JP2015508747A - ｉｎｖｉｖｏ光学イメージング、ｉｎｖｉｖｏ多モード光学−ＭＲＩイメージング、および治療的診断のためのｉｎｓｉｔｕで励起可能な持続的発光ナノ粒子 - Google Patents

Abstract

持続的発光ナノ粒子の使用に基づく多モード光学・磁気共鳴イメージング法。治療適用のためのメソ多孔質持続的発光「コア−シェル」複合体の使用。

Description

発明の背景

本発明の主題は、ヒトまたは動物身体（人体または動物体）への注射後にナノ粒子の持続的発光がｉｎ ｖｉｖｏにおいて励起され、近赤外域での長時間放射線の放出によりリアルタイムでモニタリングされる、光学イメージング法に関する。磁性を付加的に有するナノ粒子を使用すれば、２モード（bimodal）光学イメージング−磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）が可能となる。さらに、これらのナノ粒子は、メソ多孔質シリカ層でコーティングすると、目的分子の積載および放出能を備え、治療的診断法(theranostics)への応用が見出せる。

市場で入手可能な診断に使用されるほとんどの光学系は、プローブの持続的励起を必要とする蛍光現象に基づいている。しかしながら、この励起は、動物組織由来の寄生シグナル、すなわち、検出時に感度の著しい低下の原因となる自家蛍光の根拠である。

国際出願ＷＯ２００７／０４８８５６および出願ＦＲ２９０８８９１には、持続的発光ナノ粒子およびｉｎ ｖｉｖｏ診断薬としてのその使用が記載されている。ナノ粒子の励起は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて注射の前にＵＶ灯下で照射を行うことによって得られる。ひと度動物に注射されると、これらのナノ粒子はその動物の身体で数十分間モニタリングすることができるが、発光シグナルが短命であり、注射後に動物身体でナノ粒子を励起することができないために、６０分を超える観察は実施できない。

Kimら(2004)は、ＺｎＧａ_２Ｏ_４：Ｃｒ^３＋型のナノ粒子の作製およびそれらの光学光ルミネセンス特性を記載しているが、持続的発光特性については報告してない。高解像度テレビ分野での応用が企図される。より最近では、Bessiereら(2011)が、マイクロメーター形態のこの同じ材料が、２５４ｎｍのＵＶで励起可能な持続的発光特性を有することを示した。Panら(2012)は、２〜５μｍの間の結晶径を有する式Ｚｎ_３Ｇａ_２Ｇｅ_２Ｏ_１０ ：Ｃｒ^３＋のガロゲルマニウム酸塩の持続的発光特性を記載しており、太陽光エネルギー蓄積の分野で夜間標識としての、またナノマテリアルが動物身体に注射される前に励起されるLe Masne de Chermontら(2007)により記載されている診断法でのその使用を提案している。

本発明によれば、その励起において動物組織で可能である第一世代の持続的発光ナノ粒子の本質的制限を克服することができる。ＵＶ下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ励起はやはり可能であるが、本発明の光学イメージング法で使用されるナノ粒子は、５５０〜８００ｎｍの間、より詳細には５５０〜６５０ｎｍの間の可視波長域で励起される能力を有する。これらの橙−赤色の光子は、組織の透過ウィンドウに比較的近く、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて動物身体でナノ粒子の持続的発光の励起を可能とするのに十分な透過性であることが分かった。このように、観察に時間的制約がなくなり、これらのナノ粒子は結晶の完全性が維持されている限り位置決定が可能である。さらにその後、非侵襲性光学イメージングによってそれらの分解速度をモニタリングすることもできる。

この新世代の持続的発光ナノ粒子は、自家蛍光が存在しないために、極めて強いシグナル／ノイズ比および絶対的コントラストという利点を持つ。しかしながら、光学イメージングで直面する散乱現象は、ｉｎ ｖｉｖｏで見られる体内でのナノ粒子の不正確な局在をもたらす場合がある。この技術的問題は、別の様式、すなわち、目的器官においてプローブの正確な局在を可能とする磁気共鳴イメージングを加えることによって克服される。

これらのナノマテリアルの構造に常磁性陽イオンを付加すると、最初の持続的発光特性または動物組織で励起されるナノ粒子の能力に影響を与えずに、付加的イメージング様式としてのＭＲＩを提供することが可能である。このナノマテリアルは上記されたものと同じ光学特性を有し、また、ＭＲＩの造影剤（Ｔ２効果、陰性対照）としてのその使用を可能とする目的の磁性も有する。

本発明はまた、目的分子の積載および放出を可能とするメソ多孔質シリカシェル中に持続的発光ナノ粒子を封入する可能性も与える。特に、持続的発光現象によるこの多機能系は、有効成分または細胞傷害性分子の放出領域の限局化を可能とし、それにより体内においてその位置をリアルタイムでモニタリングすることによって薬物の投与により良い制御を提供することができる。

これらのナノ粒子および方法は、医学的イメージング、診断および療法の分野で多くの適用を見出せる。

概要
本発明の主題は、下記の工程：
ａ）ヒトまたは動物身体にナノ粒子を投与する工程、
ｂ）前記ヒトまたは動物身体の全体または一部において５５０〜１０００ｎｍの間の波長下でのｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、および
ｃ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程
を含んでなる、ヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングによる診断方法において光学プローブとして使用するための、持続的発光ナノ粒子に関し、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長の光の下で励起された後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出する。

好ましい実施形態では、本ナノ粒子は、没食子酸塩、アルミン酸塩、インジウム酸塩、およびそれらの混合化合物である、ガロ−ゲルマニウム酸塩、ガロ−アルミン酸塩、ガロ−インジウム酸塩、酸化ガリウム、酸化インジウム、酸化マグネシウム、オキシ硫化亜鉛およびガリウム、オキシセレン化亜鉛およびガリウム、オキシテルル化亜鉛およびガリウムの中から選択されるマトリックスから形成されるナノマテリアルを含んでなり、前記マトリックスは、クロム、ユウロピウム、セリウム、ニッケル、鉄、銅およびコバルトの中から選択される遷移金属またはランタニドでドープされている。

好ましくは、本ナノ粒子は、ナノマテリアルＺｎＧａ_{２（１−ｘ）}Ｃｒ_２ｘＯ_４（ここで、ｘは０．００１〜０．００７５の間である）を含んでなる。より好ましくは、本ナノ粒子は、ナノマテリアルＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４を含んでなる。

好ましくは、本ナノ粒子の投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内または眼窩後方経路(retro-orbital route)により行われる。

好ましくは、本ナノ粒子のサイズは１〜１０^３ｎｍの間である。

好ましい実施形態では、本ナノ粒子は、表面グラフトまたはコーティングされている。

第１の実施形態では、本ナノ粒子は、表面にリガンドがグラフトされている。別の実施形態では、本ナノ粒子は、目的分子の積載および放出を可能とするメソ多孔質シリカ中に封入されている。

