TWI810117B - 近紅外二區螢光複合材及其製備方法與用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於用於第二區近紅外光(second near-infrared，NIR-II；又稱近紅外二區)螢光複合材以及其製備方法。前述方法主要包含的步驟有，於一溶劑中混合外表面上具有複數個巰基化合物的金奈米團簇以及alpha-甘油磷酸膽鹼(alpha-GPC)以形成一混合物；將溶劑移除並通入惰性氣體；在惰性氣體存在下，以約100-200℃加熱該混合物直到至少有部分的金奈米團簇被覆蓋層包覆(覆蓋層是由alpha-GPC構成)，從而產生所述NIR-II螢光複合材。所產生的NIR-II螢光複合材的特性在於其發射光波長涵蓋近紅外二區，並可被特定相機偵測。本揭示內容還包含在個體之目標區域執行活體生物成像的方法。該方法包含對該目標區域投予本發明NIR-II螢光複合材，以及在900至1700nm之間的一波長偵測從該NIR-II螢光複合材發射的螢光。

Description

近紅外二區螢光複合材及其製備方法與用途

本揭示內容是關於一種近紅外二區(又稱第二區近紅外光)之螢光複合材，特別是有關於一種用作發光材料的近紅外二區螢光複合材，可用作為活體鏡檢或診斷影像的影像顯影劑或對比劑。

諸如磁振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、電腦斷層攝影(computed tomography，CT)、正電子發射斷層攝影術(positron emission tomography，PET)、X射線造影以及螢光透視等成像技術是臨床上的常規程序，在對比劑或顯影劑的幫助下對組織影像的異常進行可視化。對比劑或顯影劑與入射輻射交互作用以在所擷取的影像內產生可見的變化，如此可提高成像技術對於先前無法偵測到的病理的鑑別靈敏度。

通常在手術過程使用實時X射線造影以及近紅外(near-infrared，NIR)成像來協助外科醫生看見病灶。然而，X射線造影的使用受限於臨床人員可暴露的輻射劑量最大值。至於在NIR成像方面，廣泛使用的顯影劑-靛青綠(indocyanine green，ICG)，其具有第一區近紅外(NIR-I)螢光，惟不穩定且對溶劑、濃度及激發條件敏感，故靛青綠具有較短的半衰期和有限的注射深度。

有鑑於此，相關領域亟需一種改良且穩定的近紅外二區(NIR-II)螢光材料，其覆蓋900nm至1700nm之波長，可用於對身體較深處的部分之目標區域成像。

為了給讀者提供基本的理解，以下提供本揭示內容的簡要發明內容。此發明內容不是本揭示內容的廣泛概述，同時非用來識別本發明的關鍵/必需元件或勾勒本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。

如本文具體實施及廣泛描述，本揭示內容的一個態樣是關於近紅外二區(以下稱NIR-II)螢光複合材，其包含一金奈米團簇以及一覆蓋層。金奈米團簇的外表面上具有複數個巰基化合物；且覆蓋層由alpha-甘油磷酸膽鹼(alpha-glycerylphosphorylcholine，alpha-GPC)構成，並包覆至少一部份的金奈米團簇。其中，本揭示內容的NIR-II螢光複合材具有介於900至1700nm之間的一發射波長。

根據本揭示內容部分實施方式，金奈米團簇的直徑約為1至3nm。

根據本揭示內容部分實施方式，巰基化合物是二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid，DHLA)、麩胱甘肽(glutathiones)、巰基苯甲酸(mercaptobenzoic acid，MBA)、聚(乙二醇)二硫酚(poly(ethylene glycol)dithiol)、甲氧基聚乙二醇巰基(methoxy polyethylene glycol thiol，mPEG thiol)或是其組合。

本揭示內容的另一態樣是關於一種NIR-II螢光複合材的製作方法。所述方法包含以下步驟：(a)在溶劑中混合金奈米團簇以及alpha-甘油磷酸膽 鹼(alpha-GPC)以形成第一混合物，其中金奈米團簇具有複數個巰基化合物在其外表面上；(b)以一惰性氣體置換掉第一混合物的溶劑，從而形成第二混合物；以及(c)在約100-200℃之一溫度加熱第二混合物，直到至少一部分金奈米團簇被alpha-甘油磷酸膽鹼組成之覆蓋層包覆為止，從而產生本揭示內容NIR-II螢光複合物。

