CN113855645A - 一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体及其制备方法与应用 - Google Patents
一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体及其制备方法和应用，包括外层功能化蛋白质纳米粒以及内部油相材料，采用探头超声乳化法一步制备获得核壳型组装体，功能化蛋白质纳米粒组装在油相材料外侧形成壳结构；该核壳型组装体具有核‑壳结构，可以任意替换组装单元和内部油相，使其具有肿瘤的光热治疗、化疗等肿瘤的治疗功能，及肿瘤的磁共振成像、超声成像等肿瘤的多模态成像诊断功能。该核壳型组装体模板具有制备方法简单、可灵活替换组装单元、可增强蛋白质纳米粒基础功能等特点，为肿瘤的高效成像和治疗提供了一个新的药物模板。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术，具体涉及一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法及应用。
背景技术
癌症严重威胁着人类的生命与健康，是世界范围内最致命的疾病之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。化疗是目前临床治疗恶性肿瘤的主要方法，但仍面临着选择性差、疗效有限及毒副作用大等缺点（Elsevier,2011,3rdEdition）。近年来，随着纳米技术的发展，越来越多的科研工作者将其应用于肿瘤的治疗和预后，并取得了一些突破性的进展，这其中就包括开发了一些具有光热效应、磁共振效果及包载传统化疗药物的纳米载体等诸多纳米药物体系。这些药物体系可以利用光热效应，通过近红外激光的照射使肿瘤局部温度升高达到消融肿瘤的效果；可以利用磁性元素锰、钆等通过磁共振成像实现肿瘤的可视化，从而指导肿瘤的治疗；也可以利用聚合物胶束、脂质体以及纳米乳等一些药物载体实现难溶性药物的体内输送。
有研究发现，将两亲性嵌段共聚物与金纳米粒配位偶联，形成两亲性等离子体类胶束纳米粒，能够在溶液中自组装。通过改变金纳米粒核的粒径和嵌段共聚物疏水片段的长度，可以控制类胶束纳米粒的组装形态，包括单体，簇和囊泡（J.Am.Chem.Soc.2013,135,7974-7984）。组装体中单个金纳米粒彼此紧密规律排列，产生局部等离子共振耦合效应，使得金纳米粒的吸收峰红移并能显著增强金纳米粒的光热效果。除了纳米粒的自组装，还可以通过金纳米粒偶联十二硫醇，利用光敏感基团巯基在紫外光的照射下氧化成亲水性的磺酸基，实现十二硫醇在纳米粒表面的重新排列（Adv.Mater.2014,26,5613–5618），进行光照响应性下的自组装。除此之外，具有温度响应性的聚N-异丙基丙烯酰胺（poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAM）纳米凝胶可以在超声的条件下排列在油水界面，形成固体颗粒稳定油水界面的Pickering乳剂，实现纳米凝胶的超声乳化组装。其组装体内部可以包载难溶性抗肿瘤药物，利用聚N-异丙基丙烯酰胺的温度响应性，实现药物的控制释放。
这些纳米药物体系在一定程度上实现了肿瘤的诊断或消除，但是仍然面临着功能单一，制备复杂等缺点。如何解决纳米载药系统功能单一，可控释药等缺点，是目前治疗肿瘤的纳米药物的研究热点。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种简单可控的基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法及应用。
为达到上述发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体，包括外层功能化蛋白质纳米粒以及内部油相材料；所述功能化蛋白质纳米粒包括蛋白质与纳米药物。本发明所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体由功能化蛋白质纳米粒作为外层和其内部油相材料组成；功能化蛋白质纳米粒由蛋白质与纳米药物组成。
本发明将具有某种功能的纳米粒进行组装，不仅可以控制核壳型组装体的形态，改变纳米粒的粒径，也增强其原有的功能，实现更有效的抗肿瘤效果；通过组装的方法将具有某种特定功能的纳米粒制备成核壳型组装体，不仅可以实现抗肿瘤药物在体内的可控释放，而且组装体较单一纳米粒相比还可能具有更为优越的性能。在积极研究创新下，本发明公开了一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体，实现纳米粒的更简便可控组装，并应用于肿瘤的成像诊断和治疗。
本发明公开了上述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法，包括以下步骤，将纳米药物沉淀在蛋白质内，形成功能化蛋白质纳米粒；将功能化蛋白质纳米粒水溶液与油相材料混合后乳化，得到基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体。本发明采用的制备方法为探头超声乳化法、高压均质或者高速剪切，得到的基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体结构为核-壳型，粒径为50nm～50μm，比如50nm～500nm；本发明的超声乳化法，方法简便，制备得到的基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体粒径可控，形貌稳定，具有良好的重现性。
