TWI772825B

TWI772825B - 改質之鉻摻雜鎵酸鋅奈米立方體、其之製備方法與用途

Info

Publication number: TWI772825B
Application number: TW109120992A
Authority: TW
Inventors: 葉晨聖; 王柳鈞; 陳正哲; 吳炳慶; 蘇家豪
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2020-06-20
Filing date: 2020-06-20
Publication date: 2022-08-01
Also published as: TW202200755A

Abstract

本文揭示改質之鉻摻雜鎵酸鋅(ZGC)奈米立方體，其特徵在於分別具有經(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)改質的凹面。在X射線或UV激發下，該改質ZGC奈米立方體產生持續至少1.5小時的持久發光(LLL)。本文還揭示製備該改質ZGC奈米立方體的方法；以及使用該改質ZGC奈米立方體作為顯像劑使活個體內關注區域(例如癌症)成像的方法。

Description

改質之鉻摻雜鎵酸鋅奈米立方體、其之製備方法與用途

本揭示內容係關於適用於生物成像的奈米探針。具體而言，本揭示發明係關於改質之鉻摻雜鋅奈米立方體、其製造方法和用途。

體內成像面臨兩個重大挑戰：由於組織自體螢光所致的不良信噪比(signal-to-noise(S/N)ratios)，以及在原位外部激發下有限的組織穿透深度。為了避免組織自體螢光干擾，已經開發出幾種類型的奈米探針(例如Ag₂S、碳奈米管)，可於體內成像時，發射近紅外(NIR)波長來消除組織透明區域(tissue transparency window)的背景噪音。或者，在激發停止後仍保持發光的持久發光(LLL)奈米磷光體可藉由從原位激發來去除組織背景噪音，以改善S/N信號。通常，生物發光信號的壽命一般會在奈秒內完全衰減，因此可在此一生命期短的生物背景值衰減後來收集LLL。LLL奈米磷光體是能夠以俘獲的電子和電洞形式儲存輻射、在載流子重組後緩慢發射光子的材料。

使用奈米探針進行生物成像的另一個問題是，為了克服穿透力不足而選擇不同的外部激發源。因此，大量的工作集中在製造奈米吸光材料，例如可以被NIR-1、-II和-III波長激活的上轉換奈米晶體和半導體量子點。使用鉻摻雜鎵酸鋅的最新研究已經證實，ZnGa₂O₄：Cr³⁺(ZGC)的LLL可被紅光照亮。然而，紅光或甚至是NIR光源仍然苦於組織穿透不足的限制。例如，第一NIR(NIR-I)生物區域(biological window)僅有1mm的穿透力，而位於第二NIR(NIR-II)組織透明區域中的1,064nm顯示出5mm的穿透力。因此，X射線源會是對較深組織成像的最佳選擇。

為了消除組織自體螢光干擾並克服對於原位激發的組織滲透度之限制，受到X射線激發展現出LLL的奈米磷光體對於體內成像相當有前途。然而，很少有生物成像研究使用X射線作為LLL奈米磷光體的激發源。先前的工作大多數集中在持久的發光機制。最近，對於生物成像中的LLL奈米磷光體，ZGC在紅光中的激活已從體外激發轉變為體內激發。ZGC具有立方尖晶石結構，被認為是最具代表性的LLL磷光體之一，可被UV和可見光源激發。X射線輻射(立即或延遲)的放射發光，也已經見於ZGC粉末和奈米尺寸形式。不幸的是，奈米級ZGC通常表現出缺乏明確立方體形狀的聚集或簇狀形態。

因此，在本領域中，對適於較深組織成像的具有持久發光的改良ZGC奈米探針仍有所需求。

下面呈現本揭示內容的簡化摘要，以便向讀者提供基本理解。本摘要並非本揭示內容的廣泛概述，且其不標識本發明的關鍵/重要元素或描繪本發明的範圍。其唯一目的是以簡化形式呈現本文所揭示的一些概念，作為稍後呈現的更詳細說明的序言。

根據本揭示內容的一個態樣，提供一種改質鉻摻雜鎵酸鋅(ZGC)奈米立方體，其特徵在於具有經(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)改質的凹面。

另外或可選地，每個改質ZGC奈米立方體更包含多個聚乙二醇(PEG)分子，它們通過與APTES間所形成的醯胺鍵獨立地連接到APTES。

根據本揭示內容的實施方式，該改質ZGC奈米立方體或聚乙二醇化改質奈米立方體在用一定劑量的X射線激發後可分別產生持續至少1.5小時的持久發光(LLL)，較佳地，該LLL持續至少3小時；更佳地，該LLL持續至少5小時。

根據本揭示內容的第二態樣，提供一種製備改質ZGC奈米立方體的方法。該方法包括以下步驟：(a)使硝酸鋅和硝酸鎵分別與鹼反應，以形成氫氧化鋅和氫氧化鎵；(b)將步驟(a)中分別產生的氫氧化鋅及氫氧化鎵和硝酸鉻與水混合，得到第一混合物；(c)將螯合劑和甲苯加到該第一混合物中，得到第二混合物；(d)將該第二混合物高壓滅菌，以產生ZGC奈米立方體；以及(e)用(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)矽烷化該ZGC奈米立方體，以產生改質ZGC奈米立方體。

適合用於步驟(a)中的鹼的例子包括但不限於氫氧化銨、氫氧化鈉、氫氧化鉀等。

適合用於步驟(c)的螯合劑可為C_16-20脂肪酸、羧化PEG或抗壞血酸。C_16-20脂肪酸的合適例子包括但不限於棕櫚酸、油酸、珠光脂酸(margaric acid)、硬脂酸、十九酸、二十酸、棕櫚油酸、反油酸、異油酸(vaccenic acid)、亞油酸、反亞油酸、α-亞麻酸、硬脂四烯酸、二十烯酸(paullinic acid)、巨頭鯨魚酸(gondoic acid)、蜜胺酸(mead acid)、二高-γ-亞麻酸和花生四烯酸。

