예로서, 10의 W0 값 사용은 직경의 60 ± 4 nm의 나노입자를 초래하였다.
TMR의 도핑에 대한 아세트산 농도의 효과.
물 풀 내의 아세트산의 농도는 나노입자 내에 트랩된(trapped) TMR 분자의 용량에 상당히 영향을 준다. 아세트산의 농도가 10.0M보다 낮은 경우, 나노입자의 낮은 형광 강도에 의하여 지시되는 바와 같이 TMR 분자가 조금 도프 된다. 물 풀에서 아세트산의 농도가 10 M보다 높은 경우, 도프된 TMR의 용량은 상당히 증가된다.
나노입자의 형광 강도에 대한 TMR 농도의 효과.
TMR-도프된 나노입자의 형광 강도는 실리카 매트릭스 내에 도프된 TMR 분자의 수에 의존하였다. 자체-켄칭에 의하여, 나노입자의 형광 강도는 염료-도프된 분자의 수에 비례하지 않는다. 최대 형광 강도를 얻을 수 있는 나노 입자의 특정 크기를 위한 최적 염료 농도가 존재하였다. TMR의 최적 농도를 결정하기 위하여, TMR- 도프된 실리카 물 풀의 총 부피에 대하여 0 ~4 mM로 염료 농도를 변화시키는 조건 하에서 나노입자가 합성되었다. 결과물인 나노입자의 형광 강도가 형광 분광계를 사용하여 550 nm 여기(excitation) 및 575 nm 방사에서 0.1 mg/ml 나노입자 함유 용액 내에서 탐지되었다. 결과는 MR-도프된 나노입자의 최고 형광 강도는 1.2 mM TMR 농도에서 일어난다는 것을 보여주었다. 또한 TMR 분자 부하는 TMR 분자의 자체-켄칭으로 인하여 나노입자의 형광 강도를 감소시켰다.
TMR-도프된 나노입자의 형광 시그널의 증폭. 무기 염료-도프된 나노입자에 비하여 TMR-도프된 나노입자로 얻을 수 있는 시그널의 증강의 정도가 측정되었다. RuBpy-도프된 나노입가 전술한 바와 동일한 마이크로에멀젼 방법을 사용하여 합성되었다. 용액 내 그리고 고체 표면에 고정된 나노입자의 형광 시그널 모두가 현미경 및 감수성 형광 분광계를 사용하여 탐지되었다. 이 두 종류의 나노입자 샘플은 동일한 방식으로 가공되었다.
용액 내의 탐지를 위하여, 0.1 ㎍/ml ~ 1 ㎍/ml 범위의 몇몇 농도의 나노입자가 형광 분광계를 사용하여 분석되었다. 나노입자의 밀도에 기초하여, 단일 나노입자의 평균 형광 시그널을 얻기 위하여 각각의 샘플 내의 나노 입자의 수가 계산되었다. 이 결과는 TMR 나노입자의 형광 강도는 RuBpy 나노입자의 나노 입자보다 40배 더 높다는 것을 보여주었다.
제 2 비교, 즉 하나의 TMR-도프된 나노입자와 하나의 TMR 분자의 비교가 유사한 방식으로 수행되었다. 이 결과는 TMR 나노입자 vs. TMR 분자의 15,000 x 시그널 증강을 입증하였다. 증폭의 추가적 확인은 다른 실험 방법을 사용하여 얻었다. 단일 나노입자의 형광 강도는 현미경을 사용하여 유리 표면 상의 형광 이미지에 기초하여 탐지되었다. 빈번한 소니케이션과 볼텍싱으로, 나노입자 용액은 샘플 내에서 나노입자의 응집이 적은 상태로 희석되었다. (SEM에 의하여 입증된 결과) 따라서 현미경 이미지에서의 각각의 형광 점(spot)은 단일 나노입자에 대응되었다. 하나의 TMR 나노입자의 평균 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 통계학적으로 얻었으며, 얻어진 결과는 형광 분광계로 얻은 결과에 잘 연관되었다.
TMR-도프된 나노입자의 안정성. 나노입자의 광 안정성을 입증하기 위하여, 순수한 TMR 분자가 용액 내에서 TMR-도프된 실리카 나노입자와 비교되었다. 550 nm 빛으로 20 분 동안 연속적으로 조사한 후, 순수한 염료 분자의 형광 강도는 85% 감소한 반면, 나노입자의 형광 강도는 일정하게 유지되었다.
수성 용액 내에서의 TMR-도프된 나노입자의 장-기간 안정성.
이 분석은 오랜 기간 동안 용액 내에 침지된(immersed) 실리카 매트릭스로부터 염료 분자의 가능한 유출(potential leakage)에 주목하였다. TMR-도프된 나노입자는 물 용액에 각각 3일 및 7개월 동안 침지되었으며, 용액의 형광 강도가 순차적으로 탐지되었다. 샘플들은 원심분리되어 TMR-도프된 나노입자가 나노입자로부터 걸러내어진 TMR 분자 함유 상층액으로부터 분리되었다. 침전물은 최초 부피로 물로 재현탁 되었으며 형광 강도가 탐지되었다. 원심분리 전 후의 형광 강도의 비교는 수성 용액에서 3일 후 기질로부터 TMR 분자의 유출이 없었음을 나타내었다. 7개월 저장 후, 오직 8.5% TMR만이 실리카 기질로부터 유출되었다. 이들 결과는 일단 TMR 분자가 실리카 기질 내에 갇히면, 그들은 나노입자 내에 단단히 파묻힌 채로 유지된다는 것을 명백히 나타내었다.
(D) R6G-도프된 나노입자의 제조.
3 ml의 에탄올 내의 1 mM 용액의 염료가 1.0 ml 페닐트리에톡시실란(PTES)과 혼합되었다. 염산 또는 수산화암모늄이 결과 용액에 첨가되어 PTES의 가수분해를 시작하였다. 반응의 완결은 몇 시간 후 하나의-상 시스템의 형성에 의하여 지시되었따. 가수 분해된 용액 (0.5 ml)에 그 후 100㎕ TEOS가 첨가되고, 에탄올로 5.0ml로 용해되고, 그리고 나아가 소버 공정[Sober process]을 통하여 수산화암모늄과 반응되었다. (Stober et al. , J Colloid and Interface Sci. 26: 62, 1968). 이 반응은 1시간 동안 0℃에서 연속적인 소니케이션과 빈번한 볼텍싱과 함께 수행되었다. 나노입자 형성은 혼합물에 과량의 아세톤을 첨가함으로써 종결되었다.
TEM 및 SEM는 상기 공정이 100-nm 직경에 근접한 유기 염료-도프된 나노입자의 형성을 초래한다는 것을 입증하였다. 이 반응을 12시간 이상 진행되도록 하면 마이크로미터 범위의 입자를 초래하였다.
PTES의 용량은 나노입자 내에서 R6G의 포획에 중요한 인자이다. PTES의 증가된 용량은 형광 강도의 증가로 나타나는, 대응되는 도프된 염료 분자의 수득율의 증가를 초래하였다. 형광 강도 비교는 다른 PTES: TEOS 부피 비율,((1SR1) 0.25 : 1,(1SR2) 0.5 : 1, 그리고(1SR3) 1 :1)을 갖는 샘플에 대하여 수행되었다. 이로부터 침전이 성형되기 시작하는 한계 비율이 있음이 측정되었다. PTES의 지나치게 고농도는 높은 소수성을 갖는 나노입자를 산출하였다. 2:1 또는 그 이하의 비율은 수용성 나노입자 생성물을 산출하는 것으로 밝혀졌다. 용액 내의 R6G의 농요의 효과는 PTES 및 TEOS의 일정 용량 조건 하에서 측정되었다. 증가된 명목상(nominal) 농도의 R6G로 증가된 형광 강도가 관찰되었다. 1ml 용액에 분산된 1mg 샘플의 형광 강도가 순수한 R6G의 다양한 농도에 비교되었다. 나노입자에 트랩된 R6G의 용량이 순수한 R6G 분자를 사용하여 수립된 보상(calibration) 곡선에 기초하여 1% 미만으로 계산되었다. 나노입자 내의 1%의 R6G농도로, 나노입자는 20%의 염료를 최적으로 함유하는 RuBpy-도프된 나노입자보다 높은 발광 강도를 나타내었다.