本発明のさらなる主題は、下記の工程：
ａ）ヒトまたは動物身体にナノ粒子を投与する工程、
ｂ）前記ヒトまたは動物身体の全体または一部において５５０〜１０００ｎｍの間の波長下でのｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、
ｃ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程、および
ｄ）磁気共鳴イメージングによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程
を含んでなる、ヒトまたは動物身体の２モードｉｎ ｖｉｖｏイメージングを用いた診断方法において光学プローブとして使用するための、持続的発光ナノ粒子であり、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長の光の下で励起された後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出し、かつ、前記ナノ粒子は常磁性を有する。

好ましい実施形態では、本ナノ粒子は、没食子酸塩、アルミン酸塩、インジウム酸塩（indates）、酸化ガリウム、酸化インジウム、酸化マグネシウム、ガロ−ゲルマニウム酸塩、アルミノ−没食子酸塩、オキシ硫化亜鉛およびガリウム、オキシセレン化亜鉛およびガリウム、オキシテルル化亜鉛およびガリウムから選択されるマトリックスから形成されるナノマテリアルを含んでなり、前記マトリックスは、クロム、ユウロピウム、セリウム、ニッケル、鉄、銅およびコバルトの中から選択される遷移金属またはランタニドでドープされており、少なくとも一つの常磁性元素がＣｒ^３＋、Ｍｎ^２＋、Ｇｄ^３＋、Ｆｅ^３＋、およびＮｉ^３＋の中から選択される。

好ましくは、本ナノ粒子は、ナノマテリアルＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４（ここで、ｘは０．００１〜０．００７５の間であり、ｙは０．０１〜０．０８の間である）を含んでなる。より好ましくは、本ナノ粒子は、ナノマテリアルＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４を含んでなる。

好ましくは、本ナノ粒子の投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内または眼窩後方経路により行われる。

好ましくは、本ナノ粒子は、１〜１０^３ｎｍの間のサイズである。

好ましい実施形態では、本ナノ粒子は、表面グラフトまたはコーティングされている。

第１の実施形態では、本ナノ粒子は、表面にリガンドがグラフトされている。別の実施形態では、本ナノ粒子は、目的分子の積載および放出を可能とするメソ多孔質シリカ中に封入されている。

本発明は、ナノマテリアルＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４（ここで、ｘは０．００１〜０．００７５の間であり、ｙは０．０１〜０．０８の間である）を含んでなるナノ粒子に関する。

好ましくは、本ナノ粒子は、ナノマテリアルＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４を含んでなる。

本ナノ粒子の大きさは、好ましくは１〜１０^３ｎｍの間である。

ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４（左）およびＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４（右）化合物のディフラクトグラム。縦軸は、ＺｎＧａ_２Ｏ_４の参照回折ピークを示す（参照コード：００−０３８−１２４０）。 ナノ粒子の可視域励起（橙〜赤）に用いたＬＥＤ灯の発光スペクトル（Ａ）。 化合物ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４の７０５ｎｍでの光ルミネセンスの励起スペクトル（Ｂ）。ＵＶおよび可視光励起の後の持続的発光の発光スペクトル（Ｃ）。ＵＶ励起後またはＬＥＤ装置を用いた場合の持続的発光の減衰の比較（Ｄ）。 材料組成および励起のタイプによる持続的発光の減衰の比較。 ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４のナノ粒子の電子顕微鏡画像（太線は８０ｎｍを表す）。 ＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４ナノ粒子の官能基化スキーム。 上の写真：左は、ヒドロキシル化粒子（負電荷）を注射したマウス。右は、ペグ化粒子（中性）を注射したマウス。下の写真：左は、３つの皮下ＣＴ２６腫瘍を有し、ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４のナノ粒子が注射された（静脈内）マウスの光学画像。右は、橙〜赤光源下で動物に照射を行った後に得られた持続的発光シグナル（図２Ａ参照）、プローブ注射の４時間後。 種々の時点でのステルスナノ粒子の生体分布のｉｎ ｖｉｖｏ画像。マウスにコア直径８０ｎｍのペグ化ナノ粒子２ｍｇを注射した。動物組織で、橙〜赤光源下で２分間粒子の持続的発光を再励起することにより長時間利用できる（図２Ａ参照）。 持続的発光ナノ粒子のタグを付けたＲＡＷマクロファージの懸濁液からの、持続的発光下でのシグナルの取得。 アミノ持続的発光ナノ粒子（左）と、同じ持続的発光粒子のタグを付けたＲＡＷ細胞（ネズミマクロファージ）（右）の、全身注射から３０分後のｉｎ ｖｉｖｏ生体分布の比較。これらの画像は可視域（５５０〜７００ｎｍの間）で持続的発光を励起した後に記録した。 アミノナノ粒子（上の列）と持続的発光ナノ粒子のタグを付けたＲＡＷ細胞（ネズミマクロファージ）（下の列）の全身注射から１５時間後のｅｘ ｖｉｖｏ生体分布。これらの画像は、切断した器官を可視域で２分間励起した後に記録した。肺に大多数の細胞の局在が見られ、図９のｉｎ ｖｉｖｏ生体分布が確認される。 種々の濃度（ｍｇ／ｍＬ）のＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４（左）およびＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４（右）ナノ粒子に関してＴ１コントラスト下で得られたＭＲＩ画像。 種々の濃度（ｍｇ／ｍＬ）のＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４（左）およびＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４（右）ナノ粒子に関してＴ２コントラスト下で得られたＭＲＩ画像。 ＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４のナノ粒子に関してＴ１およびＴ２コントラスト下のＭＲＩ画像から得られた緩和率。 上の写真：ガドリニウムでドープした非官能基化ナノ粒子（２ｍｇのＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４）の、注射２４時間後の生体分布の光学イメージングによるモニタリング。５５０〜７００ｎｍの間で放出するハロゲン光源に２分間マウスを曝した後に、５分間シグナルが取得された。下の写真：粒子を含まない対照マウス（左の写真の赤い矢印）およびガドリニウムでドープした化合物を注射したマウス（右の写真の赤い矢印）の肝臓のＭＲＩスライス（７Ｔ）。ＭＲＩ画像はＴ２^＊強調により得た。肝臓の大部分に均一なネガティブコントラストが見られる（右の写真の暗い領域を、粒子を含まない左の対照肝臓と比較）。 メソ多孔質持続的発光構造の使用の原理。ＰＬＮＰ：「持続的発光ナノ粒子」、 ＭＰＬＮＰ：「メソ多孔質持続的発光ナノ粒子」。 メソ多孔質層（明るい領域）の形成後のＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４（暗い領域）の電子顕微鏡画像。太線は１００ｎｍを表す。 メソ多孔質持続的発光ナノ粒子の間隙率パラメーター（平均直径約１００ｎｍ）。 メソ多孔質持続的発光ナノ粒子におけるＤＯＸ積載後のドキソルビシンの放出動態。 ドキソルビシンを含まないメソ多孔質粒子（ＭＰＬＮＰ）、またはドキソルビシンを積載したメソ多孔質粒子（ＭＰＬＮＰ−Ｄｏｘ）と２つの癌細胞株との接触から２４時間後のＭＴＴ試験。Ｕ８７ＭＧ：ヒト膠芽腫株、ＣＴ２６：ネズミ結腸癌腫株。 ２ｍｇのＭＰＬＮＰの注射から２４時間後の非官能基化メソ多孔質ナノ粒子の生体分布の光学イメージングモニタリング。ＬＥＤ光源２分間マウスを曝した後に５分間シグナルが取得された（発光スペクトルに関しては図２Ａ参照）。