根據本揭示內容的實施方式，在步驟(d)中，高壓滅菌是在220℃的溫度下進行3天；在步驟(e)中，矽烷化是在60℃的溫度下進行18小時。

根據本揭示內容的可選擇實施方式，該方法可更包括一個聚乙二醇化該改質ZGC奈米立方體的步驟：在1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)的存在下，使該改質ZGC奈米立方體與胺-PEG-酸反應，從而產生聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體，其中胺-PEG-酸的分子量約3,400。

根據本揭示內容的較佳實施方式，該改質ZGC奈米立方體和聚乙二醇化的改質ZGC奈米立方體在被X射線激發後分別產生持續至少1.5小時的持久發光(LLL)；較佳地，該LLL在被X射線激發後持續至少3小時；更佳地，該LLL在被X射線激發後持續至少5小時。

根據本揭示內容的第二態樣，提供一種對關注區域(area of interest,AOI)成像的方法。該方法包括以下步驟：(a)將足量的本揭示內容的聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體施用至該AOI；以及(b)用一定劑量的X射線照射該AOI，藉此產生該AOI的圖像。

根據本揭示內容的實施方式，在步驟(b)中，該X射線的劑量不超過3Gy。較佳地，該X射線的劑量為約0.5Gy。

根據本揭示內容的實施方式，該AOI為癌症區域。

適合用於以本發明方法成像的癌症的例子包括但不限於骨癌、腦癌、乳癌、結腸癌、宮頸癌、伊文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、食道癌、肝癌、頭頸癌、喉癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非小細胞肺癌、非黑色素瘤皮膚癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、直腸癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌和威爾姆氏瘤(Wilms’ tumor)。

根據本揭示內容的一個較佳實施方式，該癌症是肝癌。

參考以下結合附圖考慮的詳細說明，本揭示內容的許多附帶特徵和優點將更形明白。

本專利或申請文件包含至少一個以彩色執行的附圖。專利局將根據要求及支付必要費用後，提供帶有彩色附圖的本專利或專利申請公開的副本。

根據下面參照附圖閱讀的詳細說明，將更好地理解本說明，附圖中：圖1：ZGC奈米立方體的結構特徵和發光。(A)ZGC奈米立方體的TEM圖像。(B)從單一ZGC奈米立方體獲得的TEM圖像。(C)通過從5°傾斜到30°捕獲的TEM圖像。(D)單一ZGC奈米立方體的電子繞射圖。(E)顯示來自單一ZGC奈米立方體中心的{220}小平面的晶格條紋。(F)顯示{220}和{400}小平面組合的邊上(edge-on)小平面的HRTEM圖像。(G)ZGC奈米立方體的XRD圖譜。(H)被250nm激發的ZGC奈米立方體的發光光譜，為Cr摻雜物濃度的函數。(I)在APTES改質之前和之後，分別在甲苯和水中以TEM對奈米立方體拍攝的不同特徵。

圖2：由汞燈激發的油相和水相ZGC奈米立方體的持久發光性質的比較。(A)在汞燈暴露1分鐘後的持久發光衰減曲線(插圖顯示放大的衰減曲線)和(B)經設定在激發停止後30秒曝光時間的IVIS捕獲的對應持久發光圖像。(C,D)在激發後1分鐘記錄的各個再充電衰減曲線和(E)對應的持久發光圖像。使用雙尾學生t檢驗(two-tailed Student’s t-test)進行統計分析(**p<0.01)。

圖3：由汞燈激發的聚乙二醇化ZGC奈米立方體和聚集奈米粒子的持久發光性質的比較。(A)APTES改質ZGC奈米立方體的TEM圖像。(B)在水溶液中合成的聚集ZGC奈米粒子的TEM圖像。(C)在汞燈暴露1分鐘後的持久發光衰減曲線(插圖顯示聚集奈米粒子的放大衰減曲線)。(D)經設定在激發停止後30秒曝光時間的IVIS捕獲的對應持久發光圖像。使用雙尾學生t檢驗進行統計分析(**p<0.01)。

圖4：X射線激發時的發光行為。(A)在同步加速器輻射源下凹形奈米立方體的X射線激發的放射發光。(B)在使用獸醫用X射線源(1Gy min^-1,160kV,20mA)激發後，ZGC奈米立方體和聚集奈米粒子的X射線激發的放射發光強度，為X射線劑量的函數。(C)在0.5和1Gy的X射線激發後，聚乙二醇化ZGC奈米立方體和聚集奈米粒子的持久發光性質的比較。(D)在X射線激發停止後，經IVIS捕獲的聚乙二醇化ZGC奈米立方體和聚集奈米粒子的對應持久發光圖像。使用雙尾學生t檢驗進行統計分析(**p<0.01)。

圖5：在使用臨床X射線線性加速器激發後，具有聚乙二醇化ZGC奈米立方體的肝癌細胞(HepG2-Red-FLuc)的持久發光。(A)在0.5Gy的X射線照射後記錄的聚乙二醇化ZGC奈米立方體的再充電衰減曲線。(B)經IVIS捕獲的對應再充電衰減圖像。

圖6：在使用臨床X射線線性加速器激發後，對健康小鼠分別靜脈內注射PBS、聚集ZGC奈米粒子和聚乙二醇化ZGC奈米立方體的體內和體外生物發光。(A)在0.5Gy的X射線照射後立即(0分鐘)和10分鐘獲取的體內持久發光成像。(B)在0.5Gy的X射線照射停止後持久發光5小時捕獲的得自對應於(A)的解剖組織的體外成像，以及再充電圖像。

