CN107551279A

CN107551279A - 具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107551279A
Application number: CN201710829251.4A
Authority: CN
Inventors: 陈华兵; 杨红; 柯亨特; 吕小燕; 邓益斌; 王雪; 杨涛; 李明; 徐涛
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN107551279B

Abstract

本发明公开了一种包载硫化铋/氧化钆的具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒及其制备方法和应用。通过处方筛选及工艺优化，一步制备获得具有近红外光热效应和多模态成像功能的硫化铋/氧化钆白蛋白超小复合纳米粒。该复合纳米粒有良好的物理化学稳定性、光稳定性、生物相容性和肿瘤靶向性，能显著增强肿瘤部位的近红外荧光、光声、磁共振、CT和热信号，实现多模态互补肿瘤诊断，并且可在近红外光激发下消除肿瘤，尤其是纳米粒粒径小于5.5 nm可通过肾清除，而毒副作用小，可同时诊断和治疗肿瘤，具有实现精准的肿瘤诊疗一体化的极大潜力。

Description

具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种同时包载硫化铋/氧化钆两种成分具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着全球环境恶化和生活压力增加，许多癌症的发病率呈现持续上升的趋势，早发现、早治疗已是各方共识。因此，癌症诊断和治疗手段的突破和创新，对实体瘤类型的肿瘤而言，着重在于开发高效安全、精准的肿瘤诊断和治疗方法。众多研究表明，当肿瘤细胞周围温度高于43 ℃时会导致细胞凋亡，故近年来光热治疗受到越来越多的关注。光热治疗的原理是将肿瘤细胞中的纳米材料吸收的近红外光（波长700~1100 nm）转化为热量，用于热成像或荧光成像诊断肿瘤，进而利用升温效应致肿瘤热消融用于肿瘤治疗。与手术切除，放射治疗和化疗等癌症治疗的其他手段相比，光热治疗的优点在于无创性、靶向性、高效性及非侵入性。与紫外线或可见光不同，近红外光可通过相对低强度的光照射，一定程度地穿透到组织中而不引起组织异常损伤。针对各种癌症类型优化近红外光的穿透深度，可实现高效的肿瘤治疗。研究表明，光热治疗的治疗功效关键取决于光热材料，特别是纳米材料将光转化为热的效率高，目前各种光热纳米治疗材料（包括贵金属纳米材料，碳纳米材料，过渡金属硫化物/氧化物纳米材料和有机纳米材料）已被广泛研究，有大量文献报道涌现。并且，由于纳米粒的生物分布、清除和药代动力学主要取决于其组成、粒径和表面性质，现有很多药物由于制备的缺陷导致无法实际（临床或者体内）应用，大都停留在实验（体外）阶段。

目前报道的不同纳米生物平台，除无机平台外，有机平台中就包括倍受关注的生物相容性好的蛋白质纳米载体。蛋白反应器中无机纳米晶体的可控生长是实现靶向肿瘤成像和治疗的关键。月初，以白蛋白作为纳米反应器和硫源，制备出尺寸不同的CuS纳米粒，其近红外吸收及光热效应存在差异，只有一定尺寸的产品可实现近红外荧光成像、光声和SPECT/ CT三模态成像指导的光热治疗。

MRI具有无电离辐射、非侵入性、很好的软组织对比度和分辨率等优点，是目前临床上重要的疾病诊断试剂，但与荧光成像相比，MRI成本高、灵敏度低。因此具有高分辨率、无深度限制和三维重建等优点的X射线计算机断层扫描成像（CT）成为临床诊断的主要支柱手段。但是，临床使用的CT造影剂（螯合物碘普罗胺）的循环半衰期短和非特异性分布等药代动力学限制，可能导致肿瘤靶向成像和血管造影失败。并且CT成像还存在一些内在限制，特别是软组织对比差、有辐射等缺点，是CT在临床诊断上的短板。

由于现有报道的蛋白质纳米反应器大多仅由单一反应获得的单一成分产物，致使诊断或治疗性能不够完善，从而需要进一步修饰，才能获得更多成像和治疗功能，目前尚未见针对蛋白纳米反应器，同时启动并控制两个或多个反应的报道。可见通过简单的合成方法，构建具有互补性的多功能纳米复合体系，是必要并富于挑战性的，另外，应该特别指出的是，利用无机纳米粒体内清除的规律，研究制备可通过肾排出的超小纳米粒（粒径≤5.5nm），所构建的更加安全的肿瘤多模态成像和治疗平台，更将会大大提升进一步开发为临床实际应用产品的潜力。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种同时包载硫化铋/氧化钆双成分的超小蛋白纳米粒及其制备方法，它具有良好生物相容性和肿瘤靶向性，同时具有近红外荧光、光声、磁共振和CT多模态成像功能，并能在近红外光激发下产生高效光热效应抑制肿瘤，实现了肿瘤的高效安全、精准诊疗的多功能白蛋白复合纳米粒的制备和应用。

