KR100830889B1 - 세툭시맵이 결합된 나노 입자 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자성물질로 이루어진 중심 입자와 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질로 이루어져 있고, 표면에 세툭시맵 항체가 도입되어 있어 대장암 진단에 유용하게 사용될 수 있는 나노 입자 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 이용하여 대장암 조직에 대해서 선택적으로 세포 형광 염색을 할 수 있고, 동시에 자기 공명 영상 방법에 의해서 대장암 조직을 조영할 수 있다. 또한, 선택적으로 인지된 대장암 세포는 세툭시맵에 의해서 성장이 억제되는 효과가 있었고, 동물에 주입된 나노 입자는 외부 자기장에 의해서 특정 생체 부위에 집약시킬 수 있는 효과가 있었다. 따라서, 이러한 기술을 암세포 형광 염색, 조영제 시약, 약물 전달 지지체 분야로 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

대장암, 나노 입자, 세툭시맵, 폴리에틸렌 옥사이드

Description

세툭시맵이 결합된 나노 입자 및 이의 제조 방법{Nanoparticle conjugated with cetuximab and manufacturing method thereof}

도 1은 본 발명에 따른 나노 입자의 투과 전자 현미경 사진.

도 2는 본 발명에 따른 나노 입자의 표면에 아민기 및 친수성 NHS-PEO₁₂-말레이미드 및 세툭시맵을 결합시키는 과정을 나타낸 모식도.

도 3은 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 HT-29 대장암 세포에 처리한 후, 시간에 따른 세포 생존율을 나타낸 그래프.

도 4는 본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 HT-29 대장암 세포에 처리한 후, 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰한 사진.

A: 광학 현미경 사진 B: DAPI로 세포핵을 염색한 사진

C: 붉은색 형광 사진 D: B와 C의 사진을 겹친 사진

E: D의 사진을 확대한 사진

도 5는 세툭시맵이 결합되지 않은 나노 입자를 HT-29 대장암 세포에 처리한 후, 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰한 사진.

A: 광학 현미경 사진

B: DAPI로 세포핵을 염색한 사진

C: A와 B의 사진을 겹친 사진

도 6은 대장암을 유발시킨 마우스에 본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 꼬리 정맥에 주사한 후, 자기 공명 영상(MRI)으로 관찰한 사진.

A: 주입하기 전 B: 주입 30분 후

C: 주입 1시간 후 D: 주입 20시간 후

도 7은 대장암이 유도된 마우스에 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 자기 공명 사진에 의해서 조영이 되지 않은 농도로 투여하고 외부 자기장을 30분 동안 유지 시킨 후, 자기 공명 영상 장치로 관찰한 사진.

A: 외부 자기장을 가하기 이전의 대조군

B: 외부 자기장을 가하고 30분 후

본 발명은 대장암 진단용 나노 입자 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자성물질로 이루어진 중심 입자와 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질로 이루어져 있고, 표면에 세툭시맵 항체가 도입되어 있어 대장암 진단에 유용하게 사용될 수 있는 나노 입자 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 들어 비침습적 검사의 일종인 자기 공명 영상법(Magnetic resonance imaging; MRI)을 이용하여 암조직을 영상화 시키려는 연구가 급격하게 진행되고 있다. 또한, 자기 공명 영상법을 이용하여 특정 질환을 진단하기 위해 사용되는 조직 특이적인 조영제의 개발이 진행되고 있다. 조영제는 특정 질환의 진단을 목적으로 인위적으로 대조도의 차를 만들어 영상으로 나타낼 수 있도록 하기 위해 사용되어지는 약품이다.

자기 공명 영상법에 사용되어온 기존의 조영제로는 상자성(paramagnetic) 제제인 가돌리늄(Gd), 유로피움(Eu), 망간(Mn) 등의 중금속 이온성 유기 금속 화합물이 이용되고 있다. 그러나, 이 물질들은 특정 암조직을 조영하기 위해서 필요한 항체 보다 훨씬 작기 때문에 암조직만 선택적으로 영상화하기엔 어려움이 많았다.