圖7：在使用臨床X射線線性加速器激發後，對荷瘤小鼠靜脈內注射聚乙二醇化ZGC奈米立方體的體內和體外生物發光。(A)在0.5Gy的X射線照射後立即(0分鐘)至180分鐘獲取的體內持久發光成像(紅色箭頭：腫瘤區域；藍色箭頭：脾臟)。(B)在0.5Gy的X射線輻照停止後持久發光4小時捕獲的得自對應於(A)的解剖組織的體外成像，以及再充電圖像。

以下結合附圖提供的詳細說明旨在作為對本發明實施例的描述，而不欲代表可構造或利用本發明實施例的唯一形式。該說明闡述了實施例的功能以及用於構造和操作該實施例的步驟順序。然而，可以通過不同的實施例來實現相同或均等的功能和順序。

1.定義

為了方便起見，在本揭示內容上下文中採用的某些術語都收集在此。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語都具有如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解的相同含義。

術語，「個體」或「患者」在本文係互換使用，並意欲表示可以藉由本發明方法治療的哺乳動物，包括人類物種。「哺乳動物」一詞是指哺乳綱中的所有成員，包括人類、靈長類、家畜和農場動物，例如兔子、豬、綿羊和牛；及動物園、運動或寵物動物；以及囓齒動物，例如小鼠和大鼠。此外，除非明確指出一種性別，否則術語「個體」或「患者」意指男性和女性。因此，術語「個體」或「患者」包括可受益於本發明的任何哺乳動物。「個體」或「患者」的實例包括但不限於人、大鼠、小鼠、豚鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一個較佳實施方式中，所述個體是人。

術語「施用」、「投予」或「給藥」在本文係互換使用，以指稱一種遞送方式，包括但不限於口服、靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、皮下或經皮施用本發明的藥劑(例如，纖連蛋白抑制劑)。

如本文所用，術語「足量(sufficient amount)」是指在一定劑量下且在必要的時間內足以達到關於對個體內關注區域(AOI)成像的期望結果的量。足量可例如以克、毫克、微克或奈克表示；或表示為毫克/公斤體重(毫克/Kg)或奈克/公斤體重(ng/Kg)。或者，足量可以活性組分(例如本揭示內容的改質ZGC奈米立方體)的濃度表示，例如莫耳濃度、質量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、質量分率和混合比。

如本文所用，術語「羧化PEG」是指羧酸官能化的PEG分子，其中在官能化之後，PEG分子在其結構中將包含至少一個羧基。

除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一(a,an)」，及「該(the)」在本文中將涵蓋複數對象。

為了方便起見，在說明書、實施例和所附申請專利範圍中使用的某些術語都收集在此。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的相同含義。

2.改質ZGC奈米立方體

本揭示內容的多個態樣係出自於意外發現，藉由本揭示內容方法製備的改質ZGC奈米立方體，在UV或X射線激發下展現出更強的持久發光(LLL)。此外，本發明的改質ZGC奈米立方體被癌細胞的攝取比被正常健康細胞攝取更為顯著。因此，本發明的改質ZGC奈米立方體可作為一種用來對個體內癌組織進行成像或識別個體內癌組織的試劑。

本揭示內容的第一態樣係關於一種改質鉻摻雜鎵酸鋅(ZGC)奈米立方體，其特徵在於具有經(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)改質的凹面。

根據本揭示內容的實施方式，ZGC奈米立方體表面上被APTES改質使得ZGC奈米立方體具有親水性，從而使改質ZGC奈米立方體能夠被分散在水相中。

另外或可選地，改質ZGC奈米立方體可更包含多個聚乙二醇(PEG)分子，它們通過與APTES間所形成的醯胺鍵獨立地連接到APTES。

根據本揭示內容的實施方式，該改質ZGC奈米立方體在UV或X射線激發下可產生持久發光(LLL)。在一些實施方式中，該改質ZGC奈米立方體係被UV光激發，並產生持續至少0.5小時的LLL，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；較佳是持續至少3小時，例如3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；更佳是持續至少5小時，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時。在其他實施方式中，該改質ZGC奈米立方體係被劑量不超過3Gy的X射線激發，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8及2.9Gy；較佳不超過1.5Gy，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3及1.4Gy；更佳不超過0.8Gy，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6及0.7Gy；並產生持續至少0.5小時的LLL，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；較佳是持續至少3小時，例如3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；更佳是持續至少5小時，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時。根據本揭示內容的一些實施方式，當暴露於5Gy的X射線照射劑量下，未發現紅細胞和血小板有顯著變化。

3.製備改質ZGC奈米立方體的方法

本揭示內容亦包括一種用於製備前述改質ZGC奈米立方體的方法。該方法包括以下步驟：(a)使硝酸鋅和硝酸鎵分別與鹼反應，由此形成氫氧化鋅和氫氧化鎵；(b)將步驟(a)中分別產生的氫氧化鋅及氫氧化鎵和硝酸鉻與水混合，得到第一混合物；(c)將螯合劑和甲苯加到該第一混合物中，得到第二混合物；(d)將該第二混合物高壓滅菌以產生ZGC奈米立方體；以及(e)用(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)矽烷化該ZGC奈米立方體，以產生改質ZGC奈米立方體。