일단 염료 분자가 실리카 기질 내에 트랩되면, 나노입자는 아세톤 및 물로 세척되었다. 도프된 염료 분자는 수성 용액에서 최소의 유출을 나타내었다. 샘플은 3일동안 침지되었고 원심분리 전후의 용액의 형광이 비교되었다. 3-일 수용액이 원심분리되어 상층액으로부터 염료-도프된 나노입자를 분리하였다. 침전은 다시 물에 최초 부피로 재현탁 되었고, 원래 용액 및 재현탁된 침전물의 형광 강도가 비교되었다. 강도에 현저한 차이는 관찰되지 않았으며, 이것은 대부분의 염료 분자가 아마도 PTES의 소수성 성질에 의하여 나노입자의 기질 내에 트랩되어 유지된다는 것을 지시한다.
광표백(photobleaching)을 평가하기 위하여, 순수한 염료 및 염료-도프된 나노입자의 광 안정성이 비교되었다. 샘플은 연속적으로 1000초 동안 방사되었으며, 형광 강도는 고체-상태 형광 분광을 사용하여 감시되었다. 실험적 불안정성을 최소화하기 위하여, 감시하는 동안 샘플은 두 커버슬립 사이에 끼워졌다. 결과는 순수한 R6G의 강도가 급속히 감소하는 반면, 나노입자 내의 R6G의 형광 강도는동일한 조건 하에서 현저히 변화하지 않는 것을 나타내었다. 나노입자 내 유기염료의 훨씬-개선된 광 안정성은 생물 분석의 광표백을 최소화시키며, 이로써 이들 나노입자를 사용하는 생물 분석의 정확도를 증가시킨다.
실시예 2-항체-접합된 나노입자를 사용하는 세포 탐지
실리카-코팅된 나노입자가 세포 인식 및 표시에서의 그들이 유용성을 보여주기 위하여 몇몇 용도에 사용되었다. 일 실시예에서, 실리카-코팅된 나노입자가 항체와 접합되었다. 실시예 1 (A)에 개시된 바와 같이 제조된 나노입자는 입자 표면을 DETA, 실리카 표면의 일차 아민 그룹에 부착하는 실란화제(silanization agent)로 제 1 실란화 함으로써 항체로 유도되었다. 플루오레스카민(fluorescamine) 일차지방족 아민 그룹과의 반응으로 매우 형광성이 되는 비- 형광 분자 (Cordek et al., 1999; Chung, 1997)를 사용하여, 나노입자 표면의 아민 그룹의 존재가 확인되었다. 표면을 DETA로 실란화한 후, 항체 (쥐 항-인간CD 10)가 실란화된 실리카 표면에 시아노겐 브로마이드 (CNBR) 방법을 사용하여 고정되었다. 염료-도프된 입자 가 전술한 대로 제조되었으며, 건조, 그리고 9.0ml 2M 소듐 카보네이트 용액 (활성화 완충제)에 울트라소니케이션을 사용하여 재현탁 되었다. 아세토니트릴 내의 CNBR 용액 (1.0 gm의 CNBR이 0.5 ml 아세토니트릴에 용해됨)이 그 후 액적으로 나노입자 현탁액 (10 mg/ml)에 교반하의 실온에서 5분 동안 첨가되었다. 결과물인 CNBR-활성화된 입자는 냉각수로 2번 그리고 PBS 완충제 (pH 8.0)로 두 번 세척되었다. PBS 완충제 (pH 8. 0)로 희석된 40㎕의 항체가 그 후 표면-변형 입자에 첨가되고 교반이 4℃에서 24시간 동안 계속되었다. 결과물인 항체-유도된 나노입자는 그 후 10 ml의 0.03M 글라이신 용액으로 30 분 동안 처리되어 남아있는 반응성 부위를 차단하였다. 최종 생성물은 세척되고, PBS 완충제 (pH 8.0)로 재현탁 되고 4 ℃에서 이후의 사용을 위하여 저장되었다. 나노입자의 광학적 및 광학적 및 분광화학적 변화는 관찰되지 않았다.
단핵 임파구 세포(약 2 백만 세포/ml)를 세포 배양 배지로부터 현탁액으로서 얻었다. 이 세포 현탁액은 2 시간동안 나노 입자에 고정된 항-CD 10와 배양되었다. 배양 후, 세포 현탁액은 광학적 현미경 및 형광 현미경으로 영상화하였다. 현미경 분석 결과 대부분의 세포가 표지된(염료-도프된 입자의 밝은 방사로 지시됨) 것으로 나타났다. 광학적 이미지는 형광 이미지에 잘 부합되었다. 비-항체 유도된 염료-도프된 나노입자를 사용한 대조 실험에서, 세포의 표지는 관찰되지 않았다. 표지된 세포에서, 시그널-대-노이즈 비율(즉, 형광 이미지에서 밝은 그리고 어두운 영역의 강도의 비율)은 500이상 이었다.
실시예 3-단백질-접합된 나노입자를 사용하는 방법
PDGF-접합된 나노입자.
혈소판-유도 성장 인자 (PDGF) 수용체의 탐지를 위한 나노입자의 유용성을 평가하기 위하여, PDGF가 TMR-나노입자(실시예 1과 같이 제조된)와 나노입자 상에 공유 고정에 의하여 접합되었다. TMR-도프된 실리카 나노입자의 표면은 먼저 화학적으로 변형되었다. 나노입자 표면에 아민-기능성 그룹을 형성하기 위하여, 실리카 나노입자는 1mM 아세트산 내의 1% DETA와 실온(room temp)에서 30분 동안 교반하면서 반응되었다. 아민-기능성 나노입자는 골고루 증류, 탈이온수로 3회 세척되었다. DMF로 세척 후, 나노입자는 DMF 용액 내의 10% 숙시닉 안하이드라이드와 N2가스 하에서 6시간 동안 계속 교반하면서 반응되었다. 전체적인 물 세척 후, 나노입자는 MES 완충제 (pH 6.8) 내의 100 mg/ml의 EDC 및 100 mg/ml의 NHS를 사용하여 25 분 동안 실온에서 계속 교반하면서 활성화되었다. 물-세척된 나노입자는 0.1M PBS (pH 7.3)에 분산되었다. PDFG를 나노입자 표면에 공유 고정하기 위하여, 나노입자는 10 nM PDGF와 3시간 동안 실온에서 계속 교반하면서 반응되어 나노입자-단백질의 결합체(conjugate)를 형성하였으며, 그 후 PBS 완충제에서 세척하였다. 수반되는 반응에서 비-특이적 결합의 작용을 감소시키기 위하여, 단백질-접합된 나노입자는 1% BSA로 반응되었고 사용 전에 0.1 M PBS (pH 7.3)로 세척되었다.
PDGF-나노입자의 결합은 HTB-26, 유방 암 세포 주를 사용하여 테스트되었다. 이 분석을 위하여, HTB-26 세포의 현탁액이 PDGF-TMR-나노입자와 30분 동안 37 ℃에서 5% C02와 배양되었다. 광학 그리고 형광 현미경으로 분석한 결과, 밝게 표지된 세포는 PDGF-TMR-나노입자로 배양된 세포에서 HTB-26 세포의 PDGF 수용체의 존재를 지시하는 것을 나타내었다. 반대로, PDGF 없이 TMR- 나노입자로 배양된 세포는 형광이 없었다. 이들 결과는 세포의 형광 표지는 세포 표면의 PDGF 수용체에 PDGF-TMR-나노입자의 결합에 의한다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 세포 연구를 위한 고도로 형광의 광 안정한 바이오마커로서, TMR-도프된 나노입자의, 수용체 결합과 관련된 용도의 명백한 실시예를 제공한다. 이 방법의 다른 실시예에서, PDGF 수용체를 발현하는 선암종(adenocarcinoma) 세포 (MDA-MB-231)가 PDGF-접합된 TMR-도프된 나노입자와 배양되었다. 형광 현미경은 역시 세포의 표면이 PDGF- 접합된 TMR-도프된 나노입자에 결합되는 것을 나타내었다.
GDH-접합된 나노입자.
글루타메이트 탐지를 위한 바이오센서로서 R6G 도프된 나노입자가 효소, 즉 글루타메이트 디하이드로게나아제 (GDH)를 나노입자 표면에 고정함으로써 테스트되었다. GDH가 개시된 방법(Cordek J. et al. , Anal. Chem. 71: 1529,1999 ; Qhobosheane S. et al, Analyst 126: 1274,2001)의 변형을 사용하여 나노입자 상에 고정되었다. 간단히, 효소와의 생접합(bioconjugation)을 위하여, 1 mM 아세트산 내의 나노입자가 2% 용액의 아미노실란, Nl-[3- (트리케촉시실릴) 프로필] 디에틸렌 트리아민으로 변형되었다. 결과물인 나노입자는 수반되는 효소, 글루타메이트 디하이드로게나아제(GDH)에의 접합 전에 이중-관능성 가교제(bifunctional crosslinker)인, 글루타릭 디알데하이드로 더욱 처리되었다. 각각의 단계 후 적절히 세척되었다. 효소 반응, NAD+ + 글루타메이트 -> NADH + α-케토글루타레이트 반응이 나노입자에 고정된 GDH 분자의 활성을 테스트하기 위하여 사용되었다. NADH의 형광은 글루타메이트의 분석을 위하여 감지되었다.