本发明中，纳米药物为无机金属化合物或者有机小分子化合物，比如硫化铜、氧化钆、氧化锰、硫化银、阿霉素、顺铂、吲哚菁绿中的一种或几种；蛋白质为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白、铁蛋白中的一种或几种；油相材料包括全氟戊烷、全氟己烷、全氟溴辛烷、角鲨烯、大豆油或玉米油。
本发明中，将纳米药物或者纳米药物前体、蛋白质在水中搅拌，得到功能化蛋白质纳米粒；优选的，搅拌时的温度为室温～60℃；搅拌时，纳米药物或者纳米药物前体的浓度为0.1mM～100mM，蛋白质的浓度为1mg/mL～50mg/mL；搅拌时，转速为100～2000rpm。具体的，当纳米药物为无机金属化合物时，将纳米药物前体、蛋白质在水中搅拌，得到功能化蛋白质纳米粒；当纳米药物为有机小分子化合物时，将纳米药物、蛋白质在水中搅拌，得到功能化蛋白质纳米粒。所谓纳米药物前体，为制备纳米药物的原料，能够在蛋白质腔内，制备纳米药物，具体选择为常规技术。
上述本发明中，功能化蛋白质纳米粒水溶液中，以纳米药物定量，纳米药物的浓度为0.1mM～10mM，具体的，纳米药物为无机金属化合物时，以金属定量，纳米药物为有机小分子化合物时，以有机小分子定量；功能化蛋白质纳米粒水溶液、油相材料的体积比为（5～500）∶1。超声乳化的功率为100w～800w、时间为1min～10min。
本发明公开了上述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体在制备肿瘤诊断和治疗药物中的应用。本发明制备的基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体可以制备成注射剂，用于静脉注射。
本发明采用水浴搅拌的方法在人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白或铁蛋白等蛋白质空腔内部沉淀硫化铜、氧化钆、氧化锰、硫化银、阿霉素、顺铂、吲哚菁绿等化合物或其结合，形成功能化蛋白质纳米粒；再将功能化蛋白质纳米粒水溶液与油相材料混合后进行乳化，得到功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体。作为示例，外层组装单元包括硫化铜白蛋白纳米粒、氧化钆白蛋白纳米粒、氧化锰白蛋白纳米粒、硫化银白蛋白纳米粒、阿霉素白蛋白纳米粒、顺铂白蛋白纳米粒、吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒、氧化锰转铁蛋白纳米粒中的一种或几种；所述内部油相包括全氟戊烷、全氟己烷、全氟溴辛烷、角鲨烯、大豆油或玉米油等。
本发明首次采用探头超声乳化法，成功制备了基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体，制得的核壳型组装体在水溶液中分散均匀，带有药物的功能化蛋白质纳米粒组装在油相外侧形成壳；核壳型组装体具有规整的形貌，明显的核-壳型结构，均匀的粒径，对肿瘤有显著的靶向性，可以用于肿瘤的成像诊断和治疗。本发明将功能化蛋白质纳米粒稳定组装在油水界面，形成了核-壳型组装体，解决了纳米药物在抗肿瘤应用中功能单一的问题；通过超声乳化法一步制备得到核壳型组装体，较现有纳米药物组装方法简便可控；通过核壳型组装体的设计，可以灵活的选取组装单体和油相，达到兼顾蛋白质纳米粒单体的功能、油相的功能及组装体载药的功能等，与现有核壳型组装体相比，本发明提供的基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体，其显著优势在于：制备工艺简便、结构清晰、尺寸均一、粒径可控、组成灵活可变、功能丰富多样、肿瘤靶向性高等，为核壳型组装体的制备提供了新方法和新机制，为核壳型组装体用于高效的肿瘤成像诊断和治疗奠定了基础。
附图说明
图1为本发明中实施例一制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图2为本发明中实施例二制备的氧化钆白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图3为本发明中实施例三制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的透射电镜图片。
图4为本发明中实施例三制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的动态光散射粒径分布。
图5为本发明中实施例四制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的透射电镜图片。
图6为本发明中实施例四制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的动态光散射粒径分布。
图7为本发明中实施例五制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的透射电镜图片。
图8为本发明中实施例五制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的动态光散射粒径分布。