適合用於步驟(c)中的螯合劑較佳係包含能夠與金屬離子結合的官能基(例如-COOH或-OH)。適合用於步驟(c)中的螯合劑的例子可為C_16-20 脂肪酸、羧化PEG或抗壞血酸。C_16-20脂肪酸的合適例子包括但不限於棕櫚酸、油酸、珠光脂酸、硬脂酸、十九酸、二十酸、棕櫚油酸、反油酸、異油酸、亞油酸、反亞油酸、α-亞麻酸、硬脂四烯酸、二十烯酸、巨頭鯨魚酸、蜜胺酸、二高-γ-亞麻酸和花生四烯酸。較佳地，用於步驟(c)中的螯合劑為油酸。

根據本揭示內容的實施方式，在步驟(d)中，高壓滅菌是在220℃的溫度下進行至少72小時，藉此得到直徑約30nm且具有明確凹立方型態的ZGC奈米立方體。在高壓滅菌僅持續12小時的情況下，會形成球狀的ZGC粒子；在高壓滅菌持續48小時的情況下，則會形成無明確邊緣的非立方體形狀。球狀的ZGC粒子和無明確邊緣的ZGC奈米立方體都由於表面缺陷而容易聚結或聚集(aggregate)，因此對光學性質產生負面影響(即降低的LLL強度或期間)。

為了使步驟(d)中所產生的ZGC奈米立方體適合生物應用，藉由在60℃的溫度下與APTES反應18小時，使每個ZGC奈米立方體的表面矽烷化(即步驟(e))。表面經APTES改質的ZGC奈米立方體能夠被分散在水中。

另外地或可選地，該方法可更包括一個聚乙二醇化該改質ZGC奈米立方體的步驟(即步驟(f))。為此，使步驟(e)中所產生的ZGC奈米立方體在1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)的存在下與胺-PEG-酸反應，從而產生聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體。較佳地，該步驟(f)中所使用的胺-PEG-酸的分子量約3,400。

根據本揭示內容的較佳實施方式，該步驟(e)中所產生的改質ZGC奈米立方體或步驟(f)中所產生的聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體在X射線或UV激發下分別產生持續至少0.5小時的持久發光(LLL)。在一些實施方式中，該步驟(e)中所產生的改質ZGC奈米立方體或步驟(f)中所產生的聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體係被UV光激發，並產生持續至少0.5小時的LLL，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；較佳是持續至少3小時，例如3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；更佳是持續至少5小時，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時。在其他實施方式中，該步驟(e)中所產生的改質ZGC奈米立方體或步驟(f)中所產生的聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體係被劑量不超過3Gy的X射線激發，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8及2.9Gy；較佳不超過1.5Gy，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3及1.4Gy；更佳不超過0.8Gy，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6及0.7Gy；並產生持續至少0.5小時的LLL，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；較佳是持續至少3小時，例如3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時；更佳是持續至少5小時，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0小時。

4.本發明改質ZGC奈米立方體的用途

本揭示內容亦包括一種通過使用本發明改質ZGC奈米立方體對個體內一關注區域(AOI)成像的方法。該方法包括以下步驟：(a)將足量的本揭示內容的聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體施用至該AOI；以及(b)用一定劑量的X射線照射該AOI，藉此產生該AOI的圖像。

根據本揭示內容的實施方式，該AOI係用劑量不超過3Gy的X射線照射。較佳地，該X射線的劑量為約0.5Gy。

較佳地，該AOI為癌症。適合於以本發明方法成像的癌症的例子包括但不限於骨癌、腦癌、乳癌、結腸癌、宮頸癌、伊文氏肉瘤、食道癌、肝癌、頭頸癌、喉癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非小細胞肺癌、非黑色素瘤皮膚癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、直腸癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌和威爾姆氏瘤。

根據本揭示內容的一個較佳實施方式，該癌症是肝癌。

現在將參考以下實施方式更具體地說明本發明，所述實施方式是出於說明而非限制的目的所提供。儘管它們通常是可能使用的那些，但是可以替代地使用本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他過程、方法或技術。

實施例

材料和方法

製備ZnGa ₂ O ₄ ：Cr(ZGC)凹形奈米立方體

ZGC凹形奈米立方體係通過溶劑熱法合成。首先製備Zn(OH)₂和Ga(OH)₃作為前驅物，其中將1毫升和1.5毫升氫氧化銨分別添加至Zn(NO₃)₂和Ga(NO₃)₃溶液中，然後攪拌5分鐘，直到形成凝膠狀沉澱物，將其用去離子水洗滌三遍。接下來，將Zn(OH)₂(9.9毫克)、Ga(OH)₃(24毫克)和Cr(NO₃)₃(0.4毫克)添加到10毫升去離子水中，並在室溫下攪拌10分鐘。將油酸(1毫升)和甲苯(4.5毫升)加入混合物中，隨後攪拌1小時。然後將混合物密封在襯有鐵氟龍的不銹鋼高壓釜中，並在220℃的預熱烘箱中保持三天。藉由離心收集ZGC奈米立方體，並用甲苯洗滌3次。ZGC係分散在甲苯中。

製備聚集的ZGC奈米粒子

根據先前描述的程序(Wang等人，J.Am.Chem.Soc.2015,137,5304)合成分散在水中的聚集奈米粒子。簡言之，將氫氧化銨添加到含有Ga(NO₃)₃、Zn(NO₃)₂和Cr(NO₃)₃的混合物中，然後劇烈攪拌1小時。然後將溶液轉移到高壓釜中，並在220℃的烘箱中放置10小時。收集聚結的ZGC奈米粒子，並用去離子水洗滌。

製備APTES改質ZGC凹形奈米立方體

在表面改質後，獲得APTES矽烷化的ZGC。首先，將ZGC(1毫升，300ppm)的甲苯溶液與乙醇(7毫升)混合，然後注入(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)(200微升)。將反應保持在60℃下18小時。藉離心收集經APTES改質的ZGC，並用乙醇洗滌3次。