本发明采用如下技术方案：

一种具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒，所述复合纳米粒包括复合粒子与蛋白；所述复合粒子包括硫化铋、氧化钆；所述复合纳米粒的直径为3~5.5nm。本发明的纳米粒可通过肾过滤清除迅速消除，避免了大粒径纳米粒由网状内皮系统吸收（RES），更大粒径可部分通过肝代谢清除带来的问题。因此，研究制备的小于5.5 nm的超小纳米粒，可通过肾排出体外，可用于构建肿瘤的多模态成像和治疗更加安全的平台。

上述技术方案中，所述蛋白为白蛋白；所述蛋白为骨架，作为硫源；所述复合纳米粒的铋源是五水合硝酸铋，钆源是六水合氯化钆。

本发明还公开了一种具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）混合铋源溶液、钆源溶液与蛋白溶液，得到混合溶液；所述蛋白溶液的浓度为10~100 mg·mL^-1；所述铋源溶液中，铋源的浓度为1~100 mmol·L^-1；所述钆源溶液中，钆源的浓度为1~100 mmol·L^-1；

（2）用pH调节溶液调节步骤（1）中的混合溶液pH至8.0~13.0；然后将混合溶液于0℃~60℃反应0~24 h；

（3）将步骤（2）反应后的溶液用8000~140000截留分子量透析袋透析24~48h，得到透析后的纳米粒；然后使用截留分子量为10 kD~200 kD的超滤管对透析后的纳米粒进行超滤离心纯化，得到直径为3～5.5 nm的具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒。

本发明还公开了一种具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）将步骤（2）反应后的溶液用8000~140000截留分子量透析袋透析24~48h，得到透析后的纳米粒；然后使用截留分子量为10 kD~200 kD的超滤管对透析后的纳米粒进行超滤离心纯化，得到直径为3～5.5 nm的具有近红外光热效应和多模态成像功能的蛋白复合纳米粒；

（4）将步骤（3）中的具有近红外光热效应和多模态成像功能的蛋白复合纳米粒与分散介质混合，得到具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂。分散介质可以为水、缓冲液，也可为生理盐水等可作为医用辅料的物质。

本发明中，所述混合溶液中，铋元素、钆元素摩尔比例为1:（0.5～5）；所述蛋白为白蛋白；所述铋源是五水合硝酸铋，钆源是六水合氯化钆；所述铋源溶液与蛋白溶液的体积比是1:5；所述钆源溶液与蛋白溶液的体积比是1:5；所述pH调节溶液为NaOH溶液，优选2mol·L^-1 的NaOH溶液。优选的，所述铋源溶液中，铋源的浓度为1~50 mmol·L^-1；所述钆源溶液中，钆源的浓度为1~50 mmol·L^-1；将混合溶液于20℃~55℃反应2~12h；所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒的直径为3～5.5 nm。

纳米粒的形成过程可以通过溶液颜色从无色到深黑色的变化过程来体现。本发明在强碱性条件下（pH≈12），BSA能释放大量的氨基酸残基（如变性，35个半胱氨酸残基），半胱氨酸是形成金属硫化物的硫源，这是因为半胱氨酸分子的巯基被去质子化（pKa 9.6），溶液的pH在纳米粒的形成过程中发挥了至关重要的作用，在碱性条件下，膨胀的白蛋白分子可以有效地与金属离子通过其丰富的活性基团产生晶核，也释放了众多的氨基酸残基如半胱氨酸作为后续的Bi2S3纳米晶体形成的前体。避免了由于酸性条件下，BSA的官能基团（-SH, -COOH, -NH₂）与硝酸铋的Bi³⁺结合形成BSA-Bi³⁺复合物，该复合物在碱性条件下降解形成Bi₂S₃ NPs.。

本发明中，所述透析以去离子水为接收介质；所述超滤离心的转速为2000~5000r·min^-1；所述透析时透析液更换次数为6~8次；所述超滤离心的次数为至少10次。