発明の具体的説明

第１の態様によれば、本発明は、下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングを用いた診断方法において光学プローブとして使用するための、５５０〜１０００ｎｍの間の波長の光の下で励起された後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出する持続的発光ナノ粒子に関する：
ａ）ヒトまたは動物身体にナノ粒子を投与する工程、
ｂ）前記ヒトまたは動物身体の全体または一部の、５５０〜１０００ｎｍの間の波長下でのｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、および
ｃ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。

本発明のさらなる主題は、下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法に関する：
ａ）ヒトまたは動物身体にナノ粒子を投与する工程、ここで、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長の光の下で励起された後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出する、
ｂ）前記ヒトまたは動物身体の全体または一部の、５５０〜１０００ｎｍの間の波長下でのｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、および
ｃ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。

本発明はまた、下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法に関する：
ｂ）５５０〜１０００ｎｍの間の波長下でのヒトまたは動物身体の全体または一部のｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、ここで、前記ナノ粒子は前記ヒトまたは動物身体に事前に投与され、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長での光励起の後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出する、および
ｃ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。

本発明の特定の実施形態では、５５０〜１０００ｎｍの間の可視域での励起後の持続的発光と常磁性の両方を有するナノマテリアルの使用により、ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための２つのイメージング様式、すなわち、光学イメージングとＭＲＩの使用が可能となる。

本発明のさらなら主題は、下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体の２モードｉｎ ｖｉｖｏイメージングを用いた診断方法において光学プローブとして使用するための持続的発光ナノ粒子に関し、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長での光励起の後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出し、かつ、前記ナノ粒子は常磁性を有する：
ａ）ヒトまたは動物身体にナノ粒子を投与する工程、
ｂ）５５０〜１０００ｎｍの間の波長下での前記ヒトまたは動物身体の全体または一部のｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、
ｃ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程、および
ｄ）磁気共鳴イメージングによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。

本発明はまた、下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体の２モードｉｎ ｖｉｖｏイメージング法に関する：
ａ）ヒトまたは動物身体にナノ粒子を投与する工程、ここで、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長の光の下で励起された後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出し、かつ、前記ナノ粒子は常磁性を有する、
ｂ）前記ヒトまたは動物身体の全体または一部の、５５０〜１０００ｎｍの間の波長下でのｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、
ｃ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程、および
ｄ）磁気共鳴イメージングによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。

本発明はまた、下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体の２モードｉｎ ｖｉｖｏイメージング法に関する：
ａ）５５０〜１０００ｎｍの間の波長下でのヒトまたは動物身体の全体または一部のｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、ここで、前記ナノ粒子は前記ヒトまたは動物身体に事前に投与され、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長での光励起の後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出し、かつ、前記ナノ粒子は常磁性を有する、
ｂ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程、および
ｃ）磁気共鳴イメージングによって、ｉｎ ｖｉｖｏで前記ヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。

多くのナノマテリアルおよびそれらの光学的特性が、特に持続的発光特性を有するナノマテリアルを含めて、文献に記載されている。

発光は、非熱的励起中に非熱的起源の光子の形態で吸収されたエネルギーの一部を元の状態に復帰させる物質を特徴付けるための一般用語である。これらの化合物の励起は、多くの形態を採り得るエネルギーを供給することによって得られる。紫外域（ＵＶ）、可視域または赤外域（ＩＲ）の波長、Ｘ線、化学反応（化学発光）、酵素反応（生物発光）、電気的励起（エレクトロルミネセンス）または機械的励起（トリボルミネセンス）による励起が上げられるが、このリストは網羅的なものではない。

本発明のナノ粒子は、ヒトまたは動物身体の組織での発光の励起と発光の検出の両方を可能とする波長域でのそれらの持続的発光特性のために選択されたものである。

本発明のナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長での光励起の後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で光子を放出する。好ましくは、本ナノ粒子は、５５０〜８００ｎｍの間、より好ましくは５５０〜６５０ｎｍの間の波長での励起後に光子を放出する。

放出される光子は好ましくは、近赤外域、特に７００ｎｍ域に波長を有する。

本発明のナノ粒子は、少なくとも０．０１秒間光子を放出する。ましくは、本ナノ粒子は、少なくとも１秒間、有利には少なくとも１分間、３０分間、１時間、さらには少なくとも１０時間光子を放出する。これらの持続時間は、その発光強度を励起後の時間の関数としてモニタリングすることによって評価される。持続時間測定値の明確な比較は、同じ検出系を用いて同一の条件下で行わなければならない。「持続的発光ナノマテリアル」という表現は、少なくとも０．０１秒、最大数時間、さらには数日の発光を有するナノマテリアルに対して適用される。

０．０１秒未満光子を放出するナノ粒子は、蛍光に関すると考えられ、持続的発光とは異なるので本発明に含まれない。

本出願において「ナノ粒子」とは、そのサイズが、軸方向の最大寸法が一般に１〜１０００ｎｍの間、より詳しくは１０〜１０００ｎｍの間と定義される粒子を表すものとする。好ましくは、本発明のナノ粒子は、２０ｎｍ〜１０００ｎｍの間、より好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍの間である。

好ましくは、本ナノ粒子は、
・没食子酸塩、アルミン酸塩、インジウム酸塩、
・亜鉛／マグネシウムおよびガリウム／アルミニウム／インジウムのオキシ硫化物、オキシセレン化物およびオキシテルル化物、
・酸化ガリウム、酸化インジウム、酸化マグネシウムおよびそれらの対応する混合酸化物、
・ガロ−ゲルマニウム酸塩、アルミナ−没食子酸塩などの混合化合物、
の中から選択されるマトリックスナノマテリアルから形成される。

好ましくは、没食子酸塩は、Ｚｎ_ｘＭｇ_{（１−ｘ）}Ｇａ_２Ｏ_４（ここで、ｘは０〜１の間である）、ＬｉＧａ_５Ｏ_８およびＬｎ_３Ｇａ_５Ｏ_１２（Ｌｎ＝Ｙ、Ｇｄ、ＬａまたはＬｕ）の中から選択される。

好ましくは、アルミン酸塩は、Ｚｎ_ｘＭｇ_{（１−ｘ）}Ａｌ_２Ｏ_４（ここで、ｘは０〜１の間である）の中から選択される。

好ましくは、インジウム酸塩は、Ｚｎ_ｘＭｇ_{（１−ｘ）}Ｉｎ_２Ｏ_４（ここで、ｘは０〜１の間である）の中から選択される。

好ましくは、酸化物は、Ｇａ_２Ｏ_３、Ｉｎ_２Ｏ_３およびＭｇＯの中から選択される。

好ましくは、ガロ−ゲルマニウム酸塩は、Ｍ_３Ｇａ_２Ｇｅ_４Ｏ_１４（Ｍ＝Ｓｒ、Ｃａ）、Ｚｎ_ｘＧａ_ｙＧｅ_ｚＯ_{（ｘ＋（３ｙ／２）＋２ｚ）}（ここで、ｘ、ｙおよびｚは１〜５の整数である）およびＬａ_３Ｇａ_５ＧｅＯ_１４の中から選択される。