따라서, 이를 해결하기 위하여 금속 이온을 덴드리머(dendrimer), 덱스트란(dextran)과 같은 유기 고분자 물질에 접목하여 이용하려는 초상자성(super-paramagnetic) 제제에 대한 연구도 지속되고 있다. 그러나, 생체 내에서 쉽게 분해되는 유기 고분자를 이용할 경우 녹아 나오는 중금속에 의한 생체 독성의 가능성이 높아 문제점이 제기되어 왔다. 최근에는 철 산화물 나노 입자를 조영제로 응용하기 위한 연구가 진행되고 있는데, 이 또한 중금속에 의한 생체 독성 위험 요소가 존재하고, 암조직의 영상화와 같은 구체적인 방법에 대한 연구는 진행되어 온 바가 없다.

한편, 양자점(quantum dot)을 이용한 암세포의 형광 영상화에 대한 연구 또 한 급속하게 진행 되고 있다. 즉, 양자점 표면에 특정 암세포에 선택적인 특이성을 갖는 항체 또는 펩타이드 종류를 결합시켜 형광 영상화를 수행하려는 시도가 있었다. 그러나, 이는 형광이 생체 내부를 영상화할 수 없기 때문에 생체내 연구(in vivo)에 부적합하고, 최근에는 중금속으로 이뤄진 양자점의 독성문제가 제기되고 있어 실질적인 적용에 대한 부정적인 시각이 매우 높다.

양자점과 동시에 많이 이용되고 있는 산화철 나노 입자는 MRI와 같은 기기를 이용하여 생체내 암조직의 영상화가 가능한 장점이 있다. 그러나, 기존의 산화철 나노 입자의 경우 유기 고분자로 코팅되어 있어 생체내 적용 시 중금속의 노출 위험이 높고, 형광 분석이 불가능해 암조직의 정밀 검사를 실시하는데 매우 복잡하다는 문제점이 있다.

나노 입자를 이용한 생체 적용 연구의 또 다른 분야는 약물 전달 지지체 분야이다. 생체에 약물을 효과적으로 도입해주기 위해서 약물을 고형화된 지지체를 이용하여 생체 주입을 실시하고 있다. 그러나, 특정 생체 부분에 약물을 집약할 수 없기 때문에 특정 부위의 치료를 위해서는 과량의 약물을 투입해야 하고, 이로 인해서 생체 부작용이 발생하게 된다. 이를 극복하기 위해서 예전부터 자성 지지체 물질을 이용하려는 노력이 진행되어 왔다. 외부 자기장에 생체 특정 위치에 지지체 농도를 집약시키려는 연구는 현재에도 활발하게 진행되고 있다.

종래 형광, 자성 나노 입자를 이용한 유방암 세포에 대한 생체외 연구를 실시한 바 있다. 그러나, 이 물질의 경우, 항체를 도입하는 과정이 매우 복잡하고 항체 도입 물질로 사용되는 말레이미드(maleimide)의 연결 부분이 소수성 성질을 가지기 때문에, 적용된 나노 입자의 안정성에 문제가 있었다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 상기 언급된 문제점들을 해결할 수 있으며, 대장암 조직의 생체내(in vitro) 및 생체외(in vivo) 영상화를 위한 조영제로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 대장암 조직에 특이적으로 집약되어 대장암의 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 나노 입자를 제공하는 것이다.

본 발명자는 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 입자 표면에 세툭시맵이 결합된 대장암 진단용 나노 입자를 개발하였고, 이러한 나노 입자가 대장암 조직을 효과적으로 조영할 수 있을 뿐만 아니라, 대장암 조직에만 특이적으로 집약되어 대장암을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 자성물질로 이루어진 중심 입자; 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질; 및 상기 껍질 표면에 NHS-PEO₁₂-말레이미드기에 의해 결합되어 있는 세툭시맵 항체를 포함하는 대장암 진단용 나노 입자를 제공한다.