고정된 분석대상을 탐지하기 위한 BSA-코팅된 나노입자.
아비딘이 물리적으로 실리카-코팅된, R6G-도프된 나노입자의 표면 및 유리 플레이트에 흡수되었다. 아비딘은 그 후 글루타르알데하이드와 가교되고 트리스-HCl 완충제 내에 저장되었다. 코팅된 유리 플레이트는 바이오티닐레이트화 된 소 혈청 알부민 (BSA)의 두 가지 다른 농도로 처리되었다. 각각의 BSA 분자는 평균 9 바이오틴 분자를 보유하였다. 바이오틴-아비딘 상호작용은 유리 플레이트 상의 사용 가능한 바이오틴 분자와 아비딘-코팅된 나노입자를 결합하도록 함으로써 체크되었다. 이 실험은 로다민 6G의 520 nm 여기(excitation) 및 550 nm 방사에 선택적인 필터 세트를 사용하는 형광 현미경으로 수행되었다. 바이오티닐레이트화 된 BSA (2mg/ml)의 최대 농도를 함유하는 유리 표면에 증가하는 수의 나노입자가 부착되는 반면, 변형되지 않은 BSA를 함유하는 대조군에서 결합은 거의 관찰되지 않았다.
실시예 4-핵산의 탐지
Ru/Bpy-도프된 실리카 나노입자가 특이적 DNA 분자의 탐지를 위한 프로브로서 사용되었다. 이 방법의 개요는 도 4에 도시된다. 여기서 세 가지 다른 올리고뉴클레오타이드(즉, DNA1, DNA2, 그리고 DNA3)가 샌드위치 분석에 사용되었다. DNA1, 바이오티닐레이트화 된 캡쳐 DNA는 아비딘-코팅된 유리 기질에 고정되었다. DNA2, 표적 DNA는 그 후 하이브리드 형성을 증진시키는 조건 하에서 기질에 접촉되었다. DNA3와 접합된 염료-도프된 실리카 나노입자 또한 이 기질에 첨가되었다. DNA1 및 DNA3은 DNA2, 표적 DNA의 다른 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 역상 현미경이 발광시그널 탐지에 사용되었으며, SEM이 기질 표면에 나노입자 프로브의 결합을 확인하기 위하여 사용되었다.
수정(quartz) 유리 기질에 DNA 고정.
10M NaOH에 하룻밤 동안 침지시켜 세척된 커버슬립이 12시간 동안 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0)내의 1 mg/ml 아비딘 (분자 프로브, Eugene, OR) 용액에서 배양되었다. 아비딘 층은 글루타르알데하이드 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (100 mM 포타슘 포스페이트 완충제 내의 1%, 실온에서 1시간 동안)로 가교시키고 수반되는 1M 트리스- HCl (pH 7.5)에서의 배양에 의하여 안정화되었다. 20 uM 바이오티닐레이트화 된 DNA1 (5'TAA CAA TAA TCC T3' ; SEQ ID NO : 1) (IDT, Coralville IA)의 250 nL 분취량을 기질에 떨어뜨리고(spotted) 이것은 그 후 가습 챔버(humidified chamber)에서 12시간 동안 배양하였다.
나노입자-프로브에 DNA 고정.
10 mg 샘플의 Ru/Bpy-도프된 실리카- 코팅된 나노입자가 1 ml의 아비딘 용액 (Fang et al. , Anal. Chem. 72: 747A, 2000)에서 배양되었다. 아비딘 코팅은 1% 글루타르알데하이드로 가교되고 나노입자가 트리스-HCl 용액에서 배양되었다. 나노입자는 그 후 12시간 동안 1 ml의 20μM의 DNA3에서 배양되어 DNA3 (5'TAT CCT TAT CAA TAT T3' ; SEQ ID NO : 2)를 나노입자의 표면에 고정하였다. 엄격한 세척 및 원심분리가 각각의 단계에 수반되었다. 결과물인 나노입자는 배양을 위한 DNA3 농도가 1μM인 경우 0.5 mg/ml의 최종 농도로 재현탁 되었다.
DNA 하이브리드형성.
표적 용액, DNA2 (5'GGA TTA TTG TTA AAT TTA GAT AAG GAT3' ; SEQ ID NO : 3) (IDT, Coralville IA)의 분취량이 50℃로 보온되고, 기질 상의 DNA1 고정된 지점에 배치되고 4시간 동안 배양되었다. 완충제로 엄격히 세척한 후, DNA3-접합된 나노입자가 기질에 첨가되고 가습 챔버에서 4시간 동안 하이브리드 되도록 하였다. 각각의 단계에 엄격한 세척이 수반되었다. 배양이 수행되었다. 10-12 ~ 10-6 범위의 표적 DNA2의 다양한 농도가 분석되었다. 프로브 DNA 및 캡쳐 DNA의 동일한 농도가 모든 실험에서 사용되었다.
광학적 테스트 및 영상화(imaging).
ICCD장치(intensified charge coupled device)가 구비된 역상 형광 현미경을 사용하여(Olympus, model IX708F) 발광 이미지를 얻었다. SEM 이미지는 Hitachi S-4000 FE-SEM를 사용하여 얻었다. 농도 의존성 발광 강도 데이터가 탐지 한계를 평가하기 위하여 사용되었다. 선택성 실험이 유사한 방식으로 수행되었다. 상보적인 표적 및 하나의-염기 미스 매치된 DNA 모두로 부터의 발광 시그널이 비교되었다.
전술한 방법을 사용하여, DNA1이 아비딘-코팅된 유리 기질에 고정되었다. 고정된 DNA1는 그 후 DNA2의 한 말단과 하이브리드 되도록 하였다. DNA2의 하이브리드 되지 않은 15 염기는 그 후 Ru/Bpy-도프된 실리카-코팅된 나노입자에 부착된 바이오티닐레이트화 된 DNA3와 하이브리드 되었다. 기질 표면은 하이브리드 되지 않은 DNA 프로브 및 물리적으로 흡수된 나노입자를 씻어내고 난 후 영상화되었다. 형광 및 SEM 이미지 모두는 나노입자가 기질 표면에 부착되었음을 확인하였으며, 세 가지 다른 DNA의 하이브리드 형성이 일어났음을 지시한다.
하이브리드형성 공정에 대한 온도의 작용을 체크하기 위하여, 전술한 분석이 25℃, 35℃, 45℃, 그리고 55℃에서 반복되었다. 온도 평형은 자동 온도조절 장치 제어를 사용하여 얻었다. 발광 강도는 5℃까지 온도와 함께 증가되었으며, 그 이상에서는 강도의 감소가 관찰되었다. 이하의 대부분의 실험에서, 편의를 위하여 25℃가 사용되었다.
NA 표적의 고감도 분석.
시그널의 농도 의존성 또한 표적 DNA (DNA2)의 다른 범위, 즉 10-l2M ~ 10-6 M의 농도에 대하여 형광 영상화(imaging) 기술을 사용하여 테스트되었다. 10-11M ~10-9M 그리고 10-9M ~10-6M에 대한 보정 곡선(Calibration curves)이 그려졌다. 영상화 소프트웨어를 사용하여, 각 샘플의 평균 시그널 강도를 얻었다. 최고 농도 범위(1 μM 및 이상)을 제외하고는 전체적으로, 표적 DNA 농도와 발광시그널 사이에 우수한 선형 상호관계가 존재하였다. 가능한 포화가 5 x 10-7M 그리고 1 x 10-6M에서 관찰되었다. 이 농도 의존성은 형광 발광 이미지 및 SEM 이미지 모두에서 명백하였다. SEM 이미지는 표적 DNA의 농도가 증가됨에 따라 나노입자 밀도의 증가를 나타내었다. 캡쳐 DNA 및 프로브 DNA의 농도는 이들 실험에서 일정하게 유지되었다. 특히, 이 분석의 탐지 한계는 3 x 10-12M이었다.