好ましくは、アルミナ−没食子酸塩は、Ｚｎ_ｘＭｇ_{（１−ｘ）}（Ｇａ_１-ｙＡｌ_ｙ）_２Ｏ_４（ここで、ｘは０〜１の間であり、ｙは厳密に０〜１の間であり、これらの２つの値は含まれない）の中から選択される。

他のハイブリッド化合物は、例えば、Ｚｎ_ｘＭｇ_{（１−ｘ）}（Ｇａ_１-ｙＩｎ_ｙ）_２Ｏ_４（ここで、ｘは０〜１の間であり、ｙは厳密に０〜１の間であり、これらの２つの値は含まれない）、Ｌａ_３Ｇａ_５ＳｉＯ_１４およびＬａ_３Ｇａ_５．５Ｎｂ_０．５Ｏ_１４の中から選択される。

これらのマトリックスは、好ましくはクロム、ユウロピウム、セリウム、ニッケル、鉄、銅、およびコバルトの中から選択される遷移金属またはランタニドでドープされている。

本ナノマテリアルはまた、これらの構造の発光特性を改良するためにＬｉ^＋、Ｎａ^＋、およびＡｇ^＋などのコドーパントを含んでなってもよい。

本ナノマテリアルは、他のいずれの好適なコドーパント(co-dopant)を含んでなってもよい。

本ナノ粒子に磁性を付与するために、マトリックスがＣｒ^３＋、Ｍｎ^２＋、Ｇｄ^３＋、Ｆｅ^３＋、およびＮｉ^３＋の中から選択される少なくとも一つの常磁性元素でドープされる。

一つの好ましいナノマテリアルが、ＺｎＧａ_{２（１−ｘ）}Ｃｒ_２ｘＯ_４（ここで、ｘは０．００１〜０．００７５の間である）、より好ましくは、ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４である。

別の好ましいナノマテリアルは、Ｚｎ_３Ｇａ_２Ｇｅ_２Ｏ_１０：０．５％Ｃｒ^３＋である。

２モード光学およびＭＲＩイメージングを可能とするナノマテリアルのうち、一つの好ましいナノマテリアルがＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４（ここで、ｘは０．００１〜０．００７５の間であり、ｙは０．０１〜０．０８の間である）、より好ましくは、ＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４である。

ナノマテリアルのこのリストは非限定的なものであり、どの持続的発光材料が本発明において使用可能であるかを決定することは当業者の及ぶ範囲内である。

本発明はまた、上記のナノ粒子およびドーパントを含んでなるナノ粒子にも関する。

一実施形態では、本発明のナノ粒子は、治療的使用を目的とする。

好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ヒトまたは動物身体におけるｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングの光学プローブまたはマーカーとして使用される。動物身体は好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなどの小哺乳動物である。

本発明のナノ粒子およびイメージング法は、特に、ヒトまたは動物身体の血管網のイメージングに採用される。

ヒトまたは動物身体へのナノ粒子の投与は、任意の好適な技術を用いて行うことができる。好ましくは、投与は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または眼窩後方経路により行う。

本発明では、従来技術とは対照的に、ヒトまたは動物身体に注射する前にナノ粒子の持続的発光を励起する必要がない。

本発明のナノ粒子およびイメージング法は、ヒトまたは動物身体に注射した後に「ｉｎ ｓｉｔｕ」でのナノ粒子の励起に基づく。従って、この励起を経時的に随意に繰り返し、ナノ粒子の完全性に変化が現れるまでヒトまたは動物身体で、真のリアルタイムでのナノ粒子の分布と位置の追跡を行うことが可能となる。

ナノ粒子の励起は、５５０〜１０００ｎｍの間、好ましくは５５０〜８００ｎｍの間、より好ましくは５５０〜６５０ｎｍの間の波長の可視域で行われる。予期しないことに、これらの光子は、組織の透過ウィンドウに比較的近く、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒトまたは動物身体でのナノ粒子の十分な励起を可能とするに十分透過性であることが分かった。さらに、自家蛍光現象が見られないので、シグナル／ノイズ比が最も好都合であり、しかもイメージングの際に得られるコントラストの質が良好である。

従って、この励起は、ヒトまたは動物身体の全体または一部のｉｎ ｖｉｖｏ照射によって行われる。ヒトまたは動物身体は、数分間、例えば発光ダイオードまたはハロゲンに曝す。

それらの持続的発光特性によって、本ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒトまたは動物身体の組織で、好適な光学検出器（例えば、ＩＣＣＤカメラ）を用いた光学イメージングによって検出される。

本ナノ粒子が磁性または常磁性を有する場合には、そのナノ粒子は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）で使用可能である。その場合、本ナノ粒子は造影剤として機能する。次いで、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒトまたは動物身体で、光学イメージングとＭＲＩを組み合わせた２モードイメージングによって本ナノ粒子を検出することが可能となる。

本発明の好ましい実施形態によれば、ナノ粒子励起工程とその後の、光学イメージング下で、さらに場合によりＭＲＩイメージング下でも持続的発光を測定することによるナノ粒子検出工程は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトまたは動物身体の全体または一部において繰り返すことができる。本ナノ粒子の持続的発光が完全または部分的に消光した後に、この発光を再励起し、それにより、この発光の持続時間に関する制約および発光強度の経時的損失を完全に克服することが可能となる。

従って、本発明のナノ粒子およびイメージング法は、ヒトまたは動物身体において、数時間、さらには数日間、ナノ粒子のリアルタイムモニタリングを可能とする。

今後は、注射後に、ｉｎ ｖｉｖｏおよびリアルタイムでヒトまたは動物身体においてナノ粒子の分布と位置を追跡することが可能となるので、上記のことは広大な新たな適用分野を切り開く。

一般に、本発明のナノ粒子は、ナノマテリアルに付加的処置を加えることなく、ヒトまたは動物身体に投与することができる。

特定の実施形態によれば、本ナノ粒子は、例えば、コーティングする、官能基化および／またはカプセル化が可能である。これらの操作は、当業者に公知の通常の技術を用いて行われる。

ヒトまたは動物身体内で循環を促進するためには、ナノ粒子の表面状態を改質できることが重要であり得る。特に、全身注射後のナノ粒子の循環を促進するためにコーティングの手段によって粒子表面のイオン電荷をマスクすることが有利であり得る。

一つの特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、化学分子、ポリマーでコーティングすることにより、生物学的もしくは化学的に着目する物質をグラフトすることにより、かつ／あるいはｉｎ ｖｉｖｏでヒトまたは動物身体において、受容体または生物学的もしくは化学的に着目する物質との結合を可能とするリガンドをグラフトすることによって、官能基化される。

生体受容体または生物学的に着目する物質のリガンドをナノ粒子の表面にグラフトすることにより、ヒトまたは動物身体の器官、組織または特定の細胞にナノ粒子を標的化することができる。このことは、診断および治療の両目的で着目できる。