图9为本发明中实施例六制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图10为本发明中实施例七制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图11为本发明中实施例八制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图12为本发明中实施例九制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图13为本发明中实施例十制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图14为本发明中实施例十一制备的阿霉素白蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图15为本发明中实施例十二制备的氧化锰转铁蛋白纳米粒核壳型组装体的透射电镜图片。
图16为本发明中实施例十三制备的吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的透射电镜图片。
图17为本发明中实施例三制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的场发射扫描透射电镜面扫元素分析。
图18为本发明中实施例三制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的荧光标记共聚焦显微镜图片。
图19为本发明中实施例三制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的光热升温曲线。
图20为本发明中实施例三、四、五制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的光热升温曲线。
图21为本发明中实施例三制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的小鼠乳腺癌4T1光热细胞毒性。
图22为本发明中实施例三制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的小鼠乳腺癌4T1肿瘤模型光热抑瘤曲线（A）和治疗后肿瘤照片（B）。
图23为本发明中实施例十一制备的阿霉素白蛋白纳米粒核壳型组装体的小鼠乳腺癌4T1细胞毒性。
图24为本发明中实施例十一制备的阿霉素白蛋白纳米粒核壳型组装体对小鼠乳腺癌4T1肿瘤模型在30天内的抑瘤曲线图（A）和治疗后肿瘤照片（B）。
图25为本发明中实施例二制备的氧化钆白蛋白纳米粒核壳型组装体的T1弛豫曲线。
图26为本发明中实施例三、四、五制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体的T1弛豫曲线。
图27为本发明中实施例三、四、五制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体对小鼠乳腺癌4T1肿瘤模型磁共振增强成像图片。
图28为本发明中实施例三、四、五制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体对小鼠乳腺癌4T1肿瘤模型磁共振增强成像信噪统计图。
图29为本发明中实施例一制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的体外超声增强造影图片。
图30为本发明中实施例一制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体的小鼠乳腺癌4T1肿瘤模型超声增强造影图片（A）及归一化肿瘤部位信号增强值（B）。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明的原料都是现有产品，具体制备操作以及测试方法为本领域常规方法，符合实验室常规要求。
现有报道用于肿瘤治疗的纳米药物治疗效率低下，而通过纳米粒组装体的制备可以实现肿瘤的多功能诊疗，显著提高治疗效率。但是现有技术制备核壳型组装体，方法繁杂且针对性太强，普适性低；本发明中，氧化钆白蛋白纳米粒、硫化铜白蛋白纳米粒等是一类生物相容性良好的功能化蛋白质纳米粒，将功能化蛋白质纳米粒稳定在油水界面，通过探头超声乳化的方法制备得到功能化蛋白质纳米粒组装体，解决了各类功能化蛋白质纳米粒的功能单一问题，为制备多功能肿瘤诊疗一体化的核壳型组装体药物平台提供参考。本发明基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体制备方法如下：将纳米药物沉淀在蛋白质内，形成功能化蛋白质纳米粒；将功能化蛋白质纳米粒水溶液与油相材料混合后探头超声乳化，得到基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体。具体示例如下：
（1）功能化蛋白质纳米粒的制备：采用水浴搅拌的方法使硫化铜、氧化钆、氧化锰、硫化银、阿霉素、顺铂、吲哚菁绿等化合物结合沉淀在人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白或铁蛋白等蛋白质空腔内部，形成功能化蛋白质纳米粒；
（2）功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备：将功能化蛋白质纳米粒的水溶液与油相混合，然后进行探头超声乳化，得到功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体。
进一步的，本发明基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法可以举例表示为：