聚乙二醇化ZGC凹形奈米立方體

將雜雙功能胺-PEG-酸(NH₂-PEG-COOH,MW：3400)用於ZGC奈米立方體的聚乙二醇化。為合成聚乙二醇化ZGC奈米立方體，將具有NH₂基團的APTES改質ZGC奈米立方體(300ppm)與COOH-PEG-NH₂(1.36毫克)在乙醇(5毫升)的混合。將混合物攪拌10分鐘。隨後將EDC(1毫克)加到該溶劑中並攪拌30分鐘。然後加入溶解在去離子水中的NHS(1毫克)，以在APTES改質ZGC與COOH-PEG-NH₂之間形成穩定的醯胺鍵。將反應在室溫攪拌4小時。將獲得的聚乙二醇化ZGC用乙醇洗滌數次，並離心以除去未被接枝到ZGC上的過量PEG。所得的聚乙二醇化ZGC奈米立方體具有向外的-NH₂。

汞燈激發的持續發光性質

將ZGC(200ppm)放入黑色的96孔盤中，並用功率密度0.5w cm^-2的汞燈照射該ZGC奈米立方體1分鐘，然後讓其靜置60秒，然後再進行IVIS成像以監控持續發光。該IVIS曝光時間固定為30秒，並使用濾光片收集700nm處的發射。

同步輻射X射線激發的放射性發光

同步輻射X射線激發的放射性發光(SRXRL)係以15KeV單色光束在台灣光子源(Taiwan Photon Source,TPS)的TPS 09A beamLine進行。TPS是一種以400mA電流運作的3GeV同步加速器環。TPS 09A beamLine的X射線源是一種真空聚頻磁鐵(in-vacuum undulator)(IU22)。單色X射線係由光束尺寸500 x 500μm²(H xV)的雙晶Si(111)單色儀在樣品位置處產生。通量為10¹³，約為50.4Gy sec^-1。SRXRL還以來自台灣光源(Taiwan Light Source,TLS)的BL01C2 beamLine使用15KeV單色X射線執行。X射線激發的放射性發光(XRL)測量是在透明膠帶上的0.5毫米厚的粉末樣品上進行。對於兩個實驗，通過光纖收集光，並使用配備有Syncerity CCD相機的HORIBA iHR550成像光譜儀進行測量。用螢光燈根據Hg，546、577和579nm的發射線對光譜儀進行校準。測量使用光柵1200mm^-1。

體外X射線誘導的持續發光性質。

在黑色的96孔盤中製備ZGC(200ppm)。對於X射線激發的持續發光，使用獸醫用X射線源以不同時間(1Gy min^-1,160kV,20mA)對ZGC奈米立方體進行照光。在X射線曝光後，讓樣品靜置1分鐘，然後進行IVIS 成像以監測持續發光。將IVIS曝光時間固定在30秒，用過濾器收集700nm處的發射。

使用細胞計數套組-8(CCK-8)檢測X射線照射的細胞活力

在96孔盤中培養肝細胞癌細胞株(HepG2-Red-FLuc細胞)，每孔5000個細胞。將該盤在潮濕培養箱中於37℃、5%CO₂下預孵育24小時。使用6MV Varian-21EX線性加速器以15×15cm的照射場進行X射線照射。輻射劑量為0至3Gy。然後將10μl的CCK-8溶液添加到每個孔中，並將該盤培養4小時，然後使用微量盤檢測儀(microplate reader(MULTISKAN FC,Thermo Scientific))測量450nm處的吸光度。

聚乙二醇化ZGC奈米立方體和聚集ZGC奈米粒子的細胞成像

在有隔間的硼矽酸鹽蓋玻片中培養HepG2-Red-FLuc細胞，每孔20,000個細胞，並在潮濕培養箱中於37℃、5%CO₂下孵育24小時。在用20ppm ZGC或聚集奈米粒子處理6小時後，將剩餘的奈米粒子用PBS沖洗掉，然後加入新鮮的培養基。使用6MV Varian-21EX線性加速器以0.5Gy的劑量以10×10cm的照射場進行照射。用螢光顯微鏡(Cell R,Olympus)獲取活細胞圖像。

X射線照射對動物的安全影響

C57BL/6小鼠(雄性，8-12週大)係購自國家實驗研究院國家實驗動物中心。使用6MV Varian-21EX線性加速器以範圍從0至5Gy的劑量對健康小鼠進行全身照射。在2週後，處死小鼠收集多個器官、外周血樣品和骨髓細胞用於進一步分析。藉免疫組織化學測定對多個器官的細胞損傷。使用血液分析儀分析白細胞、紅細胞和血小板的外周血細胞計數。通過流式細胞術分析來自股骨和脛骨的骨髓細胞的造血幹細胞數量。

流式細胞術分析

收集接受過X射線照射的小鼠的股骨和脛骨的骨髓細胞，以測定造血幹細胞c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-(KSL)和SLAM⁺ KSL細胞的數量。將細胞用PE Sca-1、PerCP-Cy5.5譜系抗體(BD Biosciences)、PE-Cy7 CD117(c-Kit)、FITC CD48和APC CD150(BioLegend)染色30分鐘。在LSR II流式細胞儀(BD Biosciences)上分析染色的細胞，並使用FlowJo軟體進行數據分析。

聚乙二醇化ZGC奈米粒子和聚集ZGC奈米粒子在健康小鼠中的X射線激發的放射發光

通過尾靜脈向BALB/c和NOD/SCID裸鼠注射2毫克/小鼠的聚乙二醇化ZGC奈米立方體或聚集ZGC奈米粒子，而對照組則被投予PBS。使用6MV Varian-21EX線性加速器以0.5Gy對小鼠進行全身照射。用IVIS Spectrum(PerkinElmer)在不同時間點以生物發光模式獲取活小鼠圖像。注射後5小時將小鼠犧牲，以獲取離體器官的體外圖像。使用Living Image軟體進行數據分析。