着目する物質は、例えば、いくつかの細胞受容体に対するその親和性が知られている化学分子であってもよい。それはまた抗体、タンパク質または核酸であってもよい。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドという用語は、数種の形態の癌で過剰発現されるいくつかのインテグリンに対して強い親和性が知られているＲＧＤもしくはＰＨＳＣＮペプチドなどのアミノ酸配列、またはその誘導体、例えば、あるアミノ酸配列を含有する化合物を違いなく表す。同様に、核酸、核配列または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列という用語も、修飾の有無に関わらず、核酸の断片もしくは領域のデザイン(deigning)を可能とし、非天然ヌクレオチドを含んでなるか否かに関わらず、また、可能性として、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡと前記ＤＮＡの転写産物の両方に相当する、ヌクレオチドの正確なシーケンシングを表して違いなく使用される。これらの核酸はそれらの天然環境から単離され、かつ天然物または人工物である。

着目する物質は、有効成分または治療分子であってもよい。

持続的発光ナノ粒子の生体分布を制御し、それらを身体または組織の生物学的または化学的に着目する物質に導くためには、それらの表面を、目的器官の組織に存在し得る物質と結合することができるリガンドをコーティングおよび／またはグラフトすることによって官能基化しなければならない。

コーティング法は当業者に周知である。例えば、コーティングは、リン酸基、カルボン酸基またはチオール基を有する分子との結合によるか、またはシリカ、アミノシランまたは好ましくは、トリエトキシアミノプロピルシランの異種沈殿によって行うことができる。トリエトキシアミノプロピルシランで行われるコーティングは、外側が重合されることなく、単一層を形成するだけであり、それによりナノ粒子の直径の増大を制限するという利点を持つ。

同様に、リガンドグラフト（またはカップリング）法も当業者に周知である。これは一般に、親和性、受動的または強制的吸着を介した共有結合によるカップリングに関する。共有結合によるカップリングの場合、本ナノ粒子は、そのリガンドが持っている別の化学基と反応して共有結合を形成することができる化学基の担体となる。本ナノ粒子の表面に存在することができる化学基の例としては、カルボン酸、アミン、アルデヒドおよびエポキシが挙げられるが、これらに限定されない。また、親和性を介した相互作用を使用することもでき、これは一般に（ポリ）糖鎖／レクチン、ビオチンまたはビオチン化化合物／アビジンまたはストレプトアビジン、受容体／特異的リガンド、抗原またはハプテン／抗体などの対のような高親和性を有する結合対の２つの相手を用いて行われる。

ナノ粒子のグラフトは、リンカーまたはスペーサーとも呼ばれるスペーサーアームを用いて直接的に行うことができる。

受動的または強制的吸着によるカップリングは当業者に公知である。例えば、ビオチン−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用することができる。

コーティングは、リポソーム、リポプレックスまたは他の任意の軟質脂質構造などの非ウイルス性合成ベクター中にナノ粒子を封入することによって得ることができる。

好ましくは、コーティングは、トリエトキシアミノプロピルシランの表面沈殿、ナノ粒子の表面でのモノマー重合またはポリマー吸着によって行われる。

別の好ましい実施形態によれば、ステルス目的で（体内での循環時間を延長するため）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされる。一般に、手順は以下の通りである、まず、ＰＥＧをリガンドとカップリングし、このカップリング産物をナノ粒子にグラフトする。

ナノ粒子のコーティングまたは表面グラフトはまた、粒子の表面のイオン電荷をマスクするという利点も持ち得る。

さらに好ましくは、本発明のナノ粒子は、トリエトキシアミノプロピルシランの表面沈殿とその後のメトキシ−ＰＥＧ_ｘ−ＣＯＯＨ（ｘは０．２〜２０ｋＤａの間である）のグラフトにより官能基化し、生物学的または化学的に着目する物質との結合を可能とする。

さらに、トルエンをジメチルホルムアミドに置き換え、それにより粒子のより良好な分散を可能にすることができる。これらの粒子は、カルボン酸基によって官能基化（アミノ粒子上での二グリコール酸無水物の反応による）することもできるし、３−メルカプトプロピル−トリエトキシシランとの直接反応の後にチオール基によって官能基化することもできる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のグラフトは直接ペプチドカップリングによって行うことができる。また、本ナノ粒子の表面に異なる化学分子（ビオチン、ペプチド）をグラフトすることもできる。

一つの好ましい実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、カルボン酸基、チオール基または遊離アミン基によって官能基化される。

本発明のナノ粒子はまた、ヒトまたは動物身体に注射する前に高分子または細胞にタグを付けるための光学プローブまたはマーカーとして使用することもできる。ナノ粒子のタグが付けられた分子のリアルタイムでのｉｎ ｖｉｖｏ分布は、光学イメージングと場合によりＭＲＩイメージングによってモニタリングされる。

本発明のナノ粒子のタグが付けられたマクロファージのリアルタイムｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングが実施例に記載される。

従って、本発明のナノ粒子は、細胞にタグを付け、それらをヒトまたは動物身体に注射した後にｉｎ ｖｉｖｏで経時的にそれらの位置および分布を追跡するために使用することができる。よって、様々な適用が例えば、細胞療法の分野で、特に、臨床試験において注射した細胞の転帰を追跡するために企図（予測）できる。

他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、文献に記載されている技術に従ってメソ多孔質シリカシェル中に封入することがきる。前記のメソ多孔質シリカケースを有するナノ粒子およびそれらの作製方法は例えば、Kangら(2011)、Kimら(2008)、およびXuら(2011)によって記載されている。

ナノ粒子を取り囲むメソ多孔質シリカは持続的発光特性、または場合によってはそれらの常磁性に影響を及ぼさない。この多孔質層は、生物学的または化学的に着目する物質の積載および放出を可能とする。

この着目する物質は、例えば、有効成分、治療分子または細胞傷害性物質などの化学分子であってよい。それはまたホルモン、タンパク質、核酸であってもよい。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドという用語は、アミノ酸配列、例えばその誘導体に関しては、アミノ酸配列を含有する化合物を違いなく表す。同様に、核酸、核配列または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列という用語も、修飾の有無に関わらず、非天然ヌクレオチドを含んでなっても含まなくてもよく可能性として低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡと前記ＤＮＡまたはＲＮＡの転写産物の両方に相当する核酸の断片もしくは領域の定義を可能とする、ヌクレオチドの正確なシーケンシングを表して違いなく使用される。これらの核酸はそれらの天然環境から単離され、天然物または人工物である。

従って、本ナノ粒子は、診断、療法および治療的診断法において多くの適用を見出せる。

血管イメージングは、例えば、慢性炎症、腫瘍成長または転移の位置決定において血管新生プロセスの証拠を得る目的で着目される。生体分布研究は、標的組織において特定の形態によりベクターとなるまたはならない薬剤の蓄積比を決定するために不可欠である。さらに好ましくは、この診断薬は、網膜の腫瘍、炎症領域のイメージングに意図され、前記領域はおそらく血管過多であるか、または血液脳関門の破断領域である。別の実施形態によれば、診断薬は、例えば脳虚血もしくは心虚血または頭部損傷の場合の血管過多領域のイメージングに意図される。さらなる使用は血管過多領域である炎症または腫瘍領域のｉｎ ｖｉｖｏ検出である。従って、一つの特定の適用は、癌の早期検出である。