1）功能化蛋白质纳米粒的制备：采用25℃～55℃水浴搅拌的方法，使0.1mM～100mM硫化铜（CuS）、氧化钆（Gd2O3）、氧化锰（Mn3O4）、硫化银（Ag2S）、阿霉素（C27H29NO11）、顺铂（PtCl2(NH3)2）、吲哚菁绿(C43H47N2NaO6S2)等化合物中的一种或几种结合沉淀在1mg/mL～50mg/mL的人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白或铁蛋白等蛋白质空腔内部，形成功能化蛋白质纳米粒；其中阿霉素、吲哚菁绿等有机小分子化合物采用该有机小分子为原料；其他的无机金属化合物采用制备该无机金属化合物的物质为原料；
2）基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备：功能化蛋白质纳米粒以纳米药物定量，稀释成浓度为0.1mM～10mM的水溶液，与油相按体积比（5～500）∶1的比例混合，置于探头超声破碎仪中进行超声乳化，超声乳化的功率为100w～800w，时间为1min～10min，在室温下、空气氛围中即可进行。经探头超声后，即得基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体。
实施例一
基于硫化铜白蛋白纳米粒的核壳型组装体制备，其具体步骤如下：
制备硫化铜白蛋白纳米粒：将人血清白蛋白、一水合乙酸铜和九水合硫化钠分别用去离子水溶解配制成水溶液，人血清白蛋白浓度为35mg/mL、一水合乙酸铜浓度为20mM、九水合硫化钠浓度为100mM。在常规搅拌的条件下，先将一水合乙酸铜溶液加入人血清白蛋白溶液中，两者的溶液体积比为1∶5；调节上述混合液的pH至12后加入九水合硫化钠溶液，其溶液体积与一水合乙酸铜溶液体积比为4∶5；然后于55℃搅拌反应4小时，最后用MWCO0.8-1.4KD的透析袋透析24小时，得到硫化铜白蛋白纳米粒；
将上述硫化铜白蛋白纳米粒稀释成铜（Cu）浓度为2mM的水溶液，取3mL再与0.15mL的全氟溴辛烷（PFOB）混合（体积比20:1），形成硫化铜白蛋白纳米粒水溶液、全氟溴辛烷的混合液；
将上述混合液置于探头超声粉碎仪进行超声乳化，超声功率为600w，超声2s，间隔2s，超声总时间为5min，制得硫化铜白蛋白纳米粒包裹全氟溴辛烷的核壳型组装体。
对上述制备的核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图1所示，制得的组装体分散均匀，粒径均一，平均粒径（药物粒径）为277.7nm。
实施例二
制备氧化钆白蛋白纳米粒：将人血清白蛋白、GdCl3·6H2O分别用去离子水溶解配制成水溶液，人血清白蛋白浓度为35mg/mL、GdCl3·6H2O浓度为100mM。在常规搅拌的条件下，将GdCl3·6H2O溶液加入人血清白蛋白溶液中，两者的溶液体积比为1∶9；调节上述混合液的pH至12后于37℃搅拌反应4小时，最后用MWCO0.8-1.4KD的透析袋透析24小时，得到氧化钆白蛋白纳米粒；
将上述氧化钆白蛋白纳米粒稀释成钆（Gd）浓度为2mM的水溶液，取3mL再与0.15mL的全氟溴辛烷（PFOB）混合（体积比20:1），形成氧化钆白蛋白纳米粒水溶液、全氟溴辛烷的混合液；
将上述混合液置于探头超声粉碎仪进行超声乳化，超声功率为600w，超声2s，间隔2s，超声总时间为5min，制得氧化钆白蛋白纳米粒包裹全氟溴辛烷的核壳型组装体。
对制得的氧化钆白蛋白纳米粒组装体进行电镜拍摄，结果如图2所示，制得的组装体平均粒径为255.3nm。
实施例三
取实施例一的硫化铜白蛋白纳米粒、实施例二的氧化钆白蛋白纳米粒在水中混合为Gd/Cu混合液，其中Gd与Cu的物质的量比为3∶7，钆（Gd）浓度为0.6mM，铜（Cu）浓度为1.4mM，总的纳米粒浓度为2mM。取3mL上述Gd/Cu混合液与0.15mL的全氟溴辛烷（PFOB）混合（体积比20:1），形成硫化铜白蛋白纳米粒、氧化钆白蛋白纳米粒、全氟溴辛烷、水的混合液；将该混合液置于探头超声粉碎仪进行超声乳化，超声功率为600w，超声2s，间隔2s，超声总时间为5min，制得氧化钆白蛋白纳米粒和硫化铜白蛋白纳米粒共同包裹全氟溴辛烷的核壳型组装体；
对制得的氧化钆白蛋白纳米粒和硫化铜白蛋白纳米粒共同包裹的核壳型组装体进行电镜拍摄和动态光散射粒径分析，电镜结果如图3所示，制得的组装体呈规整球形；粒径分布结果如图4所示，制得的组装体平均粒径为288.7nm。
根据现有常规方法，将人血清白蛋白、全氟溴辛烷分别用荧光标记，照上步骤，得到荧光标记的核壳型组装体。
实施例四
本实施例步骤与实施例三相同，其区别在于：混合溶液中Gd与Cu的物质的量浓度比为5：5。对制得的氧化钆白蛋白纳米粒和硫化铜白蛋白纳米粒共同包裹的核壳型组装体进行电镜拍摄和动态光散射粒径分析，电镜结果如图5所示，制得的组装体呈规整球形；粒径分布结果如图6所示，制得的组装体平均粒径为280.9nm。
实施例五
本实施例步骤与实施例三相同，其区别在于：混合溶液中Gd与Cu的物质的量浓度比为7：3。对制得的氧化钆白蛋白纳米粒和硫化铜白蛋白纳米粒共同包裹的核壳型组装体进行电镜拍摄和动态光散射粒径分析，电镜结果如图7所示，制得的组装体呈规整球形；粒径分布结果如图8所示，制得的组装体平均粒径为275.1nm。
实施例六
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将硫化铜白蛋白纳米粒水溶液与全氟溴辛烷的体积比换成5∶1。对制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图9所示，制得的组装体分散均匀，粒径均一，平均粒径为450.6nm。
实施例七