根據本揭示內容部分實施方式，巰基化合物是二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid，DHLA)、麩胱甘肽(glutathiones)、巰基苯甲酸(mercaptobenzoic acid，MBA)、聚(乙二醇)二硫酚(poly(ethylene glycol)dithiol)、甲氧基聚乙二醇巰基(methoxy polyethylene glycol thiol，mPEG thiol)或是其組合。

根據本揭示內容部分實施方式，本揭示內容方法的步驟(c)的第二混合物是在氮氣存在下，以約160℃加熱約10至60分鐘。

根據本揭示內容部分實施方式，所述溶劑是選自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇及其組合所組成之群組。

本揭示內容又一態樣是關於對一個體之目標區域進行生物成像的方法。所述方法包含至少以下步驟：(a)對該目標區域施用一有效量的前揭NIR-II螢光複合材；以及(b)在900至1700nm之間的波長偵測前述NIR-II螢光複合材在該目標區域中所發射的螢光。

根據本揭示內容某些實施方式，目標區域係一正常組織、一惡性組織或一其組合。

根據本揭示內容某些實施方式，本發明NIR-II螢光複合材係以約0.01至300mg/kg之有效量施用於該個體。

根據本揭示內容某些實施方式，所述個體是哺乳動物。較佳地，所述個體是人類。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖是線圖，其根據本揭示內容一實施方式繪示本發明NIR-II螢光複合物(AuNCs@DHLA@GPC)的螢光強度及發射波長；第1B圖是線圖，其根據本揭示內容另一實施方式繪示本發明NIR-II螢光複合材(AuNCs@MBA@GPC)的螢光強度與發射波長；第2A圖為根據本揭示內容一實施方式以本發明NIR-II螢光複合材處理之健康小鼠的連續短波紅外(SWIR)影像；第2B圖是根據本揭示內容一實施方式以本發明NIR-II螢光複合材處理後120秒的健康小鼠的SWIR影像；以及第3圖是根據本揭示內容一實施方式以本發明NIR-II螢光複合材處理之帶鱗狀細胞癌(SCC)腫瘤的連續SWIR影像。

根據慣常的作業方式，圖中各種元件與特徵並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現本發明相關的具體特徵與元件。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1.定義

為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本文另有定義，否則本文所有的技術及科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者習知的術語的意思相同。

除非上下文另有明確說明，本文所使用的單數形式「一(a,an)」以及「該(the)」均包含複數形式。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。

「第二區近紅外」或「近紅外二區(NIR-II)」一詞在本文中交替使用且旨在表示涵蓋範圍從900至1,700nm波長的光譜。

本文使用的「複合材」或「複合物」一詞是指一種由兩種以上成分之組合所形成的材料，且該材料具有與原本各自成分顯著不同的特性。根據本揭示內容，一金屬團簇物以及一膽鹼化合物合併形成一種具有與原先金屬團簇物截然不同之發光特性的複合物。

本文使用的「金奈米團簇」或簡稱「AuNC(s)」一詞是依循本領域具有通常知識者採用的定義，是指數十個金原子自組裝而成，其中組裝後的金原子整體總直徑小於3nm。通常，金奈米團簇吸收範圍650至900nm之間的近紅外(NIR)光並展現被相關技術領域充分發掘的天然發光特性。所注意到的是金奈米團簇可藉由本領域熟知的任何手段及製程以官能基進一步修飾。根據本揭示內容，是以巰基化合物修飾金奈米團簇。

本文使用的「巰基化合物(thiol-based compound)」一詞是指任何包含一或多個R-SH官能基的任意有機硫化合物，其中R表示有機取代基，其包含但不限於，烷基、烯基、炔基以及芳基。在本揭示內容一些實施方式中，巰基化合物具有一個-SH基團，然而在本揭示內容其他實施方式中，巰基化合物具有兩個-SH基團。

本文使用的「惡性」組織之詞語旨在描述任何癌性及/或傾向於侵入正常組織或在切除後復發的組織或器官。在本揭示內容一些實施方式中，惡性組織是鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)腫瘤。

