CN111265495A - 一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒及其制备方法,属于医药技术领域。所述复合纳米粒是采用复乳法制备而成,其以聚乳酸‑羟基乙酸为包裹材料,在其中装载硫化铜纳米粒和卵白蛋白。本发明所得复合纳米粒可生物降解,生物相容性好;光热稳定性好,对机体的副作用小;光热效应和免疫效应共同作用,效果显著优于单一疗法,且对肿瘤转移有抑制作用,在肿瘤治疗领域有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是继心血管疾病之后死亡率最高的疾病。传统的手术、化疗和放疗,不仅对人体有强烈的副作用,如肝毒性、肾毒性、骨髓抑制等,而且治疗效果有限,大部分病人的生存期仅有数年。患者不仅承受了极大的身心痛苦,而且负担了巨额的经济成本。因此,安全、高效的新型肿瘤治疗方法是近年来的研究热点。
肿瘤光热疗法是一种用热疗消融肿瘤的非侵入性方法。在近红外光照射下,光敏剂吸收光子能量产生热量,从而使肿瘤部位升温至42℃以上,导致肿瘤细胞的凋亡或坏死。金属纳米粒是广泛采用的光敏剂,相比常用的金纳米粒,硫化铜纳米粒成本更低;光热效应来源于Cu2+的d-d能级跃迁,光热稳定性更好,不受粒径、形态及复杂的生理环境的影响。尽管光热疗法对原位肿瘤显示了优良的抑制作用,但由于肿瘤易发生转移的特性,单独使用光热疗法不能有效的抑制转移瘤。
免疫疗法通过激活人体的免疫系统,增强效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,因而对肿瘤转移和复发有显著的抑制作用。卵白蛋白是最常用的外源性抗原,经抗原呈递细胞识别、处理、呈递后,可引发效应T细胞的激活和增殖,但抗原呈递细胞对抗原的摄取效率低、抗原易降解等问题,导致免疫效应较弱,对肿瘤的抑制作用不足。
可见,光热疗法和免疫疗法可取长补短,实现转移性肿瘤的治疗。目前,结合硫化铜光热效应和卵白蛋白免疫效应,应用于肿瘤治疗的研究尚未有公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光热效应和免疫效应有机结合的、可治疗转移性肿瘤的载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒及其制备方法。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其是以聚乳酸-羟基乙酸为包裹材料,并在其中装载硫化铜纳米粒和卵白蛋白而制得。
所得复合纳米粒的粒径为50 nm~500 nm,优选为100 nm~200 nm;所述硫化铜纳米粒的粒径为2 nm~40 nm,优选为5 nm~30 nm,其负载量为0.1wt%~4wt%,优选为0.3wt%~2wt%;所述卵白蛋白的负载量为1wt%~30wt%,优选为5wt%~15wt%。
所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为10:90~90:10,优选为25:75~75:25。
所述聚乳酸-羟基乙酸的分子量为10000~100000,优选为20000~50000。
所述载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备硫化铜纳米粒:采用含铜无机盐经常规方法制备硫化铜纳米粒;
(2)制备载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒:将制得的硫化铜纳米粒与卵白蛋白混合(内水相),加入含有聚乳酸-羟基乙酸的有机溶剂(油相),经探头超声后,得到初乳;加入含有聚乙烯醇的水溶液(外水相),再经探头超声后,旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂,得到所述载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒。
步骤(1)中所述含铜无机盐可为氯化铜、硝酸铜、硫酸铜、醋酸铜等。
步骤(2)中所述含有聚乳酸-羟基乙酸的有机溶剂的浓度为3%~10%(w/v),优选为3%~5%(w/v);所述有机溶剂为二氯甲烷或氯仿等,优选为二氯甲烷;所用内水相与油相的体积比为0.05:1~0.4:1,优选为0.1:1~0.2:1;所述含有聚乙烯醇的水溶液的浓度为0.1%~8%(w/v),优选为2%~5%(w/v);所用油相与外水相的体积比为0.1:1~1:1,优选为0.2:1~0.5:1。
本发明制备的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其成本较低;所用材料具有良好的生物相容性和生物可降解性,对正常细胞毒性较低,安全性良好。在近红外光照射下,硫化铜的光热效应不仅可杀死肿瘤细胞,而且可以加速卵白蛋白的释放,增强机体的免疫效应,进一步增强肿瘤治疗效果,特别是对转移瘤产生抑制作用,避免肿瘤的转移和复发。
附图说明
图1为所制备硫化铜纳米粒的透射电镜图。
图2为所制备复合纳米粒的透射电镜图。