A-T 및 G-C 미스매치 변화. 전술한 방법은 매우 민감하여 27 bp 선형 DNA에서 단일 염기의 매스매치를 구별할 수 있다. 도 7A에 도시된 바와 같이, 상보적인 DNA (즉, DNA2)로부터 얻은 발광 강도와 동일 농도의 하나의-염기가 미스 매치된 표적 DNA, 즉 xDNA2 (5'GGA TAA TTG TTA AAT TTA GAT AAG GAT3' ; SEQ ID NO : 4)으로부터 얻은 발광 강도 사이에는 커다란 차이가 있다. 더욱이, 도 7B에서, 염료-도프된 나노입자에 의하여 제공된 시그널의 증폭은 매우 커서 심지어 G-C 미스매치와 A-T 미스매치를 구별할 수 있다.
실시예 5-고정된 분자 표지를 사용하는 핵산의 탐지 및 분리
화학물질 및 장치
모든 생화학 물질은 구입하였고 받은 대로 사용되었다. 라이소자임 (Lyz), 헤모글로빈(Hb) 그리고 BSA는 Sigma (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 페릭 클로라이드, 페로스 클로라이드, 트리톤 X-100, 이소옥틸페닐에테르, 4-(C8H17) C6H4(OCH2CH3)nOH, n~10), 그리고 TEOS는 Aldrich Chemical Co. nc. (Milwaukee,WI)로부터 구입하였다. 사이클로헥산, n-헥산올, 소듐 하이드록사이드는 Fisher Scientific Co. (Pittsburgh, PA)에서 구입하였다. 자성을 띤 나노입자 합성에서 증류된 탈이온수 (Easy Pure LF)가 모든 수용액의 제조에 사용되었다. FS20 울트라소니케이터 (Fisher Scientific Co.), 원심분리기 5810 R(Eppendorf), Hitachi H-7000 전사 전자 현미경 (일본) 그리고 MPMS-5S SQUID(Superconducting Quantum Interference Device)자력계가 자성을 띤 나노입자의 합성 및 특정에 사용되었다.
Fluorolog TAU-3 형광 분광계 (Jobin Yvon-Spex, Instruments S. A. , Inc. )가 다른 온도에서 형광 강도의 탐지에 사용되었다.
(A) 표면에 부착을 위한 바이오티닐레이트화 된 MBs의 제조.
바이오티닐레이트화 된 MB의 합성.
표면에 의 부착에 적절한 MB가 아비딘-바이오틴 결합에 기초하여 설계되었다. MB의 뉴클레오타이드 서열은 총 28 염기쌍으로 설계되었으며, 그 중18 염기쌍이 관심 대상의 루프 서열이다. 서로 상보적인 5 염기쌍이 스템을 형성하였다. 선택된 형광발색단은 TMR이고 켄처는 DABCYL이었다. (모두 Molecular Probes, Eugene, OR). 표적 DNA는 다음의 서열을 가졌다.: 5'-TTC CTT CCT GGG CAT GGA-3' (SEQ ID NO :5). 표적 DNA와 하이브리드 되도록 설계된 바이오티닐레이트화 된 MB는 10076의 분자량, 그리고 다음의 서열을 가졌다. : 5'-GCA CGT CCA TGC CCA GGA AGG AAC G (바이오틴 dT) G C-3' (SEQ ID NO : 6) 그리고 TMR 및 DABCYL에 그것의 각각 5' 그리고 3'말단에 접합되었다.
바이오티닐레이트화 된 MB가 출발 물질로서 DABCYL-CPG (제어된 기공 유리)를 사용하여 합성되었다. 이 합성은 4 중요한 단계에 관련된다. 첫째, CPG 고체 지지체가 DABCYL로 유도되고 3'말단에서 합성을 시작하기 위하여 사용되었다. 남아있는 뉴클레오타이드는 바이오틴을 링의 C5탄소에 부착되도록 하는 바이오틴-dT 잔기를 포함하는 (Glen Research), 표준 사이아노에틸포르포아미디트 화학 작용을 사용하여, 순차적으로 첨가되었다. 바이오틴의 목적은 표면에 결합딘 아비딘 분자에 링크를 제공하기 위한 것이다. 둘째, 이 뉴클레오타이드의 5'말단은 (CH2) 6-NH 링커 암(linker arm)에 접합되어, 5'말단에서 일차 아민 그룹을 형성하였다. 5'말단의 이 일차 아민 그룹은 6 탄소 스페이서 암(six carbon spacer arm)에 의하여 포스포디에스테르 결합에 연결되었다. 최종 5'-말단에 아민 그룹을 보호하는 트리틸(trityl) 보호 그룹이 있다. 셋째, 올리고뉴클레오타이드는 역상 HPLC에 의하여 정제되었고, 소듐 염으로 전환되었다. 최종적으로, 정제된 올리고뉴클레오타이드는 하룻밤 동안 소듐 바이카보네이트/DMF 완충제에서 TMR으로 표지되었다. 5' 트리틸 그룹은 아세트산으로 1시간 동안 처리하여 제거되었으며, 그 후 진공 하에서 하룻밤 동안 건조되었다. 표지 후, 과량의 염료는 Sephadex G-25 젤 여과 크로마토그래피에 의하여 제거되었다. 설계된 바이오티닐레이트화 된 MB를 나타내는 올리고뉴클레오타이드는 그 후 역 상 HPLC로 정제되고 주요 피크가 수집되었다.
용액 내의 바이오티닐레이트화 된 MBs를 사용하는 하이브리드형성 연구.
새로이 합성된 바이오티닐레이트화 된 MB가 용액 내에서 그것의 DNA 하이브리드형성 성질을 평가하기 위하여 사용되었다. 하이브리드형성 성질은 SPEX Industries F- 112A 분광계에서 수행되는 형광 측정을 사용하여 테스트되었다. 서브-마이크로 수정(quartz) 셀이 하이브리드형성 실험에 사용되었다. MB 단독, MB 및 5-배 몰 초과의 그것의 상보적인표적 DNA, 그리고 MB와 5-배 몰 초과의 비-상보적인 DNA를 함유하는 세 가지 용액이 제조되었다. 세 가지 모든 용액 내의 MB의 최종 농도는 50 nM이었다. 용액(200μl)이 20 mM 트리스-HCl, 50 mM KC1, 그리고 5 mM MgCl2 (pH =8.0)를 함유하는 완충제 용액 내에서 20분 동안 배양되었다. 방사 스펙트럼은 실온에서 515 nm 여기(excitation)에서 기록되었다.
용액 내에서 하이브리드된 바이오티닐레이트화 된 MB는 표적 DNA 분자와 반응한 경우 형광 시그널의 10-배 이상 증강을 나타내었다. 비- 상보적인 DNA와의 용액은 동일한 조건 하에서 증강을 나타내지 않았다. 바이오티닐레이트화 된 MB의 하이브리드 형성 역학은 바이오틴 없는 MBs를 사용하여 얻은 것과 비교되었으며, 모든 경우 유사한 결과를 얻었다.
(B) 고체 플레이트 상에 고정된 MBs의 제조 및 사용.
바이오티닐레이트화 된 MB의 실리카 플레이트상에 고정.
실리카-코팅된 표면을 준비하기 위하여, 실리카 유리 커버 슬립이 우선 1:1의 HCl:수용액에서 2시간 동안 세정되었다. 물로 골고루 헹구어 낸 후, 커버슬립은 10 M NaOH 용액에 하룻밤동안 배치되었고, 다시 물로 헹구었다. 처리된 커버슬립은 그 후 아비딘 용액(0.lmg/ml, 10 mM 포스페이트 완충제, pH 7.0)에서 12시간 동안 배양되었다. 물리적으로 흡수된 아비딘은 1% 글루타르알데하이드 완충제 용액에서 1시간 동안 가교됨으로써 안정되었고, 1M 트리스/HCl (pH 6.5)에서 3시간 동안 배양되었다. 아비딘-코팅된 커버슬립은 그 후 포스페이트 완충제로 세척되었고 질소 하에서 건조되었다. MB-코팅된 표면을 생성하기 위하여, 바이오티닐레이트화 된 MB 용액(lx 10-6M in the 완충제) 1방울이 아비딘-코팅된 커버슬립에 첨가되었다. 아비딘-바이오틴 결합 시간은 몇 분 ~ 30분 정도이다. 커버슬립은 그 후 하이브리드형성 완충제 (20 mM 트리스-HCl, 50 mM KC1,5mM MgCl2, pH 8.0)로 세척하여 결합되지 않은 MBs를 제거하였다. 결합 공정은 빠르고 효율적이었다. 몇 분 이내에, 커버 평형(coverage equilibrium)이 도달되었다. 고정된 MB는 완충제 용액에 며칠간 침지한 후에도 아비딘-코팅된 표면에 부착되어 유지되었다.