本发明进一步公开了上述具有近红外光热效应和多模态成像功能的蛋白复合纳米粒在制备肿瘤诊疗一体化用具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂中的应用；所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂为近红外光热治疗试剂、近红外荧光成像探针、光声成像探针、磁共振成像造影剂和X射线计算机断层扫描成像（CT）造影剂中的一种或几种。

本发明进一步公开了上述制备方法制备的到具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂及其上述具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂在制备肿瘤诊疗一体化药物中的应用。

本发明的复合粒子存在不成对电子，弛豫率高，具有较强的X射线衰减能力，较长的循环时间，毒性低，无残留、成本低、剂量较小且使用灵活等优点，可作为有效的临床CT造影剂；并且，纳米粒还具有较高的近红外吸收系数，基于近红外吸收引起的光声效应和随后热膨胀的光声成像，可提供更高的软组织空间分辨率并用于实时监测，因此纳米粒在光热治疗及光声成像应用方面极具发展前途。

本发明公开的具有近红外光热和多模态成像功能的蛋白复合纳米粒内核由两种成分构成，包括硫化铋和氧化钆，蛋白为骨架和硫源。白蛋白是最丰富的血浆蛋白，在调节血浆胶体渗透压和大量内源性化合物的运输中发挥关键作用，生物相容性高、毒性和免疫原性低、来源广泛、成本低以及体内稳定性等突出，本发明包括硫化铋、氧化钆的复合粒子在血液循环过程中与白蛋白结合而发挥作用，被白蛋白包载后用于诊断和治疗；此外，本发明的白蛋白复合粒子可以在温和条件下制备尺寸在纳米范围内的白蛋白纳米粒，在靶向多模态成像引导的癌症联合治疗中显示出极大的应用前景。

本发明所得具有近红外光热效应和多模态成像功能的硫化铋/氧化钆双成分白蛋白复合纳米粒，作为肿瘤的近红外光热治疗试剂、近红外荧光成像探针、光声成像探针、磁共振成像探针和CT成像造影剂应用，具有以下优点：

（1）本发明白蛋白复合纳米粒的合成方法：简单、便捷，产物的粒径均一，分散性良好，同时包载硫化铋/氧化钆两种功能成分，可作为合成多功能成分的反应模板；

（2）本发明所得白蛋白复合纳米粒：具有光热转换效率高（约42.65 %），光热稳定性好（持续光照15 min，吸收光谱和升温效果都无明显衰减）的特点；

（3）本发明所得白蛋白复合纳米粒：生物相容性良好，肿瘤靶向性高，可有效被肿瘤细胞摄取，在暗场几乎无毒；但在近红外光的激发下，能在体内产生强烈热效应，有效消除肿瘤，即针对肿瘤的光毒性强；并且，能精确定位于肿瘤，具有近红外荧光、光声、磁共振和X射线计算机断层扫描成像的多模态成像功能，从而有利于诊疗一体化。

附图说明

图1为本发明纳米粒表征图：（A）透射电镜图，（B）高分辨透射电镜图，（C）X射线衍射图，（D）X射线光电子能谱图；

图2为本发明纳米粒圆二色图谱表征图；

图3为本发明纳米粒紫外-可见全谱扫描图；

图4为本发明纳米粒的近红外光照升温曲线图；

图5为本发明纳米粒的光热转换效率图；

图6为本发明纳米粒的光照时间对升温的影响（A），光照次数对升温的影响（B）；

图7为本发明纳米粒对4T1细胞的细胞毒性考察图；

图8为本发明纳米粒的在荷瘤鼠体内的组织分布考察图；

图9为本发明纳米粒对荷瘤鼠的抑瘤实验考察：抑瘤曲线图（A），抑瘤后的瘤体照片（B）；

图10为本发明纳米粒的近红外荧光成像图；

图11为本发明纳米粒的光声成像图；

图12为本发明纳米粒的磁共振成像图；

图13为本发明纳米粒的X射线计算机断层扫描（CT）图；

图14为本发明纳米粒的的热成像图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不局限于本发明。

实施例一

1.白蛋白复合纳米粒的制备：

首先配制50 mg·mL^-1牛血清白蛋白溶液10 mL，搅拌条件下随后加入2 mL Bi(NO₃)₃·5H₂O(20 mmol·L^-1)，2 mL GdCl₃·6H₂O(20 mmol·L^-1)。再用2 M NaOH调节反应体系至pH12，得混合物溶液。最后将混合物溶液置于37 ℃水浴锅中，加热反应12 h。反应时间到后将反应液置于截留分子量8000~14000 KD的透析袋中，用纯水透析24 h除去反应中的小分子杂质，随后用超滤离心管3000 r·min^-1 离心15 min，10次水洗后离心浓缩得到纯化产品，即具有近红外光热效应和多模态成像功能的蛋白复合纳米粒，简称：纳米粒或DCNPs。