또한, 본 발명은, 1) 자성물질로 이루어진 중심 입자를 준비하는 단계; 2) 상기 자성 중심 입자 표면에 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질을 형성시키는 단계; 3) 상기 껍질 표면에 PEG-아민기를 도입시키는 단계; 4) NHS-PEO₁₂-말레이미드 화합물을 이용하여 상기 PEG-아민기가 도입된 껍질 표면에 말레이미드기를 도입시키는 단계; 및 5) 상기 말레이미드기가 도입된 껍질 표면에 세툭시맵 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 대장암 진단용 나노 입자의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노 입자를 포함하는 대장암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노 입자를 포함하는 대장암 조직용 염색제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노 입자를 포함하는 대장암 조직 분석용 시약을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노 입자를 포함하는 대장암 조직용 약물 전달 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노 입자를 생체내에 투입한 후, 외부 자기장을 처리하는 단계를 포함하는, 대장암 조직 부위에 나노 입자를 집약시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 대장암 진단용 나노 입자는, 자성물질로 이루어진 중심 입자; 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질; 및 상기 껍질 표면에 NHS-PEO₁₂-말레이미드기에 의해 결합되어 있는 세툭시맵 항체를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 대장암 진단용 나노 입자의 중심은 자성물질로 이루어져 있으며, 공침법(coprecipitation)과 같은 통상적으로 이용되는 입자 제조 방법에 의해 형성될 수 있다. 상기 자성 중심 입자는 코발트, 철, 망간, 아연, 니켈 및 구리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 산화물인 것이 바람직하나, 자성을 나타낼 수 있는 물질이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 대장암 진단용 나노 입자는, 상기 자성물질로 이루어진 중심 표면을 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물로 이루어진 껍질이 둘러싸고 있다.

상기 유기형광물질은 대장암 세포의 형광 영상화를 가능하게 하기 위하여 함유되는 물질로서, RITC(Rhodamine B isothiocyanate) 또는 FITC(fluoresceine isothiocyanate)인 것이 바람직하나, 일반적으로 사용되는 유기형광물질이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 또한, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 로다민 레드-X(Rhodamine Red-X), 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 쿠마린류(Coumarine) 또는 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) 등과 같이 화학적으로 변형된 유기형광물질도 사용될 수 있다.

상기 실리카 화합물은 생체내 투입시 화학적 독성을 최소화하기 위하여 함유되는 물질로서, 테트라에톡시실란, 테트라메톡시실란, 실리케이트나트륨 및 테트라에틸오르소실리케이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 대장암 진단용 나노 입자는, 상기 유기형광물질이 함유된 실리카 화합물로 이루어진 껍질 표면에 NHS-PEO₁₂-말레이미드기에 의해 세툭시맵 항체가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 나노 입자의 껍질 표면과 말레이미드기의 연결부분을 친수성을 가지고 있는 PEO로 적용하였기 때문에 안정성을 높일 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 대장암 진단용 나노 입자는 실리카 화합물로 이루어진 껍질 표면에 세툭시맵(cetuximab) 항체가 도입되어 있다는 점에 특징이 있다. 세툭시맵은 암세포 표면에 발현되어 있는 EGF 리셉터에 선택적으로 결합하여 암세포 성장을 억제시킬 수 있는 항체로서, 본 발명에 따른 나노 입자는 이와 같이 세툭시맵이 결합되어 있기 때문에 대장암에 대한 선택적인 진단뿐만 아니라 대장암 조직의 성장을 효과적으로 억제시킬 수 있다는 이점이 있다.

한편, 본 발명에서는 상기 대장암 진단용 나노 입자를 제조하는 방법을 제공하며, 하기에서 나노 입자의 제조 방법을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 나노 입자 제조 방법에서는, 먼저 통상적인 입자 제조 방법 인 공침법 등에 따라 자성물질로 이루어진 중심 입자를 준비한다. 제조된 중심 입자는 고분자에 첨가하여 상온에서 6~12시간 동안 교반하는 것이 바람직하다. 상기와 같이 고분자에 첨가하면 중심 입자가 안정되는 효과가 있다. 상기에서 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리스티렌 및 폴리에틸이민으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 상기에서 교반 시간이 6시간 미만이면 나노 입자 안정화가 이뤄지지 않아 추후 알코올에 분산시키기 어렵고, 12시간을 초과하면 나노 입자간의 뭉침 현상이 발생하기 때문에 상기 범위의 시간 동안 교반하는 것이 바람직하다.