用於體內成像的肝細胞癌動物模型

體內研究是在NOD/SCID裸鼠(雄性，8-12週大)中進行。將再懸浮於100微升磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的2×10⁶個HepG2-Red-Fluc細胞以手術方式通過右脅腹切口植入右肝葉或中線腹部切口植入左肝葉。小鼠在植入後14天進行生物發光成像並記錄生物發光通量，以D-螢光素注射(Caliper Life Sciences)評估腫瘤生長，並以生物發光模式(發射波長560nm)接受體內成像(IVIS,PerkinElmer,Waltham，MA)。將代表光子計數的空間分佈的偽彩色圖像投影到攝影圖像上。

聚乙二醇化ZGC奈米立方體在肝細胞癌動物模式中的X射線激發的放射發光

經由尾靜脈向荷瘤裸鼠注射2毫克/小鼠的聚乙二醇化ZGC奈米立方體，而對照組則被投予PBS。使用6MV Varian-21EX線性加速器以0.5Gy對小鼠進行全身照射。通過IVIS Spectrum(PerkinElmer)在不同時間點以生物發光模式獲取活小鼠圖像。注射後4小時處死小鼠以獲取離體器官和腫瘤組織的體外圖像。使用Living Image軟體進行數據分析。

統計分析。 使用雙尾學生t檢驗進行小組比較。p<0.05被認為是顯著的。

實施例1 本發明ZGC奈米立方體的特性分析

1.1 ZGC凹形奈米立方體

根據材料「和方法」章節中所敘述的程序製備ZGC凹形奈米立方體。對由此產生的ZGC奈米立方體進行圖像和X射線分析，結果示於圖1。

圖1A中的透射電子顯微鏡(TEM)照片顯示，分散在甲苯中的ZGC奈米立方體表現出均勻的形態。此外，單一奈米立方體在高解析度的TEM圖像表明該奈米立方體具有凹面(圖1B)。因此，將奈米立方體從電子束傾斜了5到30度，以提供更佳的形態可視化效果(圖1C)。黑暗部分顯示結構中的深凹痕，清楚地顯示凹面而不是平坦的表面。電子繞射圖譜鑑定出該凹形奈米立方體為立方尖晶石結構的單晶(圖1D)。從奈米立方體的中心獲取的圖像顯示出對應於{220}基面的條紋間距為0.29nm(圖1E)。此外，HRTEM圖像顯示凹形奈米立方體的邊緣為由{220}和{400}小平面組成的階梯小平面(圖1F)。XRD圖譜證實了ZGC的立方尖晶石結構(圖1G)。

當ZGC凹形奈米立方體被250nm的UV光激發時，在NIR範圍內出現了寬發射帶，在695nm處有一個峰，肩在715nm附近(圖1H)，此發現與先前的報導是一致的，亦即這兩個峰屬於695nm處的零聲子線，歸因於具有相鄰反位缺陷的Cr³⁺離子，稱為Cr_N2，和斯托克斯(Stokes)聲子邊帶 (在715nm處，正常尖晶石環境中的Cr³⁺造成由斯托克斯和反斯托克斯聲子邊帶組成的R線，稱為Cr_R)。我們發現ZGC的發射強度揭露了Cr濃度依賴性行為。在1%Cr摻雜劑中可見到最強的發射，其被選擇用於後來的體外和體內研究。

1.2 聚乙二醇化和APTES改質ZGC奈米立方體

為了使實施例1.1的ZGC奈米立方體適合於生物學應用，根據“材料和方法”章節中所敘述的程序，用(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)和PEG分子對其進行進一步改質。

1.2.1 APTES改質的ZGC奈米立方體

為了使實施例1.1的ZGC奈米立方體具有親水性，用APTES對其進行改質。圖1I中的照片清楚地顯示，在APTES改質之前和之後，奈米立方體的特徵發生了變化。改質前在水中觀察到明顯的聚集，其在改質後變成分散狀態。傅立葉轉換紅外(FTIR)測量也證實了奈米立方體表面上有APTES的存在，其中在1081、774和485cm^-1處的峰與Si-O-Si拉伸有關，1600和1640cm^-1處的峰與NH₂彎曲有關，以及3363和3282cm^-1與NH₂拉伸有關。1296cm^-1處的拉伸峰與C-N有關。(數據未顯示)。

1.2.2.聚乙二醇化和APTES改質的ZGC奈米立方體

在本實施例中，將實施例1.2.1的APTES改質奈米立方體進一步用PEG分子改質。從FTIR光譜觀察到聚乙二醇化ZGC在1034cm^-1處對應於C-O拉伸模式的信號。由於被APTES和PEG改質的ZGC的表面基團是胺基，因此觀察到對應於NH₂的相似譜帶(數據未顯示)。在改質的每個步驟之後還測定了ζ電勢和流體動力學直徑，以確認在ZGC奈米立方體上的成功官能化。TGA分析顯示，APTES改質和聚乙二醇化的ZGC分別有約10%和11.4%的重量損失。根據重量減輕，確定PEG的定量為1.4%(數據未顯示)。