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将硫化铜白蛋白纳米粒水溶液与全氟溴辛烷的体积比换成10∶1。对制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图10所示，制得的组装体分散均匀，粒径均一，平均粒径为331.6nm。
实施例八
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将硫化铜白蛋白纳米粒水溶液与全氟溴辛烷的体积比换成50:1。对制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图11所示，制得的组装体分散均匀，粒径均一，平均粒径为273.2nm。
实施例九
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将全氟溴辛烷替换为同体积的全氟戊烷（PFP）。对制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图12所示，制得的组装体分散均匀，粒径均一，平均粒径为330.2nm。
实施例十
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将全氟溴辛烷替换成同体积的全氟己烷（PFH）。对制备的硫化铜白蛋白纳米粒核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图13所示，制得的组装体分散均匀，粒径均一，平均粒径为272.4nm。
实施例十一
制备阿霉素白蛋白纳米粒：将人血清白蛋白、盐酸阿霉素和硫酸铵分别用去离子水溶解配制成水溶液，人血清白蛋白浓度为10mg/mL、盐酸阿霉素浓度为1mM、硫酸铵浓度为100mM。在常规搅拌的条件下，先将硫酸铵溶液加入人血清白蛋白溶液中，两者的溶液体积比为1∶5；随后加入盐酸阿霉素溶液，其溶液体积与硫酸铵溶液体积比为1∶1；调节上述混合液的pH至7.4后于37℃搅拌反应2小时，最后用MWCO0.8-1.4KD的透析袋透析24小时，得到阿霉素白蛋白纳米粒；
将上述阿霉素白蛋白纳米粒稀释成阿霉素浓度为2mM的水溶液，取3mL再与0.15mL的全氟溴辛烷（PFOB）混合（体积比20:1），形成阿霉素白蛋白纳米粒水溶液、全氟溴辛烷的混合液；将上述混合液置于探头超声粉碎仪进行超声乳化，超声功率为600w，超声2s，间隔2s，超声总时间为5min，制得阿霉素白蛋白纳米粒包裹全氟溴辛烷的核壳型组装体。
对制得的阿霉素白蛋白纳米粒核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图14所示，制得的组装体平均粒径为253.7nm。
实施例十二
制备氧化锰转铁蛋白纳米粒：将转铁蛋白、高锰酸钾分别用去离子水溶解配制成水溶液，转铁蛋白浓度为20mg/mL、高锰酸钾浓度为50mM。在常规搅拌的条件下，将高锰酸钾溶液加入转铁蛋白溶液中，两者的溶液体积比为1∶20；调节上述混合液的pH至10后于37℃搅拌反应2小时，最后用MWCO0.8-1.4KD的透析袋透析4小时，得到氧化锰转铁蛋白纳米粒；
将上述氧化锰转铁蛋白纳米粒稀释成锰（Mn）浓度为5mM的水溶液，取3mL再与0.1mL的角鲨烯混合（体积比30:1），形成氧化锰转铁蛋白纳米粒水溶液、角鲨烯的混合液；
将上述混合液置于探头超声粉碎仪进行超声乳化，超声功率为500w，超声3s，间隔2s，超声总时间为7min，制得氧化锰转铁蛋白纳米粒包裹角鲨烯的核壳型组装体。
对制得的氧化锰转铁蛋白纳米粒核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图15所示，制得的组装体平均粒径为148.9nm。
实施例十三
制备吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒：将人血清白蛋白、盐酸阿霉素和吲哚菁绿分别用去离子水溶解配制成水溶液，人血清白蛋白浓度为10mg/mL、盐酸阿霉素浓度为1mM、吲哚菁绿浓度为1mM。在常规搅拌的条件下，先将吲哚菁绿溶液加入人血清白蛋白溶液中，两者的溶液体积比为1∶5；随后加入盐酸阿霉素溶液，其溶液体积与吲哚菁绿溶液体积比为1∶1；调节上述混合液的pH至8.0后于37℃搅拌反应2小时，最后用MWCO0.8-1.4KD的透析袋透析24小时，得到吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒；
将上述吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒稀释后与实施例二的氧化钆白蛋白纳米粒在水中混合，其中阿霉素与钆的物质的量浓度比为9：1，阿霉素浓度为1.8mM，钆的浓度为0.2mM，总的纳米粒浓度为2mM。取3mL上述吲哚菁绿/阿霉素与氧化钆的混合液与0.15mL的全氟溴辛烷（PFOB）混合（体积比20:1），形成吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒水溶液、氧化钆白蛋白纳米粒水溶液、全氟溴辛烷的混合液；将该混合液置于探头超声粉碎仪进行超声乳化，超声功率为600w，超声2s，间隔2s，超声总时间为5min，制得氧化钆白蛋白纳米粒和吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒共同包裹全氟溴辛烷的核壳型组装体；
对制得的吲哚菁绿/阿霉素白蛋白纳米粒与氧化钆白蛋白纳米粒混合的核壳型组装体进行电镜拍摄，结果如图16所示，制得的组装体平均粒径为280.03nm。
对实施例制备的基于功能化蛋白质纳米粒核壳型组装体进行功能测试，方法如下：