2. 白蛋白复合纳米粒DCNPs的表征：

（1）用激光粒度仪（Nano ZS90，英国马尔文公司）25 ℃测得所制备的纳米粒的平均粒径为4.54 ± 0.82 nm；

（2）采用一系列透射电镜、X射线衍射、X射线光电子能谱、圆二色谱等方法进行结构鉴定。

图1A的透射电镜图显示：纳米粒为尺寸均匀、实心的球体，直径约为5 nm左右（与粒度仪测定结果吻合）。纳米粒超小的尺寸有利于通过肾排泄清除，可避免潜在的毒性问题。

图1B为高分辨透射电镜图（HR-TEM）表征的纳米粒微观结构，可见其晶格结构良好，晶面间距分别为2.52 Å和2.70 Å，与正交晶Bi₂S₃的d₂₄₀（2.52 Å）和立方晶Gd₂O₃的d₄₀₀（2.70 Å）基本吻合。在同一纳米粒中同时具备正交Bi₂S₃和立方Gd₂O₃的晶格，表明双组分融合于单个纳米粒中（而非彼此分离），具有良好的稳定性，且极大地有利于实现肿瘤的诊疗一体化。

图1C为X射线衍射（XRD）图，可见纳米粒代表性衍射峰与正交Bi₂S₃标准模式和立方Gd₂O₃标准模式的非常匹配，表明两种组分的存在。

图1D为X射线光电子能谱（XPS）所表征的纳米粒的元素状态，在162.6 eV和157.4eV处的两个特征峰可以归属于Bi³⁺状态的Bi 4f 5/2和Bi 4f 7/2轨道，且159.9 eV处的峰归因于S^2-状态的S 2p轨道，证实了Bi₂S₃的形成。另外，在146.5 eV和141.4 eV的两个特征峰可归属于Gd ³⁺状态的Gd 4d 3/2和Gd 4d 5/2轨道，表明存在Gd₂O₃组分。

图2是DCNPs纳米粒的圆二色光谱（CD），为对比考察纳米粒体系中白蛋白二级结构是否发生改变，结果两条曲线并未发生明显偏移，且在208 nm和222 nm处所对应的α折叠二级结构依然存在，说明纳米粒与游离白蛋白结构相似，表明纳米粒表层的蛋白质仍维持白蛋白的二级结构。

因此，通过透射电镜、X射线衍射、X射线光电子能谱、圆二色谱等方法表征，证明本发明所得的是：核壳型结构的白蛋白纳米粒，尺寸为（4.54 ± 0.82）nm，内核含有硫化铋/氧化钆，外层为保持活性的白蛋白。

3. 白蛋白复合纳米粒DCNPs的紫外-可见吸收图谱考察：

配制1 mmol·L^-1的溶液，对其在400~800 nm波长范围内吸收进行扫描，结果如图3，可见纳米粒吸收图谱表现出拥有广泛吸收且无特征吸收峰的特点，而在700~800 nm的近红外吸收区域也有一定的吸收，为后续光热治疗奠定了基础。

4.白蛋白复合纳米粒DCNPs的体外升温效应考察：

按铋元素含量计，将白蛋白复合纳米粒分别制备成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mmol·L^-1的溶液，采用激光器 (785 nm ，1.5 W/cm²) 照射5 min，每隔30 s记录溶液的温度。结果如图4，可见纳米粒的光热效应具有浓度依赖性，浓度增加，升温效果明显增加，当纳米粒的浓度在0.5 mM时温度升高超过34℃，当纳米粒的浓度在1.0 mM时温度升高超过40℃，在2.0 mM时温度升高超过60 ℃，预示纳米粒有着良好的光热治疗前景。

5.白蛋白复合纳米粒DCNPs的光热转换效率考察：

制备纳米粒水溶液（0.5 mL，以铋元素浓度0.5 mmol·L^-1计），对其进行激光照射（785nm，1.5 W/cm²）600 s后，发现水溶液温度趋于平稳，撤去激光器使其自然冷却至室温，期间每30 s对温度进行记录，结果如图5，并采用以下公式计算光热转换效率：