本文交替使用「個體」、「受試者」或「患者」等詞，並指可被本揭示內容近紅外二區(NIR-II)螢光複合材治療之哺乳類，包含人類。「哺乳動物」(mammal)一詞是指哺乳綱(class)的所有成員，其包含人類、靈長類(例如猴子與黑猩猩)、馴養動物及家畜，像是兔、豬、山羊、綿羊及牛)；還有動物園圈養動物、用於運動的動物或寵物(例如：馬、狗、貓等)；以及囓齒類(例如小鼠、大鼠、天竺鼠及倉鼠)。在具體實施例中，個體是一小鼠；在其他具體實施例中，個體是一人類。再者，除非明確指出性別，否則「個體」或「受試者」或「患者」一詞均有包含男性(雄性)及女性(雌性)。

2.具體實施方式

本揭示內容至少部分基於對金奈米團簇(gold nanocluster，以下稱AuNC)的發現，發現到當被以alpha-甘油磷酸膽鹼(又可簡稱alpha-GPC)構成之覆蓋層包覆，金奈米團簇的發射波長紅位移(red-shift)至波長為900至1,700nm的第二區近紅外光。因此，由AuNC及alpha-GPC製得的複合材(複合物)可作為顯影劑，用於短波紅外線影像系統下的活體內生物成像。本文還揭示的是一種製備近紅外二區(NIR-II)螢光複合材的方法。

2.1近紅外二區(NIR-II)螢光複合材及其製備方法

本揭示內容目的在於提供一種近紅外二區(NIR-II)螢光複合材，其主要結構包含具有複數個巰基化合物在其外表面上的金奈米團簇(AuNC)；以及由alpha-甘油磷酸膽鹼(以下稱alpha-GPC或α-GPC)組成之覆蓋層，其中該覆蓋層包覆至少部分的金奈米團簇。根據本揭示內容之實施方式，本揭示內容NIR-II螢光複合材是藉由以下步驟製得：(a)於一溶劑內混合金奈米團簇與alpha-GPC以形成第一混合物，其中金奈米團簇外表面上具有複數個巰基化合物；(b)以一惰性氣體置換並移除第一混合物的該溶劑，從而形成第二混合物；以及(c)於約100-200℃之溫度加熱所述第二混合物，直到至少一部分金奈米團簇被alpha-GPC組成之覆蓋層包覆，從而產生NIR-II螢光複合材。

適用於本揭示內容的金奈米團簇是數十至數百個金(Au)原子在合適條件下自組裝而成的聚集體，且自組裝的奈米團簇後續可再經表面修飾，使得該金奈米團簇的外表面上具有複數個巰基化合物。

根據本揭示內容之實施方式，金奈米團簇是由數十至數百個金原子製成，例如由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個金原子製成。通常，藉由自組裝的金原子形成的金奈米團簇具有小於3nm的核心直徑(亦即聚集的金原子的直徑)，較佳範圍為1至3nm。可藉由本領域熟知的方法，包含「一鍋」合成法、配位基交換法等，以有機硫化合物(即，巰基化合物)對金奈米團簇進一步硫醇化，其中，透過有機硫化合物與聚集的金原子外表面之間的交互作用形成硫-金(S-Au)鍵結。在本揭示內容一些實施方式中，用於本揭示內容的金奈米團簇是藉由將金原子與巰基化合物以約10：1至1：10之莫耳比例混合來製備，舉例來說，是以約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1；7、1：8、1：9或1：10之莫耳比例混合以形成一均質溶液，並保持在20至40℃約10至80小時，直至金原子自組裝成一團簇(或是一聚集體)，且巰基化合物附著在聚集之金原子之外表面上(亦即，由此產生的金奈米團簇的外表面上具有複數個巰基化合物)。可選地或非必要地，在自組裝之前或是與巰基化合物附接同時，以還原劑(諸如硼氫化鈉或是一氧化碳)還原金原子(即，通常為三價金(III)前驅物)。