別の実施形態によれば、診断薬は、遺伝子療法戦略の一部としてｉｎ ｖｉｖｏでのリポソームまたはナノベクターの生体分布の模倣を可能とする。

一般に、本発明は、特に、生物学、医学および臨床研究分野のために、光学マーカーとＭＲＩ造影剤の同時特性を有する光学プローブまたは多モードプローブとして意図される。実施例では、ヒトまたは動物身体におけるリアルタイムｉｎ ｖｉｖｏ細胞モニタリングのためのこれらの光学プローブの一つの適用を報告する。よって、本ナノ粒子は、いくつかの細胞種の生体分布のリアルタイム追跡のための細胞マーカーとして使用することができる。これらの技術はまた、科学界および医学界で関心が高まっている細胞療法において移植片の治癒の光学的可視化を可能とする。

それらにユニークな持続的発光特性によって、これらのナノ粒子はまた、腫瘍摘出において外科医を助ける術中適用のための分野を切り開く。この厳密な場合では、本ナノ粒子は、代謝およびエンドサイトーシス能を高める腫瘍細胞マーカーとして、数種の癌、特に、乳房および膀胱腫瘍において転移部位および腫瘍部位を指示し、その切除を助けるために使用することができる。

持続的発光ナノ粒子周囲のメソ多孔質層の存在は、この分野を、他の適用、特に治療的診断法、他の機能、さらにはまたは他のイメージング様式へと切り開く。本発明のナノ粒子および方法は、病態の観察／診断および連結処理（治療的診断）を可能とし、または光学イメージングによる治療の有効性のモニタリングを可能とする。

一つの特定の実施形態によれば、本発明の主題は、ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング用に意図される診断薬としてのその使用のための、従前に定義されたようなナノ粒子に関する。

１−ＺｎＧａ _{２（１−ｘ−ｙ）} Ｃｒ _２ｘ Ｇｄ _２ｙ Ｏ _４ （ｘ∈［０．００１、０．００７５］、ｙ∈［０．０１、０．０８］）の合成
ナノ粒子は水熱合成により作製した。所望の組成に適合した所望の割合の硝酸ガリウム、クロム、亜鉛およびガドリニウムの混合物を周囲温度にて振盪下で水に溶かした。この陽イオン溶液に濃アンモニアをｐＨ＝７．５となるまで加えて没食子酸亜鉛の前駆体を沈殿させた。この懸濁液を周囲温度にて振盪下で３時間放置した後、テフロンリアクターに移し、加圧下、１２０℃で２４時間処理を施した。処理後に得られた化合物を水およびエタノールで数回洗浄し、真空乾燥させた。最後に、乾燥した化合物を摩砕して微粉とし、７５０℃で５時間、か焼した（calcine）。

結晶構造Ｘ線回折により確認した。ガドリニウムを含まない化合物ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４とガドリニウムを含む化合物ＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４は没食子酸亜鉛：ＺｎＧａ_２Ｏ_４の構造を有することが図１に見て取ることができる。また、これらの２つの陽イオン（Ｃｒ^３＋およびＧｄ^３＋）の添加が寄生相の形成を引き起こさないということも見て取れる。

得られたナノ粒子の光学特性を図２に示す。６０５ｎｍに焦点を合わせた励起（図２Ａ）は持続的発光シグナルの活性化を可能とし、これは弱いが、７００ｎｍ前後を中心とする発光スペクトル（図２Ｃ）およびＵＶ励起後に得られたものと同様の減衰動態（図２Ｄ）を特徴とすることが見て取れる。化合物ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４の７０５ｎｍでの光ルミネセンスの励起スペクトルが見て取れる（図２Ｂ）。

ガドリニウムの添加は持続的発光の低下をもたらすが、同じタイプの減衰および匹敵する動態の維持を可能とする（図３）。

２−ＺｎＧａ _{２（１−ｘ−ｙ）} Ｃｒ _２ｘ Ｇｄ _２ｙ Ｏ _４ のナノ粒子の単分散懸濁液の抽出
得られたナノ粒子を約１０分間砕いた後、水酸化ナトリウム溶液（５ｍＭ）に取り、表面を水酸化させた。この懸濁液を超音波槽に通した後、振盪下で一晩放置した。最後に、これらのナノ粒子を選択的遠心分離により抽出した。遠心分離パラメーターの厳密な調整により、目的直径の選別が可能となる。直径８０ｎｍのナノ粒子の例を図４に示す。

３−ＺｎＧａ _{２（１−ｘ−ｙ）} Ｃｒ _２ｘ Ｇｄ _２ｙ Ｏ _４ のナノ粒子の官能基化
単分散懸濁液の抽出後、体内でのそれらの循環を促進するため、または生体受容体のリガンドを付加することにより任意選択の標的化を可能とするために、ナノ粒子の表面状態を改質可能であることが重要である。この官能基化は、持続的発光ナノ粒子の表面への一連の化学修飾により可能であり（図５）、注射後にプローブの生体分布の制御を可能とする。

数種の特性決定工程により、官能基化が効果的に行われたことが確認される。電位の測定により、これらの持続的発光ナノ粒子の表面電荷の評価が可能である。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加すれば、表面電荷をマスクすることができ、小動物に全身注射した後のナノ粒子の循環時間を延長することができる。

官能基化工程の詳細およびプロトコール
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）によるナノ粒子の官能基化：
２．５ｍｇ／ｍＬ濃度でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に懸濁しているヒドロキシル化ナノ粒子を超音波槽で５分間分散させた。これにＡＰＴＥＳを５容量％の濃度で加えた。この懸濁液を再び５分間超音波槽内に置いた後、強い振盪下で５時間放置した。これらのナノ粒子を最後にエタノール中で数回洗浄して余分なＡＰＴＥＳを除去した。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるナノ粒子の官能基化：
アミノナノ粒子を２．５ｍｇ／ｍＬ濃度でＤＭＦに溶かした後、超音波槽で５分間分散させた。このナノ粒子の懸濁液に、ＰＥＧ ５ｋＤａ（α−メトキシγ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、２５ｍｇ）の溶液を加えた。この混合物を再び超音波槽で５分間分散させた後、９０℃の強い振盪下に一晩放置した。これらのナノ粒子を最後にＤＭＦで数回洗浄して余分なＡＰＴＥＳを除去した。

４−官能基化または非官能基化ＺｎＧａ _{１．９９５} Ｃｒ _{０．００５} Ｏ _４ のナノ粒子の注射およびＣＴ２６腫瘍を標的とするためのステルスナノ粒子の適用
図６（上の写真）では、負電荷ナノ粒子とその電荷がＰＥＧによりマスクされているものとの間の生体分布に明瞭な違いがあることが見て取れる。この効果は、多くのタイプのナノ粒子に特徴的である。負電荷ナノ粒子は、それらの表面電荷のために、急速なオプソニン化を受け、その後、肝臓マクロファージ（クップファー細胞）により捕捉されるが、これが左の写真（図６の上の写真）に見て取れる。他方、ＰＥＧの添加により表面電荷がマスクされている場合には、この認識プロセスは遅れる。これは図６の右の写真に見て取れる。これらの粒子は体内でより均一に分布し、全身循環に分布する。