计算得到纳米粒的光热转换效率为42.65%，远高于文献报道的光热材料如金棒等，表明本发明所制备的纳米粒具有较为理想的光热转换效率。

6.白蛋白复合纳米粒DCNPs的体外光稳定性考察：

同前制备纳米粒水溶液（0.5 mL，以铋元素浓度0.5 mmol·L^-1计），分别放置于7个2mL的EP管中，分别对这7个样品进行785 nm（1.5 W·cm^-2）照射0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 min，在785 nm处测定紫外-可见吸收图谱，并进行比较。光照时间对升温的影响结果如图6A，可见纳米粒照射不同时间后，其吸收值变化不大，具有较好的光稳定特性。并且，经反复升温实验考察光照次数对升温的影响结果如图6B，可见每次光照5 min后，升温的最高温度几乎完全保持一致。以上结果均表明纳米粒具有良好的光稳定性，为后期的光热治疗奠定了基础。

7.白蛋白复合纳米粒DCNPs的细胞毒性进行考察：

取对数生长期的4T1细胞铺96孔板，接种密度为10⁵个/mL，每孔100 μl，放入细胞培养箱恒温培养24 h，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用PBS洗1~2次，加入用培养基配好的纳米粒，每孔100 μl，给药浓度梯度为0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mmol·L^-1（仍以铋元素浓度计算），每个浓度4复孔。放入培养箱培养24 h后，更换培养液，光照组每孔分别在785 nm，1.5 W·cm^-2条件下，光照3 min（另有不光照组作为对照组），放回培养箱中继续培养24 h，加10 µl5 mg·mL^-1 MTT的PBS溶液，4 h后弃去培养液，加入100 µl DMSO，振荡10 min后，用酶标仪于490 nm测定吸光度值，结果如图7，可见在光照条件下，纳米粒对细胞产生杀伤作用，具有浓度依赖性。并且，算得纳米粒的IC₅₀为0.71 mM。

8. 白蛋白复合纳米粒DCNPs的体内组织分布考察

（1）肿瘤模型的建立：取对数生长期的鼠源性乳腺癌4T1细胞，调整细胞悬液浓度为2 ´10⁶ 个 /mL，每只Balb/c小白鼠皮下注射50 mL，建立小鼠皮下肿瘤模型，待肿瘤生长至大小为60~100 mm³时使用。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积 = (长×宽²)/2。

（2）以接种肿瘤的小鼠为实验模型动物，通过尾静脉注射方式将纳米粒溶液注入小鼠体内，纳米粒给药浓度仍以铋元素浓度计，浓度为20 mmol·kg^-1。给药后12 h处死小鼠，取出主要组织器官：心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤部位，将各组织器官用浓硝酸消解完全后，采用ICP-MS对溶液中的铋Bi进行定量，计算出纳米粒在小鼠各组织器官中的分布情况，结果如图8，可见纳米粒在肿瘤部位由相当量的分布；同时因非光照条件下纳米粒不产生毒性，而于其他组织无碍。

9. 白蛋白复合纳米粒DCNPs的体内抑瘤效果考察

用“8（1）”方法构建荷瘤鼠模型后，对成功荷瘤的小鼠（肿瘤大小约60~100 mm³，逐只测量）随机分组，并经尾静脉注射纳米粒进行治疗，每组5只，治疗组及对照组具体如下：

（1）生理盐水非光照组（PBS）

（2）生理盐水/光照组（PBS/Irradiation）

（3）纳米粒非光照组（20 mmol·kg^-1 ）

（4）纳米粒（5 mmol·kg^-1）/光照组（5 mmol·kg^-1/Irradiation）

（5）纳米粒（10 mmol·kg^-1）/光照组（10 mmol·kg^-1/Irradiation）

（6）纳米粒（20 mmol·kg^-1）/光照组（20 mmol·kg^-1/Irradiation）

各光照组，均在给药12 h后，对肿瘤部位进行激光照射（785 nm，1.5 W·cm^-2，5 min）。在抑瘤实验过程中，定期采用游标卡尺测量记录肿瘤实际大小，并按照公式计算肿瘤体积：