適用於本揭示內容之巰基化合物的實例包含，但不限於，二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid，DHLA)、麩胱甘肽(glutathiones)、巰基苯甲酸(mercaptobenzoic acid，MBA)、聚(乙二醇)二硫酚(poly(ethylene glycol)dithiol)、 甲氧基聚乙二醇巰基(methoxy polyethylene glycol thiol，mPEG thiol)或是其組合。在較佳實施例中，金奈米團簇由α-硫辛酸及氯金(III)酸(HAuCl₄)按1：3至3：1莫耳比例混合而成，從而得到的金奈米團簇的表面包覆有DHLA。在其他實施例中，金奈米團簇的外表面有DHLA，由莫耳比例為1：1.7至1：2的α-硫辛酸及氯金(III)酸(HAuCl₄)混合而成。在又其他實施例中，是藉由以1：1至3：1之莫耳比例混合巰基苯甲酸(MBA)及氯金(III)酸(HAuCl₄)來形成金奈米團簇，從而產生外表面具有MBA的金奈米團簇。

一旦形成金奈米團簇，隨即在溶劑中與alpha-GPC混合，從而形成第一混合物(步驟(a))。根據本揭示內容之實施方式，金奈米團簇及alpha-GPC以約10：1至1：10之質量比於一溶劑內混合。適用於該步驟的溶劑之實例包含但不限於，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇及其組合。根據本揭示內容較佳實施方式，金奈米團簇及alpha-GPC則以約1：10之質量比混合於甲醇中。

一旦金奈米團簇及alpha-GPC完全混合於溶劑中，以惰性氣體置換溶劑。具體而言，透過抽吸器(evacuator)移除第一混合物中的溶劑(例如，甲醇)，接著將氮氣充入反應燒瓶內，從而形成第二混合物，並在約100-200℃之溫度加熱直到金奈米團簇至少部分被覆蓋層包覆為止，其中覆蓋層是由alpha-GPC所組成(步驟(b)及(c))，從而產生本揭示內容NIR-II螢光複合材。換言之，是在惰性環境下進行反應(步驟(c))。根據本揭示內容某些實施方式，覆蓋層透過alpha-GPC與處於金奈米團簇外表面的巰基化合物之間的化學鍵，或是透過在巰基化合物之間alpha-GPC摻雜，來包覆或覆蓋金奈米團簇的外表面的一部份或是全部。在本揭示內容的一些具體實施例，第二混合物是在氮氣存在下，約160℃加熱約10至60分鐘，從而產生固體產物；亦即，本揭示內容之NIR-II螢光複合材。

在某些非必要或替代性實施方式中，固體產物可為重新懸浮於水性緩衝液(例如，磷酸鹽緩衝液(PBS))中，用於儲存和後續使用。

根據本揭示內容，所製得的NIR-II螢光複合材具有範圍從750至1,700nm，像是750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650以及1700nm之發射波長；較佳地是從900至1,400nm，像是900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350以及1400nm之發射波長。在部分較佳實施方式中，NIR-II螢光複合材具有約700nm的尖峰發射(peak emission)。在其他實施例中，本揭示內容NIR-II螢光複合材具有約900nm的尖峰發射。在又其他實施例中，本揭示內容NIR-II螢光複合材具有約1,050nm的尖峰發射。

2.2用於活體內進行生物成像的方法

本揭示內容也旨在提供用於對活體進行實時非侵入性可視化生物活性的新穎生物成像方法。為此，本揭示內容的NIR-II螢光複合材可施用於個體之目標區域，並作為顯影劑及/或對比劑以增進深處組織的解析度與滯留時間。如此，本揭示內容包含一用於在個體之目標區域執行活體生物成像的方法。

在一些實施方式中，前述方法包含對該個體之目標區域施以一有效量的本揭示內容NIR-II螢光複合材；且在900至1700nm之間的波長偵測前述NIR-II螢光複合材在該目標區域中所發射的螢光。

根據本揭示內容，本發明NIR-II螢光複合材可以透過藥學領域習知的方法，並藉由使用惰性(特別是非毒性)的藥學上合適之載體或溶劑，來配製成製劑，例如粉末、懸浮液、溶液或凝膠。依據目標區域的位置及/或尺寸，以 及/或是個體的生理狀況，以及依據所施用之組成物之路徑的不同，可調整前述製劑中本發明NIR-II螢光複合材的相對含量。

根據本揭示內容，目標區域可以是一正常組織、一惡性組織或是其組合。在一些實施方式中，可將本揭示內容NIR-II螢光複合材製成溶液形式，因此可被投予至個體的循環系統及/或腫瘤。