이후, 상기 준비된 자성 중심 입자 표면에 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질을 형성시키게 된다.

상기 유기형광물질은 이소티오시안 기능기로 특정화된 유기형광물질, 예를 들면 RITC(Rhodamine B isothiocyanate) 또는 FITC(fluoresceine isothiocyanate)인 것이 바람직하나, 일반적으로 사용되는 유기형광물질이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 자성 중심 입자 표면에 유기형광물질이 함유된 실리카 화합물 껍질을 형성시키기 위해서는, 유기형광물질을 실리카 화합물로 처리한 용액과, 실리카 화합물 용액을 0.04:0.3의 몰농도비율로 혼합한 후, 상기 혼합물을 에탄올에 녹인 것을 첨가하여 수행된다.

이후, 상기 실리카 화합물로 이루어진 껍질 표면에 PEG-아민기를 도입시키고, 다시 NHS-PEO₁₂-말레이미드 화합물을 이용하여 상기 PEG-아민기가 도입된 껍질 표면에 말레이미드기를 도입시킨다. 상기 말레이미드기의 도입 단계는 PEG-아민기가 도입된 입자에 NHS-PEO₁₂-말레이미드 화합물을 첨가한 후, 상온에서 3시간 동안 교반하여 수행된다. 상기에서 말레이미드기의 도입 물질로서 12개의 PEO 중간체를 적용했으나, 그 개수에 무관하게 NHS 기능기와 PEO 중간체, 말레이미드 기능기를 포함하는 물질이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다.

이후, 상기 말레이미드기가 도입된 껍질 표면에 세툭시맵 항체를 결합시킨다. 세툭시맵의 결합 단계는 4℃에서 6시간 동안 교반하여 수행된다. 종래에는 항체를 나노 입자에 결합시킬 때 소수성 말레이미드 기능기를 사용하였다. 그러나, 본 발명에서는 세툭시맵 항체를 결합시킬 때 친수성 말레이미드 기능기를 적용하였다는 점에 특징이 있다. 일반적으로 항체 자체는 친수성으로 물에 매우 잘 용해된다. 종래 소수성 말레이미드 기능기가 도입된 나노 입자의 경우 물에 대한 분산성이 떨어져 항체와 나노 입자가 불균일계 반응을 하기 때문에 결합이 용이하지 않고 생성 효율이 크게 저하되었다. 그러나, 본 발명에서와 같이 항체 결합시 친수성 말레이미드를 이용할 경우 균일계 반응을 유도할 수 있어 생성 효율을 높일 수 있다는 이점이 있다.

한편, 본 발명에서는 상기 본 발명에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 대장암 치료용 약학적 조성물은 상기 나노 입자를 직접 사용 할 수도 있으나, 당업계에 공지된 의약품 제조방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체를 첨가하여 가공 및 제조된 물질을 사용할 수 있다.

상기에서 담체의 예로는, 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸 하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 대장암 치료용 약학적 조성물에는 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 대장암 치료용 약학적 조성물은 투여 후, 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 대장암 치료용 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 대장암 치료용 약학적 조성물의 1일 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등과 같은 여러 관련 인자를 고려하여 결정될 수 있다.

한편, 상기 본 발명에 따른 나노 입자는 대장암에 특이적인 항체인 세툭시맵이 결합되어 있으므로, 대장암 조직용 염색제로 유용하게 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 본 발명에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 조직용 염색제를 제공한다.

또한, 상기 본 발명에 따른 나노 입자는 형광분석과 MRI 분석을 동시에 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에서는 상기 본 발명에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 조직 분석용 시약을 제공한다.