V（肿瘤体积）= L（肿瘤最长径）× W（垂直于最长径的肿瘤的最宽径）²/2

将所算得的肿瘤体积与实验初始时肿瘤体积进行归一化处理后，绘制观察期内肿瘤生长曲线。观察期结束后将实验鼠处死，取出肿瘤组织并拍摄离体的瘤体照片。结果测得肿瘤生曲线如图9A，抑瘤实验后的瘤体照片如图9B。注射PBS组第30 d肿瘤大小显示与其原始体积相比肿瘤体积增加约20倍，注射PBS加光照组肿瘤体积增长趋势与PBS组保持一致，表明肿瘤的生长在单纯光照或不光照时一致，单纯光照的影响可以忽略。在无光照情况下，注射高浓度纳米粒（以铋元素浓度计，20 mmol·kg^-1）组，显示与PBS组的肿瘤生长情况类似，未影响肿瘤生长，表明纳米粒此时没有活性。但是，当光照后，即使剂量为5.0 mmol·kg^-1 的纳米粒已导致肿瘤快速消融，而在光照后16 d出现明显的肿瘤再生，在第30 d肿瘤体积显示与原始体积相比约增加11倍。但是，较高剂量（10.0、20.0 mmo·kg^-1）的纳米粒组，光照后导致肿瘤快速完全消融，而没有任何复发（肿瘤温度升高18.7 ℃可看作是没有复发的肿瘤消融的阈值），说明本发明纳米粒具有很好的肿瘤治疗效果。

10. 白蛋白复合纳米粒DCNPs的多模态成像效果考察

（1）纳米粒的近红外荧光成像效果考察：为考察纳米粒被动靶向至肿瘤部位的能力，将纳米粒表面偶联荧光染料Cypate用于近红外荧光成像。以“8（1）”方法接种肿瘤的Balb/c小鼠为实验模型，尾静脉分别注射相同剂量的Cypate标记的白蛋白复合纳米粒溶液和游离Cypate（以Cypate计，给药浓度为 7.5 mg·kg^-1）。在给药后0、6、12、24、48、72 h，腹腔注射3.5 %水合氯醛溶液麻醉小鼠，置于IVIS Lumina II小动物活体荧光成像系统扫描，运用波谱分离软件去除组织自身及食物等干扰荧光，记录给药不同时间的荷瘤鼠成像图片（图10A）及肿瘤荧光强度数据（图10B）。结果发现，注射游离Cypate的小鼠6~72 h内，仅前期有极弱的近红外荧光信号。而注射Cypate标记的纳米粒的小鼠6~72 h均有荧光信号，荧光由强至弱具有时间依赖性，二者区别明显，说明游离Cypate的消除速度极快，本发明纳米粒极大地提高了肿瘤部位的靶向性和近红外荧光成像的效果，有利于对肿瘤进行超灵敏定位，可用于指导光热治疗，并有利于实现光热治疗的高效低毒目标。

（2）光声成像：利用光局部温度升高触发组织的热弹性膨胀随后向外辐射声波，导致光声成像具有微观水平上的解剖定位以及较好的空间分辨率。本发明以荷瘤鼠为实验模型，尾静脉注射纳米粒溶液（以铋元素计，给药浓度为20 mmol·kg^-1），分别在给药后0、2、4、8、12、24 h将小鼠肿瘤部位置于3-D小动物光声成像系统（Endra Nexus 128）中观察，所选激发波长为800 nm。纳米粒的光声成像能力如图11A，在注射纳米粒之前仅观察到肿瘤部位仅有微弱的光声信号，可能与其脉管中含有氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白有关。随着注射后时间的推移，肿瘤部位的光声信号显示纳米粒分布更均匀，更深地从微血管渗透到肿瘤中，这得益于本发明纳米粒的较小尺寸。当注射纳米粒后12 h，肿瘤部位的光声信号增强到注射前的1.4倍（详见图11B），再次证明纳米粒在肿瘤部位的靶向蓄积和强烈的光声效应，而且由其介导的光声成像具有成为一种具有精确的解剖学定位和高空间分辨率的可视化微观结构（固体肿瘤及内部微血管）监测技术的潜力。