根據本揭示內容某些實施方式，所述NIR-II螢光複合材是以足以滯留在個體一段時間的量投予至該個體的目標區域。根據本揭示內容某些實施方式，前揭NIR-II螢光複合材是以0.01至100mg/kg的量投予至該目標區域；舉例來說，是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/kg的量。在一特定實施例中，本揭示內容NIR-II螢光複合材是以約1.6mg/kg的量投予至該個體。在另一特定實施例中，本揭示內容NIR-II螢光複合材是以約20mg/kg的量投予至該個體。

在一些實施方式中，個體是哺乳動物，較佳為人類。

透過上述特徵，本揭示內容方法可提供一種在目標組織內具第二區近紅外發光特性，且可被特定攝影機偵測的新穎顯影劑(對比劑)，從而達成快速、有力且有效的活體內生物成像。

實施例

材料與方法

I.金奈米團簇(AuNs)合成

1.AuNCs@DHLA

將氯金(III)酸(HAuCl₄，2.5mM，4.854毫升)加至α-硫辛酸(1.45mM，溶於20毫升的去離子水)溶液中，使總體積為465毫升。以300rpm攪拌前述混合物5分鐘，接著以滴式加入9.5毫升的NaBH₄(50mM)。在室溫持續攪拌前述混合物15小時，接著在40℃以真空蒸鍍濃縮至約10毫升。以截留分子量為10kDa之濾膜過濾經濃縮的混合物，並以3,500rpm離心該過濾物13分鐘。所產生的濾液含有金奈米團簇(AuNCs)，且表面上塗覆有二氫硫辛酸(DHLA)。濾液儲存於室溫待後續使用。

另一製備AuNCs@DHLA的替代流程如下：將氯金(III)酸(HAuCl₄，2.5mM，10毫升)加至α-硫辛酸(1.45mM，溶於10毫升之去離子水)溶液中，使總體積為465毫升。以300rpm攪拌前述混合物5分鐘，接著以滴式加入20毫升的NaBH₄(50mM)。在室溫持續攪拌前述混合物15小時，接著在40℃以真空蒸鍍濃縮至約10毫升。以截留分子量為10kDa之濾膜過濾經濃縮的混合物，並以3,500rpm離心該過濾物13分鐘。所得濾液含有金奈米團簇(AuNCs)，表面上塗覆有二氫硫辛酸(DHLA)(濃度：80μM)，並儲存於室溫待後續使用。

2.AuNCs@MBA

巰基苯甲酸(MBA，0.77g溶於10毫升之150mM NaOH)及HAuCl₄(50mM,9.709毫升)混合於238.75毫升的純水中。以300rpm攪拌前述混合物5分鐘，加入200μL的NaOH(1M)，接著通入一氧化碳(CO)兩分鐘。在室溫下攪拌混合物3天，接著以真空蒸鍍於40℃濃縮至約10毫升。以截留分子量為10kDa之濾膜過濾經濃縮的混合物，並以3,500rpm離心。重複四次前述過濾與離心程序所得濾液含有表面上塗覆有MBA的金奈米團簇(AuNCs)，將該濾液儲存於室溫。

II.製備近紅外二區(NIR-II)螢光複合材

將前揭AuNCs@DHLA或AuNCs@MBA(1mL)放置於圓底燒瓶，以抽吸器移除液體，接著添加10g的alpha-甘油磷酸膽鹼(alpha-GPC)粉末。加入甲醇(20毫升)直到金奈米團簇及alpha-GPC完全混合(懸浮)。以抽吸器移除燒瓶內的甲醇後，以一恆溫(160℃)導入氮氣充填整個燒瓶5至45分鐘，使膠體(colloid)形成，接著冷卻至室溫，從而製得本揭示內容的NIR-II螢光複合材。將膠體重新溶解於PBS中，並將該溶液經離心處理(3500rpm)及過濾(截留分子量為10kDa之濾膜)三次，從而得到最終產物。該最終產物經滅菌後可儲存於周圍條件(室溫環境)。