플레이트에 고정된 바이오티닐레이트화 된 MBs를 이용한 하이브리드형성 연구.
MB 형광 강도가 다른 하이브리드형성 조건 하에서 감시되었다. 형광 시그널의 감시는 ICCD, 전술한 바와 같은 현미경 스테이지로의 빛의 전도를 위한 아라곤 이온 레이저 및 광학적 섬유 프로브, 형광 현미경을 사용하여 수행되었다. (Fang, X and Tan, W, Anal. Chem. 71,3101-3105, 1999). 여기(excitation) 레이져 빔, 514 nm,이 먼저 50μm 코어를 갖는 광학적 섬유 프로브에 유도되었고, 그 후 현미경의 스테이지에 놓인 프리즘에 연결되었다. 소산장 (evanescent field)이 프리즘의 표면에 생성되었으며, 이것은 MB-고정된 실리카 플레이트 유리와 겹쳐(sandwiched)지고, 고정된 MBs의 여기(excite)에 사용되었다. 따라서 생성된 형광 시그널은 대물렌즈(objective)에 의하여 수집되고 ICCD로 유도되었다 .
실리카 플레이트에 고정된 MBs가 그들의 상보적인DNA 표적 분자와 상화작용 하는 경우, 이중-가닥 DNA 듀플렉스가 형성되었고, 이로써 MB에 부착된 형광발색단으로부터 형광 시그널의 증가를 일으킨다. MB 프로브 테스트는 5 nM ~ 600 nM 범위의 상보적 DNA 분자의 다른 농도로 수행되었다. 그 결과는 MB-고정된 플레이트가 나노몰 범위의 표적 DNA 분자의 탐지에 사용될 수 있다는 것을 지시하였다. 비-상보적인 DNA 분자가 사용되는 경우, 형광 시그널의 증가는 없었다. 부가적 실험은 플레이트에 고정된 MB는 하이브리드형성 형성 후 재생될 수 있으며, 이로써 DNA 탐지 및 상호작용 연구에 여러 번 재사용 될 수 있다는 것을 나타내었다.
(C) 나노입자 표면에 고정된 MBs의 제조.
바이오티닐레이트화 된 MB의 설계 및 합성.
나노입자의 표면에 고정된 MBs의 연구를 위하여, 15-뉴클레오타이드 루프 및 5-뉴클레오타이드 암을 갖는 MB가 전술한 방법으로 설계 및 합성되었다. 루프 서열, 5'-ATC AAT ATT TAA CAA-3 (SEQ ID NO : 7)은 DNA 엔코딩 탄저병(anthrax) 치사 인자에 상보적이었다. MB와의 DNA 하이브리드형성 연구를 위하여 4 가지 다른 DNA 표적 서열이 제조되었다. : 5'-TTG TTA AAT ATT GAT-3 (SEQ ID NO : 8);DNA2': 5'-TTA TTA AAT ATT GAT-3' (SEQ ID NO : 9); DNA3' : 5'-TAG TTA TAA ATTGTT-3' (SEQ ID NO : 10) 그리고 DNA4' : 5'-TAG TTA TAA ATT ATT-3' (SEQ ID NO :11). 이 바이오티닐레이트화 된 MB에서 플루오레세인이 형광발색단으로서 이용되었으며 DABCYL이 켄처로서 이용되었다. 전술한 설계에 따라 합성된 MB는 자성을 띤 나노입자 표면의 고정에 사용되었다.
자성을 띤 나노입자 표면상에 MB의 고정.
실리카-코팅된 자성을 띤 나노입자가 전술한 유중수 마이크로에멀젼 방법으로 합성되었다. 마이크로에멀젼은 트리톤 X-100 계면활성제를 사용하여 제조되었다. FeCl2 및 FeCl3가 산화 철 나노입자를 형성하기 위하여 사용되었다. 실리카 층은 EOS을 마이크로에멀젼에 첨가함으로써 형성되었다. MBs는 아비딘-바이오틴 결합을 통하여 자성을 띤 나노입자 표면에 고정되었다. 간단히, 아비딘은 우선 실리카-코팅된 자성을 띤 나노입자를 아비딘 용액 (2 mg/ml in 10 mM 포스페이트 완충제, pH=7.3)에서 14시간 동안 냉장고에서 배양함으로써 나노입자의 표면에 코팅되었다. 아비딘-코팅된 나노입자는 그 후 0.5 ml의 완충제로 3회 세척되었다. 아비딘 층은 코팅된 나노입자를 1% 글루타르알데하이드와 100 mM 포타슘 포스페이트 완충제에서 1시간 동안 실온에서 가교시킴으로써 안정화되었다. 아비딘-코팅된 나노입자는 그 후 0.5 ml의 1 M 트리스-HCl 완충제 (pH=7)로 3회 세척된 후 트리스-HC1 완충제에서 3시간 동안 냉장고에서 배양되었다.
아비딘-코팅된 자성을 띤 나노입자 표면에 MBs를 고정하기 위하여, 나노입자가 1.0 X 10-6 M 바이오티닐레이트화 된 MB 함유 용액으로 12시간 동안 냉장고에서 배양되었다. 각각의 아비딘 분자는 4 바이오틴 결합 부위를 갖는다. 각각의 노출된 바이오틴 그룹이 아비딘 분자에 결합되는 것을 확보하기 위하여, 아비딘은 과량으로 사용되었다. 나노입자는 20 mM 트리스-HCl/5 mM MgC12 완충제 (pH = 8)로 3회 세척되고 표면-접합된 MB (MB-GMNCs)를 갖는 자성을 띤 나노입자는 다음의 사용을 위하여 냉장 보관되었다.
MB 배양 상층 용액, 세척 용액, 그리고 MB-GMNCs의 형광 강도를 비교함으로써 MB 고정 절차의 효율이 조사되었다. 각각의 이들 3 용액에, 6-배 과량의 상보적인 DNA1'가 첨가되었다. DNA1'을 MB에 첨가하는 것은 플루오레세인과 DABCYL 분자 사이의 형광 에너지 전달에 의하여 형광 켄칭(quenching)을 감소시켰다. GMNC 샘플은 상층 또는 세척 용액보다 훨씬 형광성이었으며, 이것은 대부분의 (한 실험에서 92.2%) MB가 GMNC에 접합되었다는 것을 지시한다. 그리고 GMNC에 결합된 MB는 표적 DNA에 결합하는 능력을 보유하였다.
(D) 표적 DNA의 분지 및 수집에 MB-GMNCs 이용.
분리 절차 설계 및 단계.
전술한 바와 같이 제조된 MB-GMNCs를 일부 경우 단백질 존재하에 폴리뉴클레오티드 복합체 혼합물로부터 표적 DNA를 선택적으로 캡쳐할 수 있는 능력이 있는 지에 대해 테스트하였다. 도 6을 참고하면, 분리 절차의 전반적인 설계 및 단계를 도시화하였다. 혼합물에서 DNA와 단백질을 결합시키는 테스트에서 선택된 혼합물에는 소량의 표적 DNA1'과 DNA2', 다량의 DNA3'및 DNA4'(100배 농도에서), BSA, Hb, Lyz와 같은 몇 가지단백질(1000-배 농도)이 포함되어 있다. DNA1'는 MB의 루프 서열에 완전히 상보적인 표적인 반면에 DNA2'는 단일-염기 미스매치된 서열이다.
테스트를 시작하기 위해, MB-GMNCs를 18℃, 30분간 복합체 DNA-단백질 혼합물에 첨가하여, MB-GMNCs에 DNA 표적이 결합되도록 한다. 분리 절차는 3단계로 구성된다. 제 1 단계는 표적 서열(DNA1' 및 DNA2')를 복합체 혼합물로부터 분리 및 회수하는 단계이다. DNA1' 및 DNA2'는 GMNC 표면상에서 MB와 특이적으로 하이브리드되고, 랜덤 DNA 서열 및 단백질은 하이브리드되지 않는다. 혼합물을 자석에 노출하여, 미량의 DNA1' 및 DNA2'를 가지고 있는 GMNCs를 혼합물로부터 수집하여 분리시켰다.