1.3 實施例1.2.2的ZGC在照射後的持續發光

在250nm下激發的實施例1.2.2的ZGC奈米立方體在695nm發射NIR。在汞燈曝光1分鐘後研究了LLL，然後對其進行體內成像系統(IVIS)分析，其中用700nm濾光片在30秒曝光時間獲取圖像。油相和水相ZGC奈米立方體的LLL強度和衰減行為係通過關注區域(ROI)分析進行定量。油相和水相ZGC奈米立方體均顯示出相似的LLL衰減曲線，壽命為6小時，LLL強度比背景增加了10倍(圖2,(A)和(B))。油相和水相ZGC奈米立方體的LLL衰減曲線可被再充電，並且在3次重複激發過程中保持不受影響(圖2,(C),(D)，和(E))。所得ZGC凹形奈米立方體穩定通過反複激發並保持其LLL行為。

為了比較，藉由先前敘述的方法(Wang J等人，2015,J.Am.Chem.Soc.137：5304)製備水相ZGC奈米粒子。所製備的水性ZGC奈米粒子(圖3,(B))比實施例1.2的本發明APTES改質ZGC奈米立方體(圖3,(A))更易於聚集，並表現為大小約6nm的立方形和球形的混合物。此外，所比較的ZGC仍然是具有高度晶體結構的立方尖晶石，也發射出LLL，但根據在激發停止後30秒曝光時間所捕獲的強度，其發光強度比實施例1.2的聚乙二醇化ZGC凹形奈米立方體的發光強度小了5倍(圖3,(C)和(D))。另外，所製備的水性ZGC奈米粒子的LLL持續30分鐘達到背景信號水平(圖3,(C)的插圖)，而聚乙二醇化ZGC凹形奈米立方體可延長發射長達6小時(圖2,(A)的插圖)。

1.4 實施例1.2.2的ZGC在X射線照射下的持續發光

實施例1.2.2的奈米立方體的X射線激發放射發光(XRL)係示於圖4,(A)中。獲得與UV激發相同的發射(圖1,(H))，但具有由Cr_N2和Cr_R譜線所組成的良好解析峰，以及斯托克斯和反斯托克斯聲子邊帶。出現在 686.78nm和688.69nm處的發射峰分別是對於Cr³⁺的²E→⁴A₂躍遷稱為R2和R1的兩條零聲子線。R線的聲子邊帶(PSB)對於斯托克斯PSB是在708.9nm、714.82nm和720.15nm處識別，對於反斯托克斯PSB則為669.95nm和680.24nm。在~696.7nm處與結構有關的譜線被指定為N2。接下來，使用獸醫用X射線源(1Gy min^-1,160kV,20mA)激發ZGC奈米立方體和聚集奈米粒子用於XRL。兩種粒子在5Gy之前均顯示出隨X射線劑量增加的發光強度，但在5Gy之後達到平穩(圖4,(B))。ZGC奈米立方體顯示出比聚集奈米粒子強得多的發射強度。實際上，對於ZGC奈米立方體，使用低劑量的0.5Gy仍能提供可觀的放射發光，是聚集奈米粒子的5倍。對於兩種奈米粒子，激發後取得的LLL衰減在0.5和1Gy處停止(圖4,(C)和(D))。顯然，與聚集奈米粒子相比，聚乙二醇化ZGC奈米立方體展現出更高的發射強度和更持久的發光。例如，聚集的奈米粒子在激發於0.5Gy停止時，LLL在10分鐘後達到背景，而聚乙二醇化ZGC奈米立方體的發光持續了15分鐘。

實施例2 實施例1.2.2的ZGC奈米立方體在X射線照射下的體外和體內持續發光

在本實施例中，對實施例1.2.2的ZGC奈米立方體進行體外和體內發光分析。

對於體外研究，發現對於用聚乙二醇化ZGC孵育的細胞，在有(0.5Gy)/沒有X射線暴照的細胞活力方面沒有明顯變化。檢查聚乙二醇化ZGC的結構穩定性，然後將其分散在水與pH 7的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、pH 5的PBS、胎牛血清(FBS)和培養基(DMEM)中觀察5天。發現在不同的儲存條件下5天後，聚乙二醇化ZGC奈米立方體具有良好的穩定性。用聚乙二醇化奈米立方體孵育的細胞可以很容易地觀察到LLL，並可以一致的發射強度和衰減行為對其進行重複刺激(圖5,(A)和(B))，而用聚集ZGC孵育的細胞未偵測到可觀察到的信號(數據未顯示)。

為了進行體內研究，通過裸鼠的尾靜脈分別施用實施例1.2.2的聚乙二醇化ZGC和水相ZGC奈米粒子(n=3)，然後使用臨床X射線激發施用0.5Gy劑量。與體外觀察一致，僅有用實施例1.2.2的聚乙二醇化ZGC處理的小組在肝臟區域表現出明亮的餘輝，而在重複刺激下沒有顯著損害成像品質(圖6,(A))。例如，緊接在X射線激發後的信號強度為1.04×10⁶p s^-1cm^-2sr^-1。在再激發程序之後，緊接在X-射線激發停止後信號強度略有下降，第一次再激發為0.78×10⁶p s^-1cm^-2sr^-1，第二次再激發為0.77×10⁶p s^-1cm^-2sr^-1。相反地，在X射線激發後，在偽對照組和聚集的ZGC奈米粒子組中均未觀察到LLL信號。體外清楚地證實，聚乙二醇化ZGC主要累積在肝臟中，顯示在X射線激發後連續發射5小時(圖6,(B))。可看到再充電變亮的肝組織。脾臟中的信號顯示實施例1.2.2的聚乙二醇化ZGC奈米立方體的一定累積。此外，我們還用一次X射線激發檢視了健康小鼠的聚乙二醇化ZGC奈米立方體的LLL效率。緊接在X射線激發後的信號強度為4.18×10⁵p s^-1cm^-2sr^-1，然後在60分鐘後降低至1.01×10⁵p s^-1cm^-2sr^-1(數據未顯示)。90分鐘後，無法用光學成像偵測到LLL信號。