（3）磁共振成像：因钆元素才能成像，故将游离Gd-DTPA和纳米粒溶液经尾静脉注射给药进入荷瘤鼠体内，给药浓度以Gd计，浓度为20 mmol·kg^-1。在给药0、2、12、24 h，用1.5 T磁场强度的磁共振扫描仪对小鼠进行断层扫描，具体实验操作参数为：重复时间/回波时间：400/ 10 ms，矩阵：256 × 256，层数：3，层厚：2 mm，平均次数：4，扫描视野：60 ×60，并用软件测量肿瘤部位的磁共振信号强度，结果如图12A，可见注射纳米粒后肿瘤部位的亮度在0~12 h随时间延长而增加，而对照组钆的螯合物（钆-二乙烯三胺五乙酸，Gd-DTPA）在肿瘤部位亮度没有显示出明显变化，注射白蛋白复合纳米粒的肿瘤造影效果明显优于对照Gd-DTPA。肿瘤处的MR信号强度表现出时间依赖性，量化后的图12B更为清楚地显示了该结果。信号最大值时（注射后12 h）比注射前的强度增强约1.5倍，说明本发明纳米粒有效提高了空间分辨率，具有可替代现有T₁加权成像造影剂的潜力。

（4）X射线计算机断层扫描：经纳米粒CT成像可以获得肿瘤宏观水平的解剖学信息。分别将纳米粒溶液和对照用游离碘普罗胺（二者剂量相当，分别以碘普罗胺的I和纳米粒的Bi计算，给药浓度为125 mmol·kg^-1），注入荷瘤鼠的瘤体内，在给药0、5、30、60、120min后，通过医用CT扫描仪（Discovery CT750 HD System，GE）对小鼠进行扫描，并用软件测量肿瘤部位的CT信号强度，图13A为重建的小鼠三维图像，在注射白蛋白复合纳米粒后5~120 min观察时间内，肿瘤部位的图像亮度显著增强。而碘普罗胺对照组亮度明显较弱。信号量化后得到的图13B，也显示出注射纳米粒小鼠的肿瘤部位CT信号强度明显高于用碘普罗胺的信号强度，其原因除了碘元素和铋元素的X射线衰减系数差异外，仍然体现了纳米粒的肿瘤靶向性和良好的滞留性，说明了本发明的纳米粒能够提供使肿瘤部位的宏观空间分辨率增强的解剖学定位，从而提高肿瘤诊断的准确性。

（5）热成像：用热成像实验进一步考察纳米粒在荷瘤鼠体内的升温情况。尾静脉注射不同浓度的纳米粒溶液至小鼠体内，给药浓度以铋元素计，分别为5、10、20 mmol·kg^-1。给药后12 h，采用激光器（785 nm，1.5 W·cm^-2）对分别肿瘤部位进行激光照射、5 min，同时使用热成像仪记录荷瘤鼠肿瘤部位在5 min中的温度变化情况，以注射PBS的荷瘤小鼠作为对照。在激光照射 2 min、5 min分别拍照，结果如图14A，可见PBS对照组的肿瘤部位仅有微弱的升温，说明近红外光加热组织的能力可以忽略。而纳米粒可显著促进肿瘤部位的升温，且浓度越高、时间越长升温效应越显著。并且，将各时间点的温度升高值（实测温度减去PBS的温度）对时间作图，结果为非常规律的升温曲线，如图14B，光照后纳米粒导致的温度升高具有很好的浓度依赖性和时间依赖性。剂量为5.0、10.0、20.0 mmol·kg^-1的纳米粒，可分别使肿瘤局部温度升高13.1、18.7、27.5 ℃，说明本发明的纳米粒在光照下可显著升高肿瘤局部，光热转化效率较高，热成像效果好，而且有益于实现体内肿瘤光热治疗。

因此，本发明白蛋白复合纳米粒，具有很好的肿瘤治疗效果，并且可用于近红外荧光成像，光声成像、磁共振成像、CT成像和热成像的多模态互补肿瘤诊断，能够较为理想地实现精准的肿瘤诊疗一体化。同时，应当指出，基于本发明的技术原理，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

实施例二

在实施例一中制备白蛋白复合纳米粒时，将牛血清白蛋白浓度调节至10、25、75、100mg·mL^-1，其他步骤同实施例一，可制得稳定性更佳的白蛋白复合纳米粒，用激光粒度仪25℃测得该法制备的白蛋白复合纳米粒的粒径都在5nm左右，铋元素含量为0.5 mmol·L^-1的水溶液在激光下（785 nm，1.5 W·cm^-2）照射300 s后可分别升温30℃、31℃、31℃、31℃；光热转换效率分别为41.98%、42.03%、41.87%、40.16%；都可用于多模态成像。