또한, 상기 본 발명에 따른 나노 입자는 대장암을 특이적으로 억제할 수 있는 항체인 세툭시맵이 결합되어 있고, 외부 자기장에 의해 국부적 고농도화를 할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 본 발명에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 조직용 약물 전달 지지체를 제공한다.

또한, 상기 본 발명에 따른 나노 입자는 외부 자기장에 의하여 특정 생체 내에 집약될 수 있는 특징을 갖고 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 나노 입자를 생체내에 투입한 후, 외부 자기장을 처리하는 단계를 포함하는, 대장암 조직 부위에 나노 입자를 집약시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 유기형광물질이 함유된 실리카 껍질로 둘러싸여진 나노 입자의 제조

공침법으로 합성된 페라이트 자성 나노 입자 5mg/㎖ 수용액 13.8㎖을 고분자 폴리비닐피롤리돈(PVP) 수용액 250㎖(농도는 25.6g/ℓ)에 첨가하여 상온에서 2시간 동안 고속 교반기를 통해 혼합하였다. 고분자로 안정화된 자성 나노 입자를 원심분리하여 침전을 유도하고, 이를 에탄올 250㎖에 분산시켰다. 여기에, RITC를 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane; APS)으로 처리한 용액과, 테트라에톡시실란(tetraethoxysilane; TEOS) 용액을 0.04:0.3의 몰농도비율로 혼합한 후, 이 혼합물을 에탄올에 녹인 것을 첨가하였다. 이후, NH₄OH를 4.2vol% 첨가하여 자성 나노 입자 표면으로부터 유기형광물질이 함유된 실리카 껍질이 형성되도록 유도하였다. 유기형광물질이 함유된 실리카 껍질로 둘러싸여진 자성 나노 입자를 고속 원심 분리기를 이용하여 20,000rpm에서 20분 동안 원심 분리한 다음, 침전을 에탄올과 물로 세척함으로써 정제하였다.

유기형광물질을 함유하는 실리카 껍질로 둘러싸여진 자성 나노 입자 [SiO₂(RITC)@MNP]의 투과 전자 현미경의 사진을 도 1에 나타내었다.

[실시예 2] 나노 입자 표면에 아민기의 도입

상기 실시예 1의 실리카 껍질로 둘러싸여진 자성 나노 입자[SiO₂(RITC)@MNP] 50mg을 20㎖ 에탄올에 녹이고, 여기에 2-[메톡시(폴리에틸렌옥시)프로필] 트리메톡 시실란 625mg과 3-(트리메톡시실릴)프로필 디에틸렌 트리아민 50mg을 넣어 주었다. 이후, 5vol%의 NH₄OH 용액을 넣어 주고, 4시간 동안 교반하였다. 표면이 PEG/아민기로 처리된 나노 입자[SiO₂(RITC)@MNP-PEG/NH₂]를 20,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 침전을 유도하고, 이를 에탄올로 3번 세척하여 정제시켰다.

[실시예 3] 아민기가 도입된 나노 입자 표면에 말레이미드기의 도입

상기 실시예 2의 PEG와 아민기로 표면 처리된 나노 입자에 친수성 말레이미드기를 도입시키기 위하여, 상기 표면 처리된 나노 입자[SiO₂(RITC)@MNP-PEG/NH₂] 8mg을 20㎖ 디메틸포름아미드(DMF)에 녹였다. 여기에 NHS-PEO₁₂-말레이미드 100mg을 10㎖ DMF에 미리 녹여 놓은 용액을 첨가하고 상온에서 3시간 동안 교반하여 나노 입자 표면에 말레이미드기를 도입시켰다. 말레이미드기가 도입된 나노 입자[SiO₂(RITC)@MNP-PEG/NH-PEO₁₂-Mal]를 시간 동안 상온에서 교반 해주고, 20,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 침전을 유도 한 후, DMF로 3번 세척하여 정제하였다.