图3为硫化铜纳米粒在不同功率近红外光照射下的光热曲线。
图4为不同浓度硫化铜纳米粒的光热曲线。
图5为复合纳米粒的光热曲线。
图6为复合纳米粒中卵白蛋白的体外释放曲线。
图7为复合纳米粒对原位瘤的相对肿瘤体积随时间变化曲线。
图8为复合纳米粒对转移瘤的肿瘤体积随时间变化曲线。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
实施例1
参照文献(Chen F, Hong H, Goel S, et al. In vivo tumor vasculaturetargeting of CuS@MSN based theranostic nanomedicine[J]. ACS Nano, 2015, 9(4):3926-3934)制备硫化铜纳米粒。即取10 mL氯化铜(0.85 mg/mL)和10 mL柠檬酸钠(1 mg/mL),加入30 mL水中,室温搅拌30分钟后,滴入50 μL硫化钠(242.16 mg/mL),搅拌5分钟后,90℃水浴加热15分钟,冷却至室温,用超滤离心管(截留分子量为10000)浓缩后,得到浓度为1.2 mg/mL的含硫化铜纳米粒的溶液。
取200 μL上述制得的含硫化铜纳米粒的溶液,加入10 mg卵白蛋白,溶解后加入1mL含10%(w/v)聚乳酸-羟基乙酸(乳酸:羟基乙酸=20:80,分子量30000)的二氯甲烷溶液中,探头超声(400 W)2分钟,得到初乳,随后加入2.5 mL 4%(w/v)的聚乙烯醇水溶液,继续超声3分钟,采用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂,得到载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其中硫化铜纳米粒的负载量为0.23%,卵白蛋白的负载量为11.22%。
实施例2
参照文献(Zhu Y, Peng J, Jiang L, et al. Fluorescent immunosensor based onCuS nanoparticles for sensitive detection of cancer biomarker[J]. TheAnalyst, 2013, 139(3):649-655)制备硫化铜纳米粒。即将15 mL巯基乙酸加入50 mL 0.2M的硝酸铜溶液中,用0.5 M的氢氧化钠溶液调整pH为9,充氮气30分钟后,滴入5 mM硫化钠溶液,反应24小时后,用超滤离心管(截留分子量为10000)浓缩后,得到浓度为1.2 mg/mL的含硫化铜纳米粒的溶液。
取400 μL上述制得的含硫化铜纳米粒的溶液,加入5 mg卵白蛋白,溶解后加入1mL含8%(w/v)聚乳酸-羟基乙酸(乳酸:羟基乙酸=50:50,分子量50000)的氯仿溶液中,探头超声(400 W)2分钟,得到初乳,随后加入4 mL 2%(w/v)的聚乙烯醇水溶液,继续超声3分钟,采用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂,得到载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其中硫化铜纳米粒的负载量为0.59%,卵白蛋白的负载量为6.53%。
实施例3
参照文献(Dong K, Liu Z, Li Z, et al. Hydrophobic anticancer drug deliveryby a 980 nm laser-driven photothermal vehicle for efficient synergistictherapy of cancer cells in vivo[J]. Advanced Materials, 2013, 25(32):4452-4458)制备硫化铜纳米粒。即将0.1 mmol的硫酸铜加入60 mL 2-丙醇中,再加入0.2 g聚乙烯吡咯烷酮K30和1 mmol的氢氧化钠,磁力搅拌10分钟后,加入0.4 mL 35%的肼溶液,继续搅拌10分钟,12000转/分钟离心收集纳米粒,加入20%的硫化铵溶液,反应1小时后,用超滤离心管(截留分子量为10000)浓缩后,得到浓度为1.2 mg/mL的含硫化铜纳米粒的溶液。
取50 μL上述制得的含硫化铜纳米粒的溶液,加入5 mg 卵白蛋白,溶解后加入1mL含4%(w/v)聚乳酸-羟基乙酸(乳酸:羟基乙酸=80:20,分子量70000)的二氯甲烷溶液中,探头超声(400 W)2分钟,得到初乳,随后加入3 mL 6%(w/v)的聚乙烯醇水溶液,继续超声3分钟,采用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂,得到载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其中硫化铜纳米粒的负载量为0.17%,卵白蛋白的负载量为12.48%。
实施例4