聚乙二醇化(PEGylation)及蛋白吸附特性分析

將本揭示內容的NIR-II螢光複合材(10μL)與10μL的mPEG550-NH₂(MW：550,1mM)混合，並以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)從512mM連續稀釋至0.23mM。混合物於室溫反應隔夜，從而使前揭NIR-II螢光複合材聚乙二醇化並進行交聯。以凝膠電泳(2%)確定最適的EDC濃度。將聚乙二醇化NIR-II螢光複合材與新鮮牛血清蛋白(BSA)溶液(10mM)於37℃以200rpm震顫培養2小時。超速離心後，回收BSA-吸附的聚乙二醇化NIR-II螢光複合材，並以四次，每次1毫升的PBS洗滌以移除游離BSA。以凝膠電泳(2%)驗證並以具有1,070nm之長通濾波器的短波紅外(short wave infrared，SWIR)照相機偵測聚乙二醇化NIR-II螢光複合材對BSA吸附的能力。

實驗動物

從國家實驗動物中心(台北)取得雄性ICR小鼠(4至6周齡)並將其飼養於通風良好動物房之聚碳酸酯籠(飼養籠尺寸為33.2cm×21.5cm×21cm) 內，飼養溫度保持18-26℃，相對溼度保持30%-70%，任意採食食物及水。提供普通照明並維持12-小時日/夜循環。

異種移植鱗狀細胞癌(SCC)動物模型

在第0日，對每隻小鼠(7-8周齡)皮下接種2×10⁵個鱗狀細胞以產生SCC，接著放回籠內繼續飼養14天使腫瘤生長。為了評估本揭示內容NIR-II螢光複合物的效能，每隻小鼠放置於具有1070nm之濾波器的SWIR相機下，並透過尾部注射接受前揭一劑複合材(0.4毫克)。錄製本揭示內容NIR-II螢光複合材在每隻小鼠內循環的影像，另於0、5、10、15及20秒分別捕捉單張螢光照片。為了比較，健康的控制組小鼠(即，沒有在背上異種移植SCC的小鼠)接受相同的本揭示內容NIR-II螢光複合材處理，且在0、3、10、30以及120秒分別捕捉單張螢光照片。

實施例1：本揭示內容NIR-II螢光複合材的特性分析

根據前揭「材料與方法」段落描述的方法，以AuNCs@DHLA或AuNCs@MBA作為核心結構來製備本揭示內容的NIR-II螢光複合材(以下將螢光複合材簡稱為AuNCs@DHLA@GPC以及AuNCs@MBA@GPC)。在本實施例中，以SWIR相機驗證AuNCs@DHLA@GPC以及AuNCs@MBA@GPC的發光是否位移到第二區的近紅外光區域，結果顯示於第1A至1B圖。

結果發現當以750nm之激發光激發，本揭示內容AuNCs@DHLA@GPC的尖峰發射(峰值)從波長850nm位移至950nm，且發射波長範圍從700至1700nm。在紫外光下觀察到AuNCs@DHLA@GPC複合材的顏色從橘色轉變成深紅色(結果未顯示)。再者，發射強度隨著反應時間增加而增強。至於AuNCs@MBA@GPC複合材，當被750nm之激發光激發後也展現1050nm的 發射峰值，且發射波長範圍介於700至1400nm之間。如第1A及1B圖繪示的結果，其集體指明本發明NIR-II螢光複合材發射的光包含第一區與第二區之近紅外光波長。

實施例2：本發明NIR-II螢光複合材的穩定性

本實驗主要調查本揭示內容NIR-II螢光複合材的穩定性。為此，前揭NIR-II螢光複合材的外表面被聚乙二醇化，接著聚乙二醇化或無聚乙二醇化的的NIR-II螢光複合材分別與BSA蛋白混合。根據本文件「材料與方法」一節所述的流程測定吸附在聚乙二醇化或無聚乙二醇化之NIR-II螢光複合材外表面的BSA蛋白量。

結果發現，BSA蛋白會被吸附在無聚乙二醇化之NIR-II螢光複合材的表面，而不會吸附在經聚乙二醇化之NIR-II螢光複合材的表面，這表示NIR-II螢光複合材能經得起聚乙二醇化處理以避免蛋白吸附。同時，還發現到，無論是無聚乙二醇化或經聚乙二醇化，當被780nm的光激發後，本發明NIR-II螢光複合材都可成功地被1070nm長通濾波器的SWIR相機偵測，這表示即便經聚乙二醇化修飾，仍不影響本發明NIR-II螢光複合材的發光特性。結果整體地表明本發明NIR-II螢光複合材可能經得起表面修飾又仍可保持發光效能之穩定。