因為大部分累積是在肝臟中觀察到，所以我們進一步研究用HepG2細胞建立的原位肝腫瘤的特異性被動標靶。首先，使用生物發光來評估肝臟中的腫瘤生長。注射D-螢光素的荷瘤小鼠證實肝臟中腫瘤的存在(數據未顯示)。然後將荷瘤小鼠靜脈注射實施例1.2.2的聚乙二醇化ZGC奈米立方體，其在0.5Gy X射線激發後在肝腫瘤中表現出餘輝並連續發射3小時(圖7,(A))。緊接在激發後的信號強度為1.65×10⁴p s^-1cm^-2sr^-1，在3小時後逐漸降低至4.93×10³p s^-1cm^-2sr^-1。注射後4小時將小鼠犧牲，以獲取離體器官的體外圖像(圖7,(B))。在餘暉和再充電圖像中的體外證實了高度特異性的腫瘤吸收。健康的小鼠在幾乎整個肝臟中均表現明亮(圖FIG 6,(B))，而LLL信號則集中在肝臟中腫瘤區域的位置。這表示聚乙二醇化ZGC奈米立方體被HepG2惡性腫瘤通過增強的滲透性和保留(EPR)作用攝取並保留在腫瘤區域內。

總之，荷瘤動物模型的體內和體外研究證實了實施例1.2.2的聚乙二醇化ZGC奈米立方體可作為肝腫瘤成像中的發光探針。

將理解的是，以上實施方式的描述僅通過示例的方式給出，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以做出各種修改。上面的說明書、實施例和數據提供了對本發明示例性實施方式的結構和使用的完整描述。儘管以上已經以某種程度的特點或參考一或多個單獨的實施方式描述了本發明的各種實施方式，但是本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以在不脫離本發明的精神或範圍的情況下對所揭示的實施方式進行多種改變。

Claims

一種改質鉻摻雜鎵酸鋅(ZGC)奈米立方體，其特徵在於具有經(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)改質而使其具有親水性的凹面。
如請求項1所述的改質ZGC奈米立方體，更包含多個聚乙二醇(PEG)分子，分別通過與APTES間所形成的醯胺鍵而被連接到該APTES。
如請求項2所述的改質ZGC奈米立方體，其中該改質ZGC奈米立方體被一定劑量的X射線激發後可產生持久發光(LLL)，其持續至少1.5小時。
如請求項3所述的改質ZGC奈米立方體，其中該改質ZGC奈米立方體產生持續至少3小時的LLL。
如請求項4所述的改質ZGC奈米立方體，其中該改質ZGC奈米立方體產生持續至少5小時的LLL。
一種製備改質ZGC奈米立方體的方法，包括：(a)使硝酸鋅和硝酸鎵分別與鹼反應，由此形成氫氧化鋅和氫氧化鎵，其中該鹼為氫氧化銨、氫氧化鈉或氫氧化鉀；(b)將步驟(a)中分別產生的氫氧化鋅及氫氧化鎵和硝酸鉻與水混合，得到第一混合物；(c)將螯合劑和甲苯加到該第一混合物中，得到第二混合物；(d)將該第二混合物高壓滅菌以產生ZGC奈米立方體；以(e)用(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)矽烷化該ZGC奈米立方體，以產生改質ZGC奈米立方體。
如請求項6所述的方法，其中在步驟(c)中，該螯合劑為C_16-20脂肪酸、羧化PEG或抗壞血酸。
如請求項7所述的方法，其中在步驟(a)中，該鹼為氫氧化銨；以及在步驟(c)中，該螯合劑為油酸。
如請求項6所述的方法，其中在步驟(d)中，該高壓滅菌是在220℃的溫度下進行3天；以及在步驟(e)中，該矽烷化是在60℃的溫度下進行18小時。
如請求項6所述的方法，更包含：(f)聚乙二醇化該改質ZGC奈米立方體：在1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)的存在下，使該改質ZGC奈米立方體與胺-PEG-酸反應，從而產生聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體，其中該胺-PEG-酸的分子量約3,400。
如請求項10所述的方法，其中該改質ZGC奈米立方體和聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體在被X射線激發後分別產生持續至少1.5小時的持久發光(LLL)。
如請求項11所述的方法，其中該改質ZGC奈米立方體和聚乙二醇化改質ZGC奈米立方體在被X射線激發後分別產生持續至少3小時的LLL。
如請求項11所述的方法，其中該改質ZGC奈米立方體和聚乙二醇化的改質ZGC奈米立方體分別產生在被X射線激發後持續至少5小時的LLL。
一種將一關注區域(AOI)成像的方法，包括：(a)將足量的如請求項2所述的改質ZGC奈米立方體施用至該AOI；以及(b)用一定劑量的X射線照射該AOI，藉此產生該AOI的圖像。
如請求項14所述的方法，其中該X射線的劑量不超過3Gy。
如請求項15所述的方法，其中該X射線的劑量為約0.5Gy。
如請求項14所述的方法，其中該AOI為癌症。
如請求項17所述的方法，其中該癌症係選自由骨癌、腦癌、乳癌、結腸癌、宮頸癌、伊文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、食道癌、肝癌、頭頸癌、喉癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非小細胞肺癌、非黑色素瘤皮膚癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、直腸癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌和威爾姆氏瘤(Wilms’ tumor)所組成的群組。
如請求項14所述的方法，其中該改質ZGC奈米立方體產生持續至少1.5小時的持久發光(LLL)。
如請求項19所述的方法，其中該改質ZGC奈米立方體產生持續至少3小時的LLL。
如請求項20所述的方法，其中該改質ZGC奈米立方體產生持續至少5小時的LLL。