实施例三

将实施例一中白蛋白复合纳米粒的制备过程中反应体系调节至pH 8、10、13，其他步骤同实施例一；随着反应体系中水相pH的增加，可调节白蛋白复合纳米粒在800~1200 nm近红外区域吸收的强弱，可制得稳定性更佳的白蛋白复合纳米粒，用激光粒度仪25 ℃测得该法制备的白蛋白复合纳米粒的粒径都在5nm左右，铋元素含量为0.5 mmol·L^-1的水溶液在激光下（785 nm，1.5 W·cm^-2）照射300 s后可分别升温30 ℃、30 ℃、31℃；光热转换效率分别为42.18%、42.33%、42.37%；都可用于多模态成像。

实施例四

将实施例一中白蛋白复合纳米粒的制备过程中反应温度调节至25、55℃，其他步骤同实施例一，可制得稳定性更佳的白蛋白复合纳米粒，用激光粒度仪25 ℃测得该法制备的白蛋白复合纳米粒的粒径都在5nm左右，铋元素含量为0.5 mmol·L^-1的水溶液在激光下（785nm，1.5 W·cm^-2）照射300 s后可分别升温28℃、31℃；光热转换效率分别为40.08%、41.17%；都可用于多模态成像。

实施例五

将实施例一中白蛋白复合纳米粒的制备过程中反应时间调整为8h。随着反应时间的变化，制备出来的白蛋白复合纳米粒在近红外区吸收逐渐变化，直至反应时间为12 h时，近红外区吸收达到最大，用激光粒度仪25 ℃测得8小时制备的白蛋白复合纳米粒的粒径为5nm，铋元素含量为0.5 mmol·L^-1的水溶液在激光下（785 nm，1.5 W·cm^-2）照射300 s后可升温31 ℃。

实施例六

将实施例一中白蛋白复合纳米粒的制备过程中，调节铋元素与钆元素的比例为0.5、2、4.05，其他条件与同实施例一，可制得稳定性更佳的白蛋白复合纳米粒，用激光粒度仪25℃测得该法制备的白蛋白复合纳米粒的粒径都在5nm左右，铋元素含量为0.5 mmol·L^-1的水溶液在激光下（785 nm，1.5 W·cm^-2）照射300 s后可分别升温25℃、29℃以及32.5℃；光热转换效率分别为38.82%、40.07%以及41.21%；都可用于多模态成像。

因此，本发明创新性地设计和制备了一种具有近红外光热效应和多模态成像功能的硫化铋/氧化钆双成分白蛋白复合纳米粒，可以多手段诊断提高准确率，并能有效发挥光热治疗效果，尤其是可以经过肾排出体外，解决了现有技术长期存在的无机药物无法有效排出体外的难题；将其应用于肿瘤的诊断和治疗，取得了非常突出的效果。

Claims

1.一种具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒，其特征在于：所述复合纳米粒包括复合粒子与蛋白；所述复合粒子包括硫化铋、氧化钆；所述复合纳米粒的直径为3～5.5 nm。

2.根据权利要求1所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒，其特征在于：所述蛋白为白蛋白；所述蛋白为纳米骨架；所述复合纳米粒的铋源是五水合硝酸铋，钆源是六水合氯化钆。

3.一种具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）将步骤（2）反应后的溶液用8000~140000截留分子量透析袋透析24~48h，得到透析后的纳米粒；然后使用截留分子量为10 kD~200 kD的超滤管对透析后的纳米粒进行超滤离心纯化，得到具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒。

4.根据权利要求3所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒的制备方法，其特征在于：所述混合溶液中，铋元素、钆元素摩尔比例为1:（0.5～5）；所述蛋白为白蛋白；所述铋源是五水合硝酸铋，钆源是六水合氯化钆；所述铋源溶液与蛋白溶液的体积比是1:5；所述钆源溶液与蛋白溶液的体积比是1:5；所述pH调节溶液为NaOH溶液；所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒的直径为3～5.5 nm。

5.根据权利要求3所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒的制备方法，其特征在于：所述透析以去离子水为接收介质；所述超滤离心的转速为2000~5000 r·min^-1。

6.权利要求1所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的超小蛋白复合纳米粒在制备肿瘤诊疗一体化用具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂为近红外光热治疗试剂、近红外荧光成像探针、光声成像探针、磁共振成像造影剂和X射线计算机断层扫描成像（CT）造影剂中的一种或几种。

8.一种具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（4）将步骤（3）制备的具有近红外光热效应和多模态成像功能的蛋白复合纳米粒与分散介质混合，得到具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂。

9.根据权利要求8所述的制备方法制备的到具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂。

10.权利要求9所述具有近红外光热效应和多模态成像功能的试剂在制备肿瘤诊疗一体化药物中的应用。