1、对上述制备的纳米粒组装体进行场发射扫描透射电镜面扫元素分析及荧光标记共聚焦显微镜图片拍摄，面扫元素分析结果表明，纳米粒组装体为核-壳型结构；荧光标记的核壳型组装体共聚焦显微镜图片显示结构为核-壳型。作为示例，对实施例三中制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒的共同纳米粒组装体（钆与铜摩尔比为3∶7）进行物理结构测试，具体步骤为：对制备的共同纳米粒组装体进行场发射扫描透射电镜面扫元素分析及荧光标记共聚焦显微镜图片拍摄。面扫元素分析结果（图17）表明，共同纳米粒组装体为核-壳型结构，内部核含有氟（F）元素，外层壳含有铜（Cu）、硫（S）、钆（Gd）元素，证明了该纳米粒组装体为硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒共同稳定在全氟溴辛烷外层形成的核壳型组装体；荧光标记的核壳型组装体共聚焦显微镜图片（图18）显示结构为核-壳型，内部为红色DiI染料标记的全氟溴辛烷，外层为黄绿色FITC染料标记的白蛋白纳米粒。
2、对实施例三中制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒的共同纳米粒组装体（钆与铜摩尔比为3∶7）进行光热效应测试，具体步骤为：以铜定量，将共同纳米粒组装体用去离子水稀释成0.2、0.4、0.8mM的不同浓度（各0.5mL），以去离子水为对照，用785nm激光器对纳米粒溶液辐照，激光功率0.5w/cm2，并测定持续辐照5min内溶液的温度变化，每隔30s记录样品温度，得到光热升温曲线。结果表明（图19），组装体水溶液具有良好的光热效应，且该光热效应具有浓度依赖性。当共同纳米粒组装体浓度为0.4mM时，光照5分钟升温6.6℃；当共同纳米粒组装体浓度为0.8mM时，光照5分钟升温10.3℃，预示纳米粒有着良好的光热治疗前景。
3、对实施例三、四、五中制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒的共同纳米粒组装体（钆与铜摩尔比分别为3∶7、5∶5、7∶3）进行光热升温效应的测试，具体步骤为：以铜定量，将共同纳米粒组装体用去离子水稀释成0.4mM的浓度0.5mL，以去离子水为对照，用785nm激光器对纳米粒溶液辐照，激光功率0.5w/cm2，并测定持续辐照5min内溶液的温度变化，每隔30s记录样品温度，得到光热升温曲线。结果表明（图20），不同Gd/Cu比例制备的组装体水溶液均具有良好的光热效应，与实施例一的组装体近似。
4、对实施例三中制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒的共同纳米粒组装体（钆与铜摩尔比为3∶7）进行光热细胞毒性的测试，具体步骤为：取对数生长期的4T1细胞铺96孔板，接种密度为1×105个/mL，每孔0.1mL，放入细胞培养箱恒温培养12小时、确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗3遍，加入用培养基配好的纳米粒组装体溶液，每孔100微升，浓度以铜计量分别为0.01、0.03、0.05、0.1、0.2mM，每个浓度4个复孔，以不加纳米粒组装体的培养基组作为对照。放入培养箱培养24小时后，弃去含有纳米粒组装体的培养液，用磷酸盐缓冲液洗3遍，加入空白细胞培养基0.1mL，用785nm激光器0.5w/cm2辐照5min/孔。光照后放入培养箱继续孵育24h，弃去培养液，加入含有MTT（5mg/mL）的培养液，继续孵育4h。吸出板中培养液，每孔加入二甲亚砜0.1mL，振荡10min后用酶标仪读板，测定每孔在492nm处的紫外吸光度值，并计算细胞存活率。同时设置同样加药培养的非光照组作为对照。结果如图（21）所示：1）非光照条件下，每组细胞的存活率均在80%以上，提示在该给药浓度范围内，共同纳米粒组装体无明显细胞毒性，具有良好的生物安全性；2）光照条件下，高浓度给药组细胞存活率明显降低，且光照杀伤细胞呈现浓度依赖性，IC50为0.072mM，提示共同纳米粒组装体在被细胞摄取后，仍具有光热效应，可以用于光热杀伤肿瘤细胞。
5、对实施例三中制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒的共同纳米粒组装体（钆与铜摩尔比为3∶7）进行光热治疗肿瘤的测试（PBS为分散介质），具体步骤为：取Balb/c雌性小白鼠荷4T1皮下肿瘤模型7组，每组平行5只，组别为PBS，PBS/光照、30μmolkg-1、10μmol kg-1/光照（5min）、20μmol kg-1/光照（5min）、30μmol kg-1/光照（5min）、30μmolkg-1/光照（10min）。采用尾静脉注射的给药方式，以钆计量，注射药物剂量分别为10、20、30μmol kg-1的共同纳米粒组装体，以PBS组为对照，记录每组给药前的肿瘤初始体积。给药12h后，用785nm激光器对光照组小鼠肿瘤部位辐照5min或10min，激光功率0.5w/cm2。光照治疗后，按一定时间间隔记录每只小鼠的肿瘤长宽径，绘制肿瘤体积变化曲线。25天后，处死小鼠摘取肿瘤并拍摄照片。结果如图（22），其中22A为肿瘤生长曲线，22B为实验结束后肿瘤照片。结果表明：1）PBS和PBS光照组的肿瘤生长曲线及26天后肿瘤生长大小并无明显差别，可以看出在实验的光照条件下，光照处理对小鼠的肿瘤生长并无影响；2）30μmol kg-1给药非光照组的肿瘤生长情况与PBS组类似，说明共同核壳型组装体的单独给药不能抑制肿瘤生长；3）不同剂量的给药光照组（光照5min）对肿瘤的生长起到了不同程度的抑制作用，10μmol kg-1给药光照组在26天后，肿瘤生长了19.3倍，20μmol kg-1给药光照组生长了10.6倍，30μmol kg-1给药光照组生长了4.8倍。可以看出共同纳米粒组装体注射后到达肿瘤部位，对肿瘤进行激光照射，可以使肿瘤升温，给药剂量越高，肿瘤升温越高，对肿瘤的热杀伤效果越强；4）30μmol kg-1剂量组光照10min，可以使肿瘤几乎完全消融，在第15天的时候，组内仅有一只复发，且生长缓慢，显示了良好的肿瘤光热治疗效果。