제 2 단계는 DNA2'로부터 DNA1'을 분리하는 단계이다. DNA1'과 DNA2'의 분리는 MBs로 만들어진 듀플렉스의 용융 온도 차이를 이용한 것이다. GMNCs에 20mM 트리스-HCl/5mM MgCl2 완충제 20㎕를 첨가하였다. DNA1' 및 DNA2'는 GMNC 완충제 온도를 15분간 32℃로 상승시켜 분리하였다. 이 온도에서 , DNA2'가 GMNC로부터 완전하게 해리되고, 반면에 DNA1'은 GMNC 표면에 결합되어 있다. 그 다음 용액을 자성에 다시 노출시켜, DNA1'이 결합되어 있는 GMNC를 제거하였다. DNA'2는 상층에 함유되어 있다. 따라서, DNA1' 및 DNA2'는 혼합물로부터 그리고 각각 분리되었다.
분리 절차의 최종 단계는 MB-GMNCs으로부터 DNA1'를 회수하는 것이다. DNA1'-결합된 GMNC에 20mM 트리스-HCl/ 5mM MgCl2 완충제 20㎕를 첨가하였다. 용액의 온도를 52℃로 상승시키고, 15분간 유지시켜, MB-GMNCs로부터 DNA1'을 완전하게 해리시킨다. 그 다음 MB-GMNCs는 자성을 이용하여 용액으로부터 제거하였다.
DNA 분리 및 수집시에 용융 온도 선택.
도 6에서 볼 수 있는 것과 같이 분리 절차의 제 2 단계는 MBs와 표적 NDA 서열간에 형성된 DNA 듀플렉스의 용융 온도에서 차이를 이용하여 근접한 DNA 서열들을 분리하는 단계이다. MB-GMNC 표면에 결합된 한 개 염기 매스매치된 DNA 서열(예를 들면 DNA2')와 상보적인 DNA 서열(예를 들면 DNA1')을 차등 분리하는 적절한 온도를 결정하기 위한 테스트를 실시하였다. MB와 상보적인 서열(DNA1')의 하이브리드 형성이 안정적이나, 한 개 염기 미스매치된 서열(DNA2')와의 하이브리드는 안정하지 않는 온도 범위를 결정하는 것도 포함된다. MB와 동일한 루프 서열을 가지는 선형 DNA 프로브를 이용하여, 상보적인 서열과 한 개 염기 미스매치된 DNA간의 용융 온도 차이가 7℃인 것을 알아내었다. 대조적으로, MB의 루프와 동일한 서열을 이용한 경우에, 차등 온도는 21℃이었다.
GMNC에 고정 유무에 관계없이 MB에 DNA1'과 DNA2' 결합시에 온도의 영향에 대해 다양한 온도 범위에서 추가 조사하였다. 도 8에 그 결과를 나타내었다. 도 8A에서는 GMNCs에 고정된 MBs의 결과를 나타낸 것이다. MB-GMNCs를 포함하는 용액에 6배 과량의 DNA1'(0.6uM, 곡선 1) 또는 DNA2'(0.6gM, 곡선 2)를 첨가하였다. 용액의 형광 강도를 온도에 대한 함수로 나타내었다. 온도를 평형을 이루기 위해 각 온도 간격을 5분으로 유지시키면서 8도에서부터 2℃씩 75도까지 서서히 상승시켰다. 도 8A에서 볼 수 있는 것과 같이, 낮은 온도에서 GMNC상에 DNA1'과 DNA2'-MB 듀플렉스에서는 형광이 잘 나타나는데, 이는 MBs가 하이브리드 반응으로 인하여 개방(선형) 모양을 하고 있다는 것을 암시하는 것이다. 온도가 증가될 때, 두 샘플 모두에서 형광 방사량이 감소되었다. 그러나, 최저 온도에서도 상보적인 DNA(DNA1')의 형광 강도와 비교하였을 때, 한 개-염기 미스매치된 샘플(DNA2')은 상당히 낮은 형광 강도를 가진다. 미스매치된 듀플렉스는 18℃이상에서는 불안정하게 되어, 32℃에서는 완전하게 해리되었다. 대조적으로, DNA1' 듀플렉스는 32℃에서 3%만의 해리되어 여전히 안정하였다. 따라서, 온도를 32℃까지 상승시켜 DNA2'로부터 DNA1'을 분리시키는 것이 가능하였다. 이 온도에서, 단지 3%의 DNA1'가 용액으로 해리되었을 뿐 100% DNA2'를 분리하였다.
GMNC(용액에서)에 접합되지 않은 MB 듀플렉스의 용융 온도 프로파일에 대해서도 검사하였다. 도 8B에서는 용액에서의 자유 MB와 표적 서열간에 하이브리드 형성 결과를 나타낸 것이다. 도 8A와 동일한 조건 및 실험 과정을 이용하였다. DNA1' 용액에는 0.6μM DNA1'와 0.1μM MB(곡선 1)을 함유하고, DNA2' 용액에는 0.6μM DNA2'와 0.1μM MB(곡선 2)를 함유한다. 곡선 3은 용액에 MB만을 포함하는 기준 샘플을 나타낸 것이다. 도 8A와 8B의 결과를 비교하면, GMNC 표면상에 고정된 MB에 의해 만들어진 듀플렉스의 용융 온도 프로파일(도 8A)과 용액상에서 형성된 경우에 프로파일(도 8B)간에 상당한 차이가 있다는 것을 알 수 있었다. DNA1'과 DNA2'와 MB 듀플렉스의 용융 프로파일은 MB가 GMNC표면에 고정된 경우에 더 높은 온도로 옮겨간다는 것을 확실히 알 수 있다. 이는 도 8C에서 추가 설명되는데, 도 8C에서는 두 가지 조건 즉, GMNC표면상에 고정된 MB와 완충 용액내의 MB하에서 MB와 DNA2'간에 형성된 듀플렉스의 용융 프로파일을 직접적으로 비교한 것이다. 도8C에서 볼 수 있는 것과 같이, DBA2'-MB 듀플렉스가 해리되기 시작하는 온도가 용액인 경우에 MBrk 10℃에서 GMNC에 결합된 경우에 18℃로 이동되었다.
(E) DNA-단백질 복합체 혼합물로부터 미량 표적 DNAs를 회수하는데 MB-GMNCs를 이용.
MB-GMNCs의 능력을 추가 조사하기 위해, 단백질/폴리뉴클레오티드 복합체 혼합물로부터 미량 DNAs를 회수하는 효율에 대해 조사하였다. 세가지 상이한 일반 단백질 Hb, BSA, Lyz과 두가지 15-염기 랜덤 올리고뉴클레오타이드(DNA3' 및 DNA4')가 MB-GMNCs의 표적 DNAs(즉, DNA1' 및 DNA2')에 결합하는 능력을 어느 정도 간섭하는 지를 분석하였다. 각 10-7M Hb, BSA, Lyz와 각 10-8M의 DNA3' 및 DNA4' 그리고 각 3fmol(3.13X10-10M)을 포함하는 용액(9.90㎖ 용적)을 준비하고, 0.1㎖ MB-GMNC를 첨가하였다. 상기에서 설명하는 분리 절차에 따라 분리하였다.
DNA1'와 DNA2'는 GMNC표면상에서 특이적으로 MB와 하이브리드를 형성하는 단면에 랜덤 DNA 서열은 형성하지 못하였다. MB-GMCs를 자성 분리후에, DNA1' 및 DNA2'의 형광 시그널을 측정하였다. 도 9에서 볼 수 있는 것과 같이, MB- GMNCs는 올리고뉴클레오티드 및 단백질 복합체 혼합물로부터 표적 즉, DNA1' DNA2'의 미량 예를 들면 3fmol을 캡쳐할 수 있었다. 이와 같은 연구에서, 상보적 DNA1'는 3X10-5과 같은 낮은 농도에서도 수집할 수 있었고, 반면에 한 개 염기 미스매치된 DNA2'는 9X10-5과 같은 낮은 농도에서도 수집할 수 있었다. 통상의 분광광도계만을 이용하여 이 연구를 실행하였다. 좀더 감응성이 좋은 분석 방법(예를 들면, Fang and Tan, Anal. Chem. 71,3101-3105, 1999; Zhang and Tan, Chem. -Eur. J. 6,1087-1092, 2000)을 이용하면, 더 낮은 농도의 표적의 캡쳐도 감지할 수 있을 것이다.
(F) MB-GMNC를 이용한 DNA 표적 캡쳐의 효율.