皮下ＣＴ２６腫瘍を有するマウスに、ステルスナノ粒子と呼ばれるこれらのペグ化ナノ粒子を静注すると（図６の左下）、罹患組織にプローブが徐々に蓄積することで腫瘍領域の受動的標的化が可能となる。次に、持続的発光シグナルがその動物に移植された腫瘍の明瞭な可視化を可能とする（図６の右下）。

５−動物身体でのナノ粒子の持続的発光の励起
持続的発光ナノ粒子の以前の生成の主な弱点の一つは、それらが動物組織で励起できず、それにより観察が1時間以内に限られるということにある。以下に示す持続的発光シグナルの取得は、ナノ粒子形態のこれらの化合物（ＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４）が、持続的発光シグナルが得られるように動物組織で励起可能であることを示す。この革新をもってすれば、時間の制約を回避し、いつでもこれらのナノ粒子を観察することができる。

この手順として、マウスをケタミン／キシラジン混合物で麻酔し、尾静脈にＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４のナノ粒子を注射した。このマウスをＬＥＤ装置（発光スペクトルに関しては図２Ａ参照）下に２分間置いて持続的発光を励起した後、ＩＣＣＤカメラ（光子計数装置、Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）下に置いた。図７に、持続的発光シグナルが数時間後に粒子の位置決定およびそれらの生体分布のモニタリングを可能とすることが見て取れる。

６−マウスにおけるリアルタイム細胞モニタリングへの適用例
この技術の適用の原型例として、本発明者らはまた、これらの持続的発光ナノ粒子による細胞の標識、および小動物への全身注射後のそれらの細胞の生体分布の追跡の可能性についても報告する。

ＲＡＷ細胞（ネズミマクロファージ）の標識および注射：
細胞の標識は、ＲＡＷ マクロファージ（１０^６／ウェル、６ウェルプレート）をＤＭＥＭ無血清培養培地（１ｍｇ／ｍＬ）中、２ｍＬのナノ粒子懸濁液とともに６時間インキュベートすることによって得られた。インキュベーション後、これらの細胞を培養培地で数回洗浄して余分なナノ粒子を除去し、同じ培地に取り、マウスに注射するために９００ｒｐｍでの遠心分離により濃縮した（３００μＬ）。細胞が効果的に標識されていることは、ＬＥＤ装置で持続的発光を励起することにより確認することができる（図８）。

ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、尾静脈に注射した、無血清培養培地に懸濁させた２ｍｇのアミノナノ粒子の生体分布を、同じ培地に懸濁させたナノ粒子のタグを付けたマクロファージ（１０^６細胞）の生体分布と比較することにより行った。結果を図９に示す。

粒子単独とタグが付けられたマクロファージの間には、生体分布の明瞭な違いが見られる。粒子単独は、上記で示したものと同じ理由で、肝臓で濃縮される。タグが付けられた細胞は肺に結合される。

また、組織での再励起は、器官サンプリング後のｅｘ ｖｉｖｏ定量も可能とする（励起条件は従前のＬＥＤ装置の場合と同様）。得られた発光画像を図１０に示す。

７−多モードイメージングのためのＺｎＧａ _{２（１−ｘ−ｙ）} Ｃｒ _２ｘ Ｇｄ _２ｙ Ｏ _４ の適用例
没食子酸亜鉛構造にガドリニウムを付加しても光学特性の性質は変わらないことはすでに上記で指摘されている。特に、持続的発光現象は、低強度の場合は確かに、材料の励起特性が６００ｎｍを超える場合には維持される（ＬＥＤ装置、図２Ａ）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで緩和時間（Ｔ１およびＴ２）を測定するために使用するナノ粒子は、最初の２パートに記載されるプロトコールに従って作製した。これらのナノ粒子は約８０ｎｍの直径を有する。

図１１および１２（左の写真）では、ガドリニウムでドープされていないナノ粒子は濃度依存的コントラスト効果（円において同じコントラスト）を示さず、対照（ナノ粒子無し）の場合と同様の緩和値を示すことが見て取れる。他方、緩和測定値Ｒ１およびＲ２、ならびに７Ｔ ＭＲＩで得られた画像（図１１、１２の右、そして図１３）は、ガドリニウムの付加に関連するナノ粒子のＴ１およびＴ２効果を示す。この効果は実際にナノ粒子濃度に依存し、濃度が高いほどコントラストが大きい。

ＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４のナノ粒子について計算された緩和率に関して市販の薬剤のＴ１およびＴ２値(Dotarem and Endorem)と比較すると、Ｔ２効果が優勢であると言える（Ｒ２／Ｒ１比＞１の計算に裏付けられる）。

小動物へのｉｎ ｖｉｖｏ適用例
最初の段階で、光学イメージングは静注後に粒子の位置決定を可能とした。注射２４時間後の光学イメージングによれば、肝臓における持続的発光ナノ粒子の蓄積がモニタリングされた（図１４、２ｍｇのＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４、直径８０ｎｍ、注射用に５％グルコース中に懸濁）。Ｔ２^＊コントラストを用いてＭＲＩを取得したところ、肝臓の大部分に均一に分布したナノ粒子の存在が確認できた（粒子を施さなかった対照肝臓との比較）。肝臓におけるこのタイプの拡散したネガティブコントラストは、この器官のマクロファージであるクップファー細胞による捕捉の特徴である。

８−メソ多孔質持続的発光ナノ粒子（ＭＰＬＮＰ）の合成
治療的診断適用のためのメソ多孔質持続的発光ナノ粒子の使用の基礎にある原理を図１５にまとめる。

ＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４を用いた合成例：
メソ多孔質層は、陽イオン性界面活性剤である臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）の存在下でナノ粒子の周囲にテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を凝縮させることによって形成した。

これらのナノ粒子を５ｍＭ水酸化ナトリウム中のＣＴＡＢ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁させた。この混合物を超音波槽で十分に分散させ、４５℃で振盪下に置いた。次に、このナノ粒子懸濁液に、終濃度が１容量％となるようにＴＥＯＳを滴下した（例えば、懸濁液１ｍＬ当たり１０μＬのＴＥＯＳ）。４５℃で３時間の振盪の後、この懸濁液をテフロンリアクターに移し、１００℃にて２４時間、加圧下で熟成させた。最後に、この懸濁液を水およびエタノールで数回洗浄して余分な界面活性剤を除去した。

多孔質構造は、持続的発光ナノ粒子をコーティングするシリカ層から界面活性剤（ＣＴＡＢ）を抽出することによって得た。この抽出はメタノール中ＮａＣｌの溶液（１重量％）中で行った。このメタノールの生理食塩水溶液中にナノ粒子を懸濁させ、３時間振盪下に置いた。抽出後、ナノ粒子をエタノール中で数回洗浄した。この抽出工程を３回繰り返し、総ての界面活性剤が効果的に除去されているようにした。

図１６は、メソ多孔質シリカ層中に没食子酸塩結晶を封入した後に得られたコア−シェル構造の電子顕微鏡画像を示す。この構造のコアにある結晶は、電子透過性が低いので、明確により濃く見え、非晶質シリカ層は、その電子透過性のために画像中で薄い色に見える。