實施例3：使用本發明NIR-II螢光複合材進行活體內成像

在此實施例中，對健康小鼠及經異種移植鱗狀細胞癌(SCC)於背上的小鼠分別投予本發明NIR-II螢光複合材，並根據本文「材料與方法」段落描述的流程在指定時間取得照片。結果呈現於第2A圖至第3圖。

如第2A及2B圖所示，其為注射低劑量(每隻小鼠0.4毫克)的本發明NIR-II螢光複合材之健康小鼠的照片，該照片分別在注射後0、3、10以及30秒拍攝(第2A圖)，且可發現到螢光強度持續至少120秒(第2B圖)。

至於帶有SCC的小鼠，則發現注射後10秒，本發明NIR-II螢光複合才開始累積在腫瘤區域，且高滲透長滯留效應(enhanced permeability and retention(EPR)effect)持續至少20秒(第3圖)。

總結前述，實施例1-3的結果指明本揭示內容NIR-II螢光複合材不僅具備較廣的發光範圍，涵蓋第一區近紅外光(NIR-I)及第二區近紅外光(NIR-II)，還展現活體內優異、穩定的第二區近外光發光特性。因此，本發明NIR-II螢光複合材可做為用於活體內生物成像的新顯影劑。

應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

Claims (10)

1. 一種近紅外二區(near-infrared-II，NIR-II)螢光複合材(composite)，包含：一金奈米團簇，其外表面上具有複數個巰基化合物；以及一覆蓋層，由alpha-甘油磷酸膽鹼(alpha-glycerylphosphorylcholine，alpha-GPC)所組成並包覆至少一部分該金奈米團簇，其中，該近紅外二區螢光複合材具有介於900至1700nm之間的一發射波長。
2. 如請求項1所述之近紅外二區螢光複合材，其中該金奈米團簇在直徑上約為1至3nm。
3. 如請求項1所述之近紅外二區螢光複合材，其中該些巰基化合物為二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid，DHLA)、麩胱甘肽(glutathiones)、巰基苯甲酸(mercaptobenzoic acid，MBA)、聚(乙二醇)二硫酚(poly(ethylene glycol)dithiol)、甲氧基聚乙二醇巰基(methoxy polyethylene glycol thiol，mPEG thiol)或一其組合。
4. 一種製備近紅外二區(NIR-II)螢光複合材的方法，包含：(a)於一溶劑內混合一金奈米團簇以及alpha-甘油磷酸膽鹼(alpha-GPC)以形成一第一混合物，其中該金奈米團簇外表面上具有複數個巰基化合物；(b)以一惰性氣體置換移除該第一混合物的該溶劑，從而形成一第二混合物；以及(c)於約100-200℃之一溫度加熱該第二混合物，直到至少一部分該金奈米團簇被alpha-甘油磷酸膽鹼組成之一覆蓋層包覆，從而產生該近紅外二區螢光複合材。
5. 如請求項4所述之方法，其中該些巰基化合物為二氫硫辛酸(DHLA)、麩胱甘肽、巰基苯甲酸(MBA)、聚(乙二醇)二硫酚、甲氧基聚乙二醇巰基(mPEG thiol)或一其組合。
6. 如請求項4所述之方法，其中在步驟(c)，是在氮氣存在下，以約160℃加熱該第二混合物約10至60分鐘。
7. 如請求項4所述之方法，其中該溶劑係選自由乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇以及一其組合所組成之群組。
8. 一種如請求項1所述之近紅外二區螢光複合材用以製備用於一目標區域進行生物成像之一藥劑的用途，其中以900至1700nm之間的一波長偵測該藥劑在該目標區域中所發射的螢光。
9. 如請求項8所述之用途，其中該目標區域係一正常組織、一惡性組織或一其組合。
10. 如請求項8所述之用途，其中該近紅外二區螢光複合材具有約0.01至300mg/kg之有效量。