상보적인 DNAs의 수집 및 분리와 단일 염기-미스매치된 DNA를 수집 및 분리하는데 MB-GMNCs의 효율에 대해 상기에서 설명하는 DNA-단백질 복합체내에서 DNA1'과 DAN2'를 이용하여 추가 조사하였다. 한 테스트 과정에서, 25nM 농도의 DNA1'과 DNA'2 용액을 과량의 MB-GMNCs와 하이브리드 형성시키고, 두 용액의 형광 스펙트럼을 분광 광도계를 통하여 얻었다. 동시에, 25nM DNA1' 및 25nM DNA2' 혼합물을 준비하여, 상기에서 설명하는 절차 및 단계에 따라 DNA1' 및 DNA2'를 분리하였다. DNA1' 및 DNA2'를 수집 및 분리 후에, 이전 분리에 사용된 것과 동일한 농도의 과량 MB-GMNCs를 각각 분리된 DNA1' 및 DNA2' 용액에 첨가하여, 형광을 측정하였다. 분리 및 수집 전후의 DNA1' 또는 DNA2' 양에는 차이가 없었다. 결과에 따르면, 25nM(2.5 x 10-lOM) 농도에서 DNA표적을 이용할 경우 분리 및 수집 효율이 97%이상이었다.
다른 표적 농도에서 수집 방법 효율을 결정하기 위해, 더 낮은 농도의 DNA1' 및 DNA2'(picomolar 범위)를 가진 복합체 샘플을 MB-GMNCs와 테스트하였다. 다음의 표 1에 5가지 반복실험으로부터 얻은 결과를 나타내었다. 각 혼합물에서, 잠재적인 간섭물의 농도는 동일하다. 표적 DNA1' 및 DNA2' 농도가 8.25X10-12M과 같은 낮은 농도에서도 수집 효율은 95%에 근접하거나 이상이었다.
복합체 혼합물로부터 DNA1' 및 DNA2 분리 효율
샘플번호 혼합물에서 표적농도(pM) 혼합물에서 표적농도(pM) 수집효율(%)
DNA1' DNA2' DNA1' DNA2' DNA1' DNA2'
1234 25.012.58.258.25 25.050.08.25100.0 24.411.87.828.56 24.348.58.1598.6 97.694.494.8103.4# 97.296.998.898.6
각 샘플에서, Hb, BSA, Lyz 농도는 1x10-7M이고, DNA3 및 DNA3의 농도는 1x10-8M이다. 표적 DNA1' 및 DNA2'의 농도 범위는 각각 8.25-25x10-12M 및 8.25-100x10-12M이다. #는 측정량이 소량인 관계로 발생되는 에러이다.
G. 혼합물로부터 mRNA 캡쳐에 MB-GMNCs를 사용
분자 표지(beacons) 합성.
제 1 분자 표지(MB1 ; SEQ ID NO : 7)은 상기에서 설명한 것과 같이 15-뉴클레오타이드 루프 및 5-뉴클레오타이드 암(arm)으로 설계하였다. 플루오레세인을 형광발색단으로 이용하고, DABCYL[4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산을 켄처로 이용하였다. 제 2 MB(MB2)는 18 염기 루프 및 5 염기 암(arms)으로 설계하였다. 이 루프 서열은 쥐의 204 뉴클레오티드(nt) γ-악틴 mRNA의 일부에 상보적이다. 분자 표지와 선형 DNA 프로브를 비교하기 위해, MB1의 루프 서열과 동일한 서열을 가지는 15개 염기 선형 DNA를 설계하는데, 형광발색단으로 플루오레세인을 이용하였다. 켄처로는 DABCYL을 이용하여 선형 DNA에 표적을 라벨하였다. MB와 선형 프로브를 가지고 DNA 하이브리드 형성 연구를 위해 몇 가지 다른 표적 DNA 서열을 설계하였다. 표 2에는 모든 DNA 서열을 나타내었다.
DNA 프로브 및 표적 서열
MB1 5'-ATC AAT ATT TAA CAA-3'(SEQ ID NO:7)
표적 DNA1MB1 루프 서열에 완벽하게 상보적 5'-TTG TTA AAT ATT GAT-3'(SEQ ID NO:8)
표적 DNA2MB1 루프 서열에 단일염기 미스매치 5'-TTA TTA AAT ATT GAT-3'(SEQ ID NO:9)
랜덤 DNA3 5'-TAG TTA TAA ATT GTT-3'(SEQ ID NO:10)
랜덤 DNA4 5'-TAG TTA TAA ATT ATT-3'(SEQ ID NO:11)
MB2 5'-TMR(-C6Am)GCA CGT CCA TGCCCA GGA AGG AAC G (Bioton dT)GG(DABCYL)-3'(SEQ ID NO:12)
표적 DNA5MB2 루프 서열에 완벽하게 상보적 5'-TTC CTT CCT GGG CAT GGA-3'(SEQ ID NO:13)
204 nt γ-악틴 mRNA의 염기 815-832(MB2 루프 서열에 상보적) TTC CTT CCT GGG CAT GGA(SEQ ID NO:14)
선형 DNA 프로브 5'-Fluorescein/C ATC AAT ATTTAA CAA-3' (SEQ ID NO:15)
표적 DNA6선형 DNA 프로브에 완벽하게 상보적 5'-TTG TTA AAT ATT GATG/DABCYL-3' (SEQ ID NO:16)
표적 DNA7선형 DNA 프로브에 단일염기 미스매치 5'-TTA TTA AAT ATT GATG/DABCYL-3' (SEQ ID NO:17)
γ 악틴 mRNA 준비.
쥐의 폐 조직으로부터 RNA를 분리하고, cDNA 사이클 키트(Introgen BV)를 이용하여 올리고(dT) 프라이머로 cDNA에 역 전사시켰다. 프라이머 쌍, 5'-GCG CTT CCG GTG TCCAGA-3'(SEQ ID NO : 18)와 5'-GCC AGG GCT GTG ATCTCC-3'(SEQ ID NO : 19)을 PCR 증폭에 사용하였다. 반응은 25회 사이클로 실시하였다. 204bp DNA 단편의 PCR 생성물은 PCR2.1 벡터(TA Cloning Kit, Invitrogen)를 이용하여 클론시켰다. 재조합 플라스미드를 대장균(E. Coli) INVα세포로 형질도입시켰다. DNA Minipreps을 제조하고, BamHI을 이용하여 선형화시켰다. γ-악틴 RNA를 만들기 위해, 1.0㎍ 선형화된 플라스미드 DNA 주형을 T7 전사 반응을 위해 Ambion Megascript에 이용하였다. 정제후에, 204-nt 쥐 γ-악틴 mRNA를 만들었다.
혼합물로부터 소량의 mRNA 캡쳐.
혼합물로부터 mRNA 및 PCR생성물을 수집하는데, MB-GMNCs의 능력을 결정하기 위해, 204-nt 쥐 γ-악틴 mRNA 단편(MB2 루프 서열에 상보적인 염기 782-985, 염기 815-832)를 함유하는 인위적인 혼합물을 준비하였다. 혼합물에 단백질 및 랜덤 DNA 서열은 실시예 5E의 것과 동일하다.
DNA 분리 절차.
다양한 mRNA 농도에 대해 형광 강도를 순수한 MB2 및 mRNA를 이용하여 플롯시켰다. 실온에서 하이브리드형성후에, MB의 형광 강도는 완전하게 상보적인 표적 DNA5를 가지는 MB2에 하이브리드 형성하는 것과 유사한 방식으로 증가되었다. 이 결과는 비록 표적 서열이 MB보다 10배 이상 길더라도 표적 mRNA에 MB가 하이브리드를 형성할 수 있다는 것을 설명한다. 이들 실험 결과에서, mRNA 농도를 매우 낮게 하는 경우에, 표적에 mRNA의 하이브리드 형성 시간이 더 길어진다는 것도 보여준다.
눈금 측정 후에, 다양한 mRNA 농도를 포함하는 혼합물을 MB-GMNC 용액에 첨가하였다. mRNA 농도가 낮은 샘플의 경우에, 60분간의 하이브리드형성 시간으로 모든 mRNA를 탐지할 수 있었다. DNA 분리 연구를 위한 상기 분리 절차 후에 자장을 이용하여 혼합물로부터 MB-GMNC를 분리하였다. mRNA에 MB-GMNC 하이브리드 형성 후에 용액의 형광 강도를 측정하여 수집된 mRNA 양을 조사하였다. 표 3에서는 mRNA의 MB-GMNC 수집 효과를 나타내었다.