[실시예 4] 세툭시맵이 결합된 나노 입자의 제조

세툭시맵 4㎖(농도는 2mg/㎖)에 0.5M EDTA 100㎕을 첨가하고, 24mg의 2-머캡토에틸아민(2-MEA)을 첨가한 후, 37℃에서 90분 동안 반응시킨 용액을 세파덱스 G- 25가 포함되어 있는 PD-10 컬럼을 이용하여 세툭시맵을 정제시켰다. 이 용액을 상기 실시예 3에서 말레이미드기가 표면에 도입된 나노 입자 8mg을 10㎖ PBS 용액에 녹인 것에 넣어주었다. 4℃ 조건에서 6시간 동안 교반하여 세툭시맵과 나노 입자를 결합 시켜주었다. 6시간 후, 20,000rpm에서 20분 동안 원심 분리하여 침전을 유도 하고, PBS 완충용액으로 3번 세척하여 정제하였다.

유기형광물질이 함유된 실리카 화합물로 둘러싸인 자성 나노 입자의 표면에 아민 기능기 및 친수성 말레이미드기, 그리고 세툭시맵 항체를 결합시키는 과정을 도 2에 나타내었다.

[시험예 1] 대장암 세포 성장 억제 실험

본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자에 의한 대장암 세포 성장 억제효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

대장암 세포(HT-29)는 ATCC(American type culture collection)로부터 구입하여 사용하였다. 세포는 96-웰 용기에서 배양시키고, 배양이 끝날 무렵 각 웰에 50㎕의 MTT 용액( 2,3-bis[2-methyloxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)을 인산완충용액[phosphate-buffered saline; PBS(0.2 ㎎/㎖, pH = 7.2)]에 첨가하여 마지막 농도를 0.4㎎/㎖로 하였다. 이를 10분 정도 교반기로 교반시키고, 490nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 세툭시맵이 결합되지 않은 나노 입자를 처리한 대조군과 달리, 본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자는 24시간 만에 대장암 세포의 성장률을 55% 까지 낮추었음을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자가 대장암 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 이용한 대장암 세포의 in vitro 형광 염색 실험

대장암 세포를 넣어둔 4-웰 슬라이드에 4% 포름아미드 500㎕를 넣어 주었다. 이를 15분 정도 유지한 후, PBS 완충용액으로 두 번 세척하였다. 메탄올/아세톤을 1:1의 비율로 섞은 용액을 500㎕ 첨가하고, 상온에서 30분 동안 처리하여 세포를 고정하였다. PBS 완충용액으로 두 번 세척하였다. 1% BSA 단백질이 포함된 PBS 완충 용액을 30분 동안 처리한 후, PBS 완충용액으로 두 번 세척하였다. PBS 완충용액 500㎕를 넣어주고, 상기 실시예 4에서 제조된 세툭시맵이 결합된 나노 입자 0.3mg을 넣어 주었다. 이를 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 4시간 후, PBS 완충용액으로 3번 세척하였고, DAPI 세포핵 염색 시약을 30분 동안 처리한 후, 얇은 유리 슬라이드를 덮어주었다.

세툭시맵이 결합된 나노 입자를 이용하여 세포 염색에 이용되고 있는 모습을 공초점 형광 현미경으로 관찰한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 세툭시맵이 결합된 나노 입자가 대장암 세포의 세포막 부분에 결합하여 붉은색 형광을 나타내는 것을 보여주고 있다(도 4의 C).

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 세툭시맵이 결합되지 않은 나노 입자를 처 리한 대장암 세포에서는 형광을 나타내지 않은 것을 볼 수 있다. 즉, 대장암 세포가 세툭시맵에 의해서 선택성을 갖는 것을 나타낸다.

[시험예 3] 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 대장암이 생성된 마우스 동물 모델에 적용하는 in vivo 실험

본 발명에 따른 자성 나노 입자의 생체내 작용을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 동물은 4주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) 환경에서 키운 ICR 마우스로서, 수컷 12마리를 온도 22± 3℃, 습도 55± 10%, 조명 12L/12D의 동물실 내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일제당, 마우스용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유섭취시켰다.