参照文献(Ghaedi M, Khodadoust S, Sadeghi H, et al. Application ofultrasonic radiation for simultaneous removal of auramine O and safranine Oby copper sulfide nanoparticles: Experimental design[J]. Spectrochimica ActaPart A Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2015, 136(11):1069-1075)制备硫化铜纳米粒。即将10 mL醋酸铜溶液(0.1 M)与20 mL柠檬酸钠(0.2 M)溶液混合,加入5 mL硫代乙酰胺(0.4 M),磁力搅拌至变为墨绿色,用超滤离心管(截留分子量为10000)浓缩后,即得浓度为1.2 mg/mL的含硫化铜纳米粒的溶液。
取250 μL上述制得的含硫化铜纳米粒的溶液,加入8 mg卵白蛋白,溶解后加入1mL含5%(w/v)聚乳酸-羟基乙酸(乳酸:羟基乙酸=40:60,分子量20000)的氯仿溶液中,探头超声(400 W)2分钟,得到初乳,随后加入5 mL 3%(w/v)的聚乙烯醇水溶液,继续超声3分钟,采用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂,得到载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其中硫化铜纳米粒的负载量为0.64%,卵白蛋白的负载量为15.36%。
通过以下实验对本发明的应用效果做进一步说明。
1. 将铜网依次浸没在实施例1所制备硫化铜纳米粒或复合纳米粒的稀释液中,经磷钨酸溶液染色、去离子水洗涤、室温下自然干燥后,在透射电子显微镜下观察。由图1可见,硫化铜纳米粒呈球形,粒径约为20 nm;由图2可见,复合纳米粒呈“核壳”结构,中心为硫化铜纳米粒,外部被聚乳酸-羟基乙酸包裹成粒径约为100 nm的纳米粒。
2. 将按实施例1所述方法制备的含硫化铜纳米粒的溶液(浓度为1.2 mg/mL)稀释至50 μg/mL,取200 μL加入96孔板中,用980 nm、不同功率的近红外光照射10分钟,采用红外热成像仪测量温度变化。由图3可见,近红外光的功率越大,硫化铜纳米粒的升温越快。
将按实施例1所述方法制备的的含硫化铜纳米粒的溶液(浓度为1.2 mg/mL)稀释至50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL和200 μg/mL,取200 μL加入96孔板中,用980 nm、1 W/cm2的近红外光照射10分钟,采用红外热成像仪测量温度变化。由图4可见,硫化铜纳米粒的浓度越大,则升温越快。
3. 将200 μL水、空白聚乳酸-羟基乙酸纳米粒和含约150 μg/mL硫化铜的复合纳米粒分别加入96孔板中,用980 nm、1 W/cm2的近红外光照射10分钟,采用红外热成像仪测量温度变化。由图5可见,10分钟时,水和空白聚乳酸-羟基乙酸纳米粒的温度均低于40℃,而复合纳米粒的温度超过60℃。
4. 复合纳米粒中卵白蛋白的体外释放实验。将0.4 mL复合纳米粒加入0.5 mL EP管中,用980 nm、1 W/cm2的近红外光照射10分钟,取出后放入透析袋中,在各时间点取样测定。如图6结果显示,相比无近红外光照射,红外光照射下的卵白蛋白释放明显加快。
5. 复合纳米粒体内原位瘤抑制实验。将100 μL 4T1乳腺癌细胞悬液(含100万个细胞)注射入Balb/c小鼠左侧腋下,构建小鼠原位瘤肿瘤模型,待肿瘤体积达到100 mm3左右时,将小鼠随机分为6组(n=6),分别为:(1) 磷酸盐缓冲液组;(2) 磷酸盐缓冲液+近红外光组;(3) 载卵白蛋白的聚乳酸-羟基乙酸纳米粒组(含卵白蛋白 1000 μg/mL);(4) 硫化铜纳米粒+近红外光组(含硫化铜 100 μg/mL);(5) 复合纳米粒组(含卵白蛋白 1000 μg/mL,硫化铜 100 μg/mL);(6)复合纳米粒+近红外光组(含卵白蛋白 1000 μg/mL,硫化铜100 μg/mL)。依照分组将100 μL相应样品经瘤内注射入肿瘤,在第1、3、5天给药并在给药2h后对相应实验组进行近红外光照射(980 nm,1 W/cm2,10分钟),隔天记录肿瘤的最长径(L)与最短径(W),记录15天,根据公式体积(V)=LW2/2计算小鼠肿瘤体积,绘制小鼠相对肿瘤体积-时间生长曲线。由图7可见,相比于单纯的硫化铜纳米粒+近红外光和载卵白蛋白的聚乳酸-羟基乙酸纳米粒,复合纳米粒经近红外光照射后对原位瘤有更显著的抑制效果。