혼합물로부터 DNA1 및 DNA2의 분리 효율*
샘플번호 분리전 농도(pM) 분리후 농도(pM) 회수류(%)
DNA1 DNA2 DNA1평균±SD,n=5 DNA2평균±SD,n=5 DNA1(%) DNA2(%)
1 8.25 100.0 8.56±0.28 98.6±1.01 103.4# 98.6
2 12.5 50.0 11.8±0.74 48.5±0.72 94.4 96.9
3 25.0 25.0 24.4±0.45 24.3±0.63 97.6 97.2
4 50.0 12.5 46.9±0.71 11.1±0.57 93.8 88.8
5 8.25 8.25 7.57±0.52 8.15±0.44 91.8 98.8
6 mRNA:10.0pM 9.30±0.73 93.0
7 mRNA:15.0pM 14.7±0.79 98.7
8 mRNA:20.0pM 18.9±0.47 94.5
각 샘플에서, Hb, BSA, Lyz 농도는 1x10-7M이고, DNA3 및 DNA3의 농도는 1x10-8M이다. 표적 DNA1' 및 DNA2'의 농도 범위는 각각 8.25-25x10-12M 및 8.25-100x10-12M이다. #는 측정량이 소량인 관계로 발생되는 에러이다.
H. 세포로부터 mRNA 캡쳐에 MB-GMNC 사용
배양된 HTB-26 세포로부터 156개 염기로된 mRNA 서열을 수집시에 MB-GMNCs를 사용하였다. 유방암 세포주인, HTB-26(American Type Culture Collection에서 구함)를 공급자의 지시에 따라 90-mm 플라스크에서 배양시켰다. 1분간 연속 교반시키면서 세포에 추출/BME 완충액을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포 찌꺼기 균질물을 제거하고, 단백질을 침전시키기 위해, 용해물을 실온에서 10분간 12,000Xg에서 원심분리시켰다. mRNA를 포함하는 상청액을 따라내어 5분간 70℃에서 변성시켰다. MB-GMNCs를 1%β멀캄토에탄올을 포함하는 희석 완충액과 세포 용해물에 혼합하였다. MB-GMNCs는 자장에 두어 용액으로부터 분리해내고, 형광 강도를 바로 측정하였다. mRNA 서열의 18 염기는 MB2 루프 서열에 완전하게 상보적이다. HTB-26 세포내에 동일한 18개 염기를 가지는 다른 mRNA 분자는 없었다.
배양된 세포로부터 mRNA 캡쳐.
세포로부터 mRNA 추출후에, mRNA 분자는 MB-GMNCs를 이용하여 특이적으로 캡쳐시킨다. 세포 용해물질로부터 분리된 MB-GMNCs에서 감지되는 명백한 형광 시그날로 확인할 수 있다(도 10, 곡선 a). 두가지 기준 실험 결과로부터 표적 mRNA와 MB의 하이브리드 형성으로 인하여 형광 시그날이 생성된다는 것을 확인하였다. 한 개 기준은 세포를 용해시키기전에 MB-GMNCs를 첨가하고, 자성을 이용하여 분리하고 세척하여 얻은 것이다. 곡선 b에서 볼 수 있는 것과 같이, 곡선 a와 동일한 조건하에서 분석하였을 때, MB-GMNCs 용액에는 감지되는 형광 시그날이 없었다. 또한, MB2와는 상이한 서열을 가지는 MB를 동일한 조건하에서 HTB-26 세포 용해 물질과 배양하였을 때, MB-GMNCs 용액에서는 형광 시그날이 감지되지 않았다(도 10, 곡선 c).
실시예 6
세균 라벨링
염료-도프된 나노입자를 대장균(E. coli) 균주 0157:H7와 특이적인 항체와 접합시켰다. 이와 같은 항체-접합된 나노입자와 접합되지 않은 나노입자(네가티브 기준)를 대장균(E. coli) 균주 0157:H7를 각각의 용액에서 항원에 항체가 결합할 수 있는 충분한 시간동안 혼합한다. 혼합물을 여과시키고, 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 및 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. SEM 및 형광 현미경 모두에서 접합 안된 나노입자가 아닌 항체-접합된 나노입자가 세균과 연합된 것을 볼 수 있었다.
다른 실시예
상기 설명에는 많은 특정 예를 설명하였으나, 이에 본원 발명을 제한시키고자 함은 아니며, 이들은 단지 적절한 예시로 제공된 것이다. 많은 다양한 변화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 범위는 구체예가 아닌 첨부된 도면 및 이에 법적으로 균등한 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Tan, Weihong Jin, Shouguang Zhao, Xiaojun Dytioco, Rovelyn Drake, Timothy Hilliard, Lisa <120> FUNCTIONALIZED NANOPARTICLES AND METHODS OF USE <130> 5853-252WO <160> 19 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 1 taacaataat cct 13 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 2 tatccttatc aatatt 16 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 3 ggattattgt taaatttaga taaggat 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 4 ggataattgt taaatttaga taaggat 27 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 5 ttccttcctg ggcatgga 18 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Biotin dT <400> 6 gcacgtccat gcccaggaag gaacgtgc 28 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 7 atcaatattt aacaa 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 8 ttgttaaata ttgat 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 9 ttattaaata ttgat 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 10 tagttataaa ttgtt 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 11 tagttataaa ttatt 15 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> carboxy-tetramethyl-rhodamine (TMR)(-C6Am) <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Biotin dT <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> DABCYL <400> 12 gcacgtccat gcccaggaag gaacgtgc 28 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 13 ttccttcctg ggcatgga 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 14 ttccttcctg ggcatgga 18 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Fluorescein <400> 15 catcaatatt taacaa 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> DABCYL <400> 16 ttgttaaata ttgatg 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> DABCYL <400> 17 ttattaaata ttgatg 16 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 18 gcgcttccgg tgtccaga 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially Synthesized Oligonucleotide <400> 19 gccagggctg tgatctcc 18 {WP200530;1}

Claims (33)

  1. 다음의 단계를 포함하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.:
    (a) 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 작용기와 접합된 실리카 표면을 포함하는 나노입자를 제공하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 작용기가 표적 분자에 결합하도록 하는 조건 하에서 나노입자와 표적 분자를 혼합하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 나노입자가 실리카 표면을 둘러싸인 코어를 더욱 포함하는, 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 코어가 금속을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 금속은 자성을 띠는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 코어가 염료를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 염료가 유기 염료인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 염료가 무기 염료인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 염료가 RuII/2, 2'-디피리딜, Eu3+/2, 2'-디피리딜, 로다민 6G, 테트라메틸 로다민, 플루오레세인으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 작용기가 단백질인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 단백질이 항체인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 단백질이 효소인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 단백질이 아비딘인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  13. 제 9항에 있어서, 단백질이 바이오틴인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  14. 제 9항에 있어서, 작용기가 핵산인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 핵산이 DNA인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 핵산이 분자 표지의 형태인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 분자 표지가 형광발색단에 접합된 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 분자 표지가 형광발색단의 켄처에 접합된 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 작용기가 바이오틴-아비딘을 경유하여 실리카 표면에 접합된 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 표적 분자는 세포내에 있는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 표적 분자는 세포 표면상에 있는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 표적 분자는 세포내 인테리어(interior)에 있는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 진핵 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 포유류 세포가 암 세포인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  26. 제 20항에 있어서, 세포가 원핵세포인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 원핵세포가 박테리아인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  28. 제 1항에 있어서, 표적 분자는 액체에 함유된 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  29. 제 1항에 있어서, 표적 분자에 나노입자의 결합을 감지하는 단계(c)가 추가 포함된 인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 표적 분자에 나노입자의 결합은 나노입자의 성질 변화를 관찰함으로써 확인하는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 나노입자의 성질은 빛 방사인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  32. 제 1항에 있어서, 표적 분자는 혼합물에 함유되어 있고, 표적 분자에 결합된 나노입자를 포함하는 복합체를 혼합물로부터 분리시키는 단계 (c)가 추가로 포함된 인 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 복합체로부터 표적 분자를 분리하는 단계 (d)가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 나노입자를 표적 분자에 유도하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100762969B1 (ko) * 2006-10-04 2007-10-04 요업기술원 기능성 실리카 코팅 자성 나노입자를 이용한 고효율의 핵산및 단백질의 선택적 분리정제 방법
KR100830889B1 (ko) * 2006-12-18 2008-05-21 주식회사 케이티 세툭시맵이 결합된 나노 입자 및 이의 제조 방법
KR101464100B1 (ko) * 2014-01-29 2014-11-21 성균관대학교산학협력단 생체 적용 가능한 리포솜-핵산형광 나노 융합체, 이의 응용, 및 이의 제조방법

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