6、对实施例十一中制备的阿霉素白蛋白纳米粒组装体进行化疗细胞毒性的测试，具体步骤为：取对数生长期的4T1细胞铺96孔板，接种密度为1×105个/mL，每孔0.1mL，放入细胞培养箱恒温培养12小时、确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗1-3遍，加入用培养基配好的纳米粒组装体溶液或游离阿霉素溶液，每孔100微升，浓度以阿霉素计量分别为0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0μg mL-1，每个浓度4个复孔，以不加纳米粒组装体的培养基组作为对照。放入培养箱培养24小时后，弃去含有药物的培养液，PBS洗涤3遍后加入含有MTT（5mg mL-1）的培养液，继续孵育4h。吸出板中培养液，每孔加入二甲亚砜0.1mL，振荡10min后用酶标仪读板，测定每孔在492nm处的紫外吸光度，并计算细胞存活率。结果如图（23）所示，在一定的给药浓度范围内，游离阿霉素组和阿霉素白蛋白纳米粒组装体组均显示，随着浓度的增大，细胞存活率降低，表明阿霉素白蛋白纳米粒组装体具有一定的细胞毒性，可以用于肿瘤的化疗。并且阿霉素白蛋白纳米粒组装体的IC50是0.398μg mL-1，而游离阿霉素的IC50是0.804μg mL-1，表明阿霉素白蛋白纳米粒组装体较游离阿霉素有更强的细胞毒性。
7、对实施例十一中制备的阿霉素白蛋白纳米粒组装体进行化疗抑制肿瘤生长效果的测试（PBS为分散介质），具体步骤为：取Balb/c雌性小白鼠荷4T1皮下肿瘤模型3组，每组平行5只，组别为PBS，游离阿霉素，阿霉素白蛋白纳米粒组装体。采用尾静脉注射的给药方式，以阿霉素计量，注射药物剂量分别为5mg kg-1的游离阿霉素或阿霉素白蛋白纳米粒组装体，每3天给一次药，一共给3次。记录每组给药前的肿瘤初始体积及治疗后，按一定时间间隔记录每只小鼠的肿瘤长宽径，绘制肿瘤体积变化曲线。30天后，处死小鼠摘取肿瘤并拍摄照片。结果如图（24）所示，注射PBS组30天后小鼠肿瘤体积增大了30.68倍，注射游离阿霉素组小鼠肿瘤体积增大了18.33倍，而注射阿霉素白蛋白纳米粒组装体组小鼠肿瘤体积增大了13.14倍，阿霉素白蛋白纳米粒组装体显著抑制了肿瘤生长，比游离阿霉素组具有更好的肿瘤治疗效果。
8、对实施例二中制备的氧化钆白蛋白纳米粒的纳米粒组装体进行弛豫效能r1值的测试，具体步骤为：以钆定量，将纳米粒组装体用去离子水稀释成0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25mM的不同浓度各1.5mL，每个浓度平行3份，以未组装的氧化钆白蛋白纳米粒进行对照，使用磁共振仪(1.5T)对样品进行T1信号的扫描，测定溶液的T1值，并计算纳米粒组装体的弛豫效能r1。结果如图（25）所示，纳米粒组装体的r1值为18.7mM-1s-1，而氧化钆白蛋白纳米粒的r1值为11.2mM-1s-1，表明将氧化钆白蛋白纳米粒进行组装后制备成纳米粒组装体，可以显著提高氧化钆白蛋白纳米粒的弛豫效能，结果预示纳米粒经过组装后形成的纳米粒组装体具有更高的肿瘤磁共振造影信噪比。另外，单独硫化铜白蛋白纳米粒组装体没有磁共振性质。
9、对实施例三、四、五中制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒的共同纳米粒组装体（钆与铜摩尔比分别为3∶7、5∶5、7∶3）进行弛豫效能r1值的测试，具体步骤为：以钆定量，将共同纳米粒组装体用水稀释成0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25mM的不同浓度各1.5mL，每个浓度平行3份，以临床使用的磁共振造影剂马根维显进行对照，使用磁共振仪(1.5T)对样品进行T1信号的扫描，测定溶液的T1值，并计算共同纳米粒组装体的弛豫效能r1。结果如图（26）所示，共同纳米粒组装体的r1值为3∶7组为54.82mM-1s-1，5∶5组为50.91mM-1s-1，7∶3组为43.14mM-1s-1，而马根维显的r1值为4.66mM-1s-1。结果表明：共同纳米粒组装体的弛豫效能显著高于临床使用的马维根显，预示共同纳米粒组装体具有更高的肿瘤磁共振造影信噪比。
作为对比，按照钆与铜摩尔比为3∶7，将实施例一的硫化铜白蛋白纳米粒组装体加入实施例二的氧化钆白蛋白纳米粒组装体中，得到硫化铜白蛋白纳米粒组装体、氧化钆白蛋白纳米粒组装体的物理混合体系，进行同样的测试，发现r1值为26.87mM-1s-1。
10、对实施例三、四、五中制备的硫化铜白蛋白纳米粒和氧化钆白蛋白纳米粒的共同纳米粒组装体（钆与铜摩尔比分别为3∶7、5∶5、7∶3）进行增强肿瘤磁共振成像造影的测试（PBS为分散介质），具体步骤为：取Balb/c雌性小白鼠荷4T1皮下肿瘤模型，采用尾静脉注射的给药方式，以钆计量，注射药物剂量为30μmol kg-1的共同纳米粒组装体，分别在不同时间（0、2、6、12、24h）用临床使用的1.5T磁共振仪器断层扫描，设置参数为TR/TE=400/10ms，256x256matrices，slices=5，thickness=5mm，average=3，FOV=60x60，并以临床使用的磁共振成像造影剂马根维显作对照，计算肿瘤部位磁共振成像信噪比。结果如图27、图28所示，结果表明：1）注射共同纳米粒组装体组肿瘤部位的磁共振信号随着时间延长逐渐变亮，在给药后12h达到最亮，信噪比均高于同剂量的马根维显组，具有明显的肿瘤磁共振造影增强效果；2）钆与铜摩尔比为3∶7的纳米粒组装体在注射后12小时，肿瘤部位信噪比达到178.6%，高于5∶5（152.9%）和7∶3（136.6%）的信燥比，成像效果最好，肿瘤组织与正常组织边界明显。