본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 대장암이 걸린 마우스에게 꼬리 주사를 통해 주입하고, 최초 30분, 1시간, 20시간으로 MRI를 통해 관찰하였다. 대조군으로는 나노 입자를 주입하지 않은 것을 사용하였으며, 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 투입된 세툭시맵이 결합된 나노 입자는 마우스의 대장암 부위에서 검은색 신호로 나타내었다. 이는 30분 이내에 최고 농도로 보여 졌고, 20시간 후에는 모두 배출되는 현상을 보여 주었다.

도 7에서는 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 약 100배 희석하여 주입한 것으로 대조군에서는 나노 입자의 농도가 너무 낮아 조영되지 않았으나(도 7의 A), 외 부 자기장을 가한 결과 30분 만에 대장암 부위가 조영되는 것을 보여주고 있다(도 7의 B). 이는 외부 자기장에 의해서 특정 생체 부위에 나노 입자의 고농도화를 이룰 수 있음을 보여준다.

본 발명에 따른 세툭시맵이 결합된 나노 입자를 이용하여 대장암 조직에 대해서 선택적으로 세포 형광 염색을 할 수 있고, 동시에 자기 공명 영상 방법에 의해서 대장암 조직을 조영할 수 있다. 또한, 선택적으로 인지된 대장암 세포는 세툭시맵에 의해서 성장이 억제되는 효과가 있었고, 동물에 주입된 나노 입자는 외부 자기장에 의해서 특정 생체 부위에 집약시킬 수 있는 효과가 있었다. 따라서, 이러한 기술을 암세포 형광 염색, 조영제 시약, 약물 전달 지지체 분야로 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (14)

1. 자성물질로 이루어진 중심 입자;

   유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질; 및

   상기 껍질 표면에 NHS-PEO₁₂-말레이미드기에 의해 결합되어 있는 세툭시맵 항체

   를 포함하는 대장암 진단용 나노 입자.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 자성 중심 입자는 코발트, 철, 망간, 아연, 니켈 및 구리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 산화물인

   나노 입자.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 유기형광물질은 RITC(Rhodamine B isothiocyanate) 및 FITC(fluoresceine isothiocyanate) 중 어느 하나 이상인

   나노 입자.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 실리카 화합물은 테트라에톡시실란, 테트라메톡시실란, 실리케이트나트륨 및 테트라에틸오르소실리케이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인

   나노 입자.
5. 1) 자성물질로 이루어진 중심 입자를 준비하는 단계;

   2) 상기 자성 중심 입자 표면에 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질을 형성시키는 단계;

   3) 상기 껍질 표면에 PEG-아민기를 도입시키는 단계;

   4) NHS-PEO₁₂-말레이미드 화합물을 이용하여 상기 PEG-아민기가 도입된 껍질 표면에 말레이미드기를 도입시키는 단계; 및

   5) 상기 말레이미드기가 도입된 껍질 표면에 세툭시맵 항체를 결합시키는 단계

   를 포함하는 대장암 진단용 나노 입자의 제조 방법.
6. 제 5 항에 있어서,

   상기 1) 단계에서, 중심 입자를 고분자에 첨가하여 상온에서 6~12시간 동안 교반하는 것을 특징으로 하는

   방법.
7. 제 6 항에 있어서,

   상기 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리스티렌 및 폴리에틸이민으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인

   방법.
8. 제 5 항에 있어서,

   상기 4) 단계는, PEG-아민기가 도입된 입자에 NHS-PEO₁₂-말레이미드 화합물을 첨가한 후, 상온에서 3시간 동안 교반하여 수행되는 것을 특징으로 하는

   방법.
9. 제 5 항에 있어서,

   상기 5) 단계는, 4℃에서 6시간 동안 교반하여 수행되는 것을 특징으로 하는

   방법.
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 치료용 약학적 조성물.
11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 조직용 염색제.
12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 조직 분석용 시약.
13. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자를 포함하는 대장암 조직용 약물 전달 지지체.
14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 나노입자는 생체내 투입된 후, 외부 자기장 처리에 의하여 대장암 조직 부위에 집약되는

    나노입자.

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