6. 复合纳米粒体内转移瘤抑制实验。将100 μL 4T1乳腺癌细胞悬液(含100万个细胞)注射入Balb/c小鼠左侧腋下,构建小鼠原位瘤肿瘤模型,待肿瘤长到100 mm3左右时,将小鼠随机分为4组(n=6),分别为:(1) 磷酸盐缓冲液组;(2) 载卵白蛋白的聚乳酸-羟基乙酸纳米粒组(含卵白蛋白1000 μg/mL);(3) 硫化铜纳米粒+近红外光组(含硫化铜100 μg/mL);(4) 复合纳米粒+近红外光组(含卵白蛋白1000 μg/mL,硫化铜100 μg/mL)。依照分组将100 µL相应样品经瘤内注射入肿瘤,在1、3、5天给药并在给药2 h后对相应实验组进行近红外光照射(980 nm,1 W/cm2,10分钟)。治疗第7天,在小鼠右侧腋下打入100 µL 4T1细胞悬液(含30万个细胞)构建小鼠转移瘤模型,隔天记录转移瘤的最长径(L)与最短径(W),记录10天,根据公式体积(V)=LW2/2计算转移瘤体积,绘制小鼠肿瘤体积-时间生长曲线。由图8结果可知,相比于磷酸盐缓冲液组,复合纳米粒经近红外光照射后对转移瘤有显著的抑制作用,而载卵白蛋白的聚乳酸-羟基乙酸纳米粒以及硫化铜纳米粒+近红外光对转移瘤抑制效果不显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1.一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其特征在于,以聚乳酸-羟基乙酸为包裹材料,在其中装载硫化铜纳米粒和卵白蛋白,制得所述复合纳米粒;
所述复合纳米粒的粒径为50 nm~500 nm;所述硫化铜纳米粒的粒径为2 nm~40 nm,其负载量为0.1wt%~4wt%;所述卵白蛋白的负载量为1wt%~30wt%。
2.根据权利要求1所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其特征在于,所述复合纳米粒的粒径为100 nm~200 nm;所述硫化铜纳米粒的粒径为5 nm~30 nm,其负载量为0.3wt%~2wt%;所述卵白蛋白的负载量为5wt%~15wt%。
3.根据权利要求1或2所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其特征在于,所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为10:90~90:10。
4.根据权利要求1或2所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其特征在于,所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为25:75~75:25。
5.根据权利要求1或2所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其特征在于,所述聚乳酸-羟基乙酸的分子量为10000~100000。
6.根据权利要求1或2所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒,其特征在于,所述聚乳酸-羟基乙酸的分子量为20000~50000。
7.一种如权利要求1所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备硫化铜纳米粒;
(2)制备载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒:将制得的硫化铜纳米粒与卵白蛋白混合作为内水相,加入作为油相的含有聚乳酸-羟基乙酸的有机溶剂,经探头超声后,加入作为外水相的含有聚乙烯醇的水溶液,再经探头超声后,蒸发去除有机溶剂,得到所述载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒。
8.根据权利要求7所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒的制备方法,其特征在于,所述含有聚乳酸-羟基乙酸的有机溶剂的浓度为3%~10%(w/v),所述有机溶剂为二氯甲烷或氯仿;所用内水相与油相的体积比为0.05:1~0.4:1;所述含有聚乙烯醇的水溶液的浓度为0.1%~8%(w/v);所用油相与外水相的体积比为0.1:1~1:1。
9.根据权利要求7所述的一种载硫化铜和卵白蛋白的复合纳米粒的制备方法,其特征在于,所述含有聚乳酸-羟基乙酸的有机溶剂浓度为3%~5%(w/v),所述有机溶剂为二氯甲烷;所用内水相与油相的体积比为0.1:1~0.2:1;所述含有聚乙烯醇的水溶液的浓度为2%~5%(w/v);所用油相与外水相的体积比为0.2:1~0.5:1。
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CN113855645B (zh) * | 2021-09-13 | 2024-02-02 | 苏州大学 | 一种基于功能化蛋白质纳米粒的核壳型组装体及其制备方法与应用 |
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Publication number | Publication date |
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CN111265495B (zh) | 2022-08-05 |
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