11、对实施例一中制备的硫化铜白蛋白纳米粒组装体进行体外超声成像造影的测试（PBS为分散介质），具体步骤为：取30×30×30cm的塑料收纳盒，放入超声除气后的常温无气水，待用。以铜计量，将药物浓度为4mM硫化铜白蛋白纳米粒组装体装入直径为5mm的乳胶管，以PBS为对照，提起乳胶管两端，使中间段自然下坠，轻轻放入无气水中，使软管两端置于水面以上，中间段没入水中。用临床使用的超声成像仪探头探测软管中间段的超声信号。结果如图（29）所示，1）PBS组乳胶管内为黑色，没有增强超声造影的效果；2）硫化铜白蛋白纳米粒组装体组乳胶管内呈现亮黄色的超声显影信号，具有增强超声造影的能力。
12、对实施例一中制备的硫化铜白蛋白纳米粒组装体进行肿瘤超声成像造影的测试（PBS为分散介质），具体步骤为：取Balb/c雌性小白鼠荷4T1皮下肿瘤模型，待肿瘤长至150~200mm3时，腹腔注射水合氯醛麻醉，用临床使用的超声成像仪对小鼠肿瘤探头辐照并记录超声回波信号。在持续探头超声辐照的条件下，以铜计量，分别瘤内注射药物浓度为4mM的50μL硫化铜白蛋白纳米粒组装体，并记录瘤内超声信号的变化情况，以PBS为对照。截取注射前、注射后的图像，并圈取信号值。结果如图（30）所示，PBS组瘤内超声造影信号在注射前后无明显变化，均显示黑色背景无增强超声信号。硫化铜白蛋白纳米粒组装体组注射前瘤内为黑色背景无增强超声信号，注射以后注射部位显示白色弥散性超声增强信号，瘤内信号强度提高3.15倍，显示了显著的瘤内超声造影增强效果。
本发明采用功能化蛋白质纳米粒作为组装单元，功能化蛋白质纳米粒水溶液先与油相材料混合，再通过探头超声乳化法一步制备得到基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体。本发明采用与现有核壳型组装体不同的组装机制，有效解决了现有技术进行纳米粒组装通常需要设计特殊的分子结构、无法实现其作为一个组装模板进行不同纳米药物组装的难题。本发明提供的基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体具有制备方法简单可控、组成灵活多变及功能丰富强大的特点，丰富了纳米药物组装体的组装方法，促进了纳米药物在肿瘤诊断和治疗中的应用。
Claims (10)
1.一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体，其特征在于，包括外层功能化蛋白质纳米粒以及内部油相材料；所述功能化蛋白质纳米粒包括蛋白质与纳米药物。
2.根据权利要求1所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体，其特征在于，纳米药物为无机金属化合物或者有机小分子化合物；蛋白质为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白、铁蛋白中的一种或几种；油相材料包括全氟戊烷、全氟己烷、全氟溴辛烷、角鲨烯、大豆油或玉米油。
3.权利要求1所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将纳米药物沉淀在蛋白质内，形成功能化蛋白质纳米粒；将功能化蛋白质纳米粒水溶液与油相材料混合后乳化，得到基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体。
4.根据权利要求3所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法，其特征在于，将纳米药物或者纳米药物前体、蛋白质在水中搅拌，得到功能化蛋白质纳米粒。
5.根据权利要求3所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法，其特征在于，功能化蛋白质纳米粒水溶液中，以纳米药物定量，纳米药物的浓度为0.1mM～10mM。
6.根据权利要求3所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法，其特征在于，功能化蛋白质纳米粒水溶液、油相材料的体积比为（5～500）∶1。
7.根据权利要求3所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体的制备方法，其特征在于，乳化的功率为100w～800w、时间为1min～10min。
8.权利要求1所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体在制备肿瘤诊断和治疗药物中的应用。
9.权利要求1所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体在制备光热药物中的应用。
10.权利要求1所述基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体在制备核磁成像或者超声成像药物中的应用。
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