間隙率パラメーターは、７７Ｋでの窒素吸着によって決定した。図１７の結果は、接触比表面積が４００ｍ^２／ｇ化合物であることを示す。孔径は約２ｎｍである。

９−細胞傷害性分子を送達するためのＭＰＬＮＰの適用例
この意図はこの構造を使用して有効成分を投与することであり、従って、本発明者らは数種の癌の臨床治療に使用されるドキソルビシン（Ｄｏｘ）を用いて第１の概念実証を行った。この分子は明らかに４８０ｎｍ前後の光を吸収する。このため、この多孔質構造にＤｏｘを積載した後に４８０ｎｍで吸光度の測定を行った。本発明者らは、Ｄｏｘの量（粒子の単位重量）をメソ多孔質ナノ粒子１ｍｇ当たり１５０μｇで評価した。同じアッセイ技術を用いて、リン酸バッファー中の化合物の放出動態も評価した（図１８）。

細胞傷害性分子を運搬および放出するためにこれらのナノ粒子が使用できるかどうかを評価する目的で、本発明者らは、数種の細胞株（ＣＴ２６およびＵ８７ＭＧ）で、Ｄｏｘを積載したナノ粒子（ＭＰＬＮＰ−Ｄｏｘ）の毒性を非積載ナノ粒子（ＭＰＬＮＰ）の毒性と比較した。

アッセイプロトコール： 細胞を培養し、９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルの密度で入れた。これらの細胞に種々の濃度のナノ粒子を添加してから２４時間後に毒性アッセイ（ＭＴＴ）を行った。

結果を図１９に示す。対照ナノ粒子（非積載）に比べて、ドキソルビシンを積載したナノ粒子では、明確に定義される毒性が見て取れる。

最後に、本発明者らは、これらの持続的発光ナノ粒子にメソ多孔質シリカ層を形成しても、組織での持続的発光の励起を妨げることはないことを証明した。図２０の写真は、ＭＰＬＮＰを注射したマウスにおいて可視域（ＬＥＤ装置、図２Ａ参照）での励起の後に得られた持続的発光シグナルを示す。

参照文献
特許文献
ＷＯ２００７／０４８８５６
ＦＲ２９０８８９１
非特許文献

Claims (19)

1. 下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法：
   ａ）５５０〜１０００ｎｍの間の波長でのヒトまたは動物身体の全体または一部のｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、ここで、前記ナノ粒子は前記ヒトまたは動物身体に事前に投与され、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長での光励起の後に、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出し、かつ前記ナノ粒子は、没食子酸塩、アルミン酸塩、インジウム酸塩、およびそれらの混合化合物である、ガロ−ゲルマニウム酸塩、ガロ−アルミン酸塩、ガロ−インジウム酸塩、酸化ガリウム、酸化インジウム、酸化マグネシウム、オキシ硫化亜鉛およびガリウム、オキシセレン化亜鉛およびガリウム、オキシテルル化亜鉛およびガリウムの中から選択されるマトリックスから形成されるナノマテリアルを含んでなり、前記マトリックスは、クロム、ユウロピウム、セリウム、ニッケル、鉄、銅、およびコバルトから選択される遷移金属またはランタニドでドープされている、ならびに
   ｂ）光学イメージングによりナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。
2. 前記ナノ粒子がナノマテリアルＺｎＧａ_{２（１−ｘ）}Ｃｒ_２ｘＯ_４を含んでなり、ｘは０．００１〜０．００７５の間である、請求項１に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法。
3. 前記ナノ粒子がナノマテリアルＺｎＧａ_{１．９９５}Ｃｒ_{０．００５}Ｏ_４を含んでなる、請求項１または２に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法。
4. 前記ナノ粒子の投与が、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または眼窩後方経路により事前に行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法。
5. 前記ナノ粒子のサイズが１〜１０^３ｎｍの間である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法。
6. 前記ナノ粒子が表面グラフトまたはコーティングされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法。
7. 前記ナノ粒子がリガンドで表面グラフトされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法。
8. 前記ナノ粒子が目的分子の積載および放出を可能とするメソ多孔質シリカ中に封入されている、請求項１〜７いずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法。
9. 下記の工程を含んでなる、ヒトまたは動物身体の２モードｉｎ ｖｉｖｏイメージング法：
   ａ）５５０〜１０００ｎｍの間の波長でのヒトまたは動物身体の全体または一部のｉｎ ｖｉｖｏ照射によりナノ粒子の持続的発光を励起する工程、ここで、前記ナノ粒子は前記ヒトまたは動物身体に事前に投与され、前記ナノ粒子は、５５０〜１０００ｎｍの間の波長での励起光下で、５５０〜１０００ｎｍの間の波長で少なくとも０．０１秒間光子を放出し、前記ナノ粒子は常磁性を有し、かつ前記ナノ粒子は、没食子酸塩、アルミン酸塩、インジウム酸塩、酸化ガリウム、酸化インジウム、酸化マグネシウム、ガロ−ゲルマニウム酸塩、アルミナ−没食子酸塩、オキシ硫化亜鉛およびガリウム、オキシセレン化亜鉛およびガリウム、オキシテルル化亜鉛およびガリウム由来のマトリックスから形成されるナノマテリアルを含んでなり、前記マトリックスは、クロム、ユウロピウム、セリウム、ニッケル、鉄、銅およびコバルトから選択される遷移金属またはランタニドでドープされており、少なくとも一つの常磁性元素がＣｒ^３＋、Ｍｎ^２＋、Ｇｄ^３＋、Ｆｅ^３＋、およびＮｉ^３＋の中から選択され、
   ｂ）光学イメージングを用いてナノ粒子の持続的発光を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程、ならびに
   ｃ）磁気共鳴イメージングによって、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトまたは動物身体の全体または一部においてナノ粒子を検出する工程。
10. 前記ナノ粒子がナノマテリアルＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４を含んでなり、こｘは０．００１〜０．００７５の間であり、ｙは０．０１〜０．０８の間である、請求項９に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ２モードイメージング法。
11. 前記ナノ粒子がナノマテリアルＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４を含んでなる、請求項９または１０に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ２モードイメージング法。
12. 前記ナノ粒子の投与が、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または眼窩後方経路により事前に行われる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ２モードイメージング法。
13. 前記ナノ粒子のサイズが１〜１０^３ｎｍの間である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ２モードイメージング法。
14. 前記ナノ粒子が表面グラフトまたはコーティングされている、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ２モードイメージング法。
15. 前記ナノ粒子にリガンドがグラフトされている、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ２モードイメージング法。
16. 前記ナノ粒子が目的分子の積載および放出を可能とするメソ多孔質シリカ中に封入されている、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のヒトまたは動物身体のｉｎ ｖｉｖｏ２モードイメージング法。
17. 前記ナノマテリアルＺｎＧａ_{２（１−ｘ−ｙ）}Ｃｒ_２ｘＧｄ_２ｙＯ_４を含んでなり、ｘは０．００１〜０．００７５の間であり、ｙは０．０１〜０．０８の間である、ナノ粒子。
18. 前記ナノマテリアルがＺｎＧａ_{１．９５５}Ｃｒ_{０．００５}Ｇｄ_０．０４Ｏ_４である、請求項１７に記載のナノ粒子。
19. サイズが１〜１０^３ｎｍの間である、請求項１７または１８に記載のナノ粒子。