CN113117078B - 一种肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，所述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN包括共价偶联的芘磺酸盐衍生物GTTN和金纳米簇Au NCs。本发明还公开了上述AuNCs@GTTN的制备方法及其应用。本发明提供的AuNCs@GTTN可以在没有外部光源NIR的作用下达到优异的肿瘤治疗效果的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，恶性肿瘤的发病率逐年提高，癌症已经超过心脑血管疾病成为人类生命健康的重大威胁，是全球第二大致死疾病。尽管科研工作者一直致力于寻找有效的治疗手段，但目前取得的成功还是有限的。随着科学的发展和技术的进步，传统的治疗手段如手术治疗、化疗等取得了有效的进步，但仍存在治疗不彻底、易产生多药耐药性、不良的副作用等问题(Meier JD,Oliver DA,Varvares MA.Surgical margin determination in headand neck oncology:Current clinical practice.The results of an internationalamerican head and neck society member survey[J].Head and Neck,2005,27(11):952-958)。这促使人们开始寻找更加精确、有效的方法来应对癌症，虽然光热疗法作为一种新生疗法开始进入人们的视野，但是大部分PTT是利用高强度或高剂量的近红外辐射在高温下烧伤肿瘤，从而诱导肿瘤细胞凋亡。这至少会导致两种不希望出现的结果，阻止高温PTT的临床转变。
金纳米颗粒作为常见的贵金属光热剂得到了广泛的研究，金纳米簇(Au NCs)(LiY,Jin J,Wang D,et al.Coordination-responsive drug release inside goldnanorod@metal-organic framework core-shell nanostructures for near-infrared-induced synergistic chemo-photothermal therapy[J].Nano Research,2018,11(6):3294-3305)制备方法简单。一般的光热材料是金纳米颗粒，金纳米颗粒由于其独特的光电性能和高催化活性在许多领域得到了应用。与金纳米颗粒相比，金纳米团簇(AuNCs)具有较小尺寸发光和无毒性的特点，在纳米生物领域非常实用。因此，取代激光而治疗肿瘤引起了大家的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN及其制备方法和应用，可以在没有外部光源NIR的作用下达到优异的肿瘤治疗效果的目的。
本发明提供如下技术方案：
一种肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，所述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN包括共价偶联的芘磺酸盐衍生物GTTN和金纳米簇Au NCs，所述AuNCs@GTTN具有式I所示的结构：
所述式I中M为一价金属离子。
对于本发明提供的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN：GTTN和金簇内部原子结合，AuNCs上的羧基和GTTN上的氨基促进Au NCs和GTTN之间的共价偶联。
所述式I中M为K+或Na+。
所述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN中芘磺酸盐衍生物GTTN和金纳米簇Au NCs的质量比为250-625:1。如两者的质量比为15mg-25mg：0.04mg-0.06mg。
优选的，所述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN中芘磺酸盐衍生物GTTN和金纳米簇AuNCs的质量比为250-375:1。上述范围的Au NCs@GTTN具有更好的疗效。
优选的，所述金纳米簇Au NCs的粒径为2-4nm，所述GTTN的粒径为2.5nm-4.5nm，所述Au NCs@GTTN的粒径为15-30nm。
本发明还提供了一种上述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN的制备方法，所述制备方法包括：
(1)将芘和硝酸进行硝化反应后得到的硝基芘、水溶性亚硫酸盐和水混合，进行还原反应，得到芘磺酸盐衍生物GTTN；
所述硝基芘具有式II所示结构：
(2)将四水合氯金酸加入到牛血清白蛋白溶液中，然后加入氢氧化钠溶液中反应，生成金纳米簇Au NCs；
(3)将金纳米簇和芘磺酸盐衍生物混合后搅拌，得到Au NCs@GTTN。
优选的，在步骤(1)中，所述硝化反应的温度为50-80℃，所述还原反应的温度为150-250℃。
优选的，在步骤(2)中，所述四水合氯金酸与氢氧化钠之间的质量比为1：100，反应温度在30-40℃。
优选的，在步骤(3)中，所述金纳米簇和芘磺酸盐衍生物20-30℃下50-60rpm搅拌20-30分钟。
本发明还提供了一种上述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN在制备治疗肿瘤药物中的应用。优选的，所述肿瘤为皮下瘤。
本发明提供的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN在无激光的情况下促使了热休克蛋白的过表达，从而达到治疗肿瘤的效果。
基于取消必要的外部光源(NIR)并达到优异的肿瘤治疗效果的目的，本发明通过使用静电吸附的方式将石墨烯基的肿瘤细胞核靶向荧光纳米探针(GTTN)装载到金纳米簇(Au NCs)上，设计合成了多功能Au NCs@GTTN复合物，其既能荧光成像又能在不使用近红外光源的前提下达到优异的肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为本发明提供的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN的结构示意图；
图2为实施例中GTTN、Au NCs和Au NCs@GTTN的电镜图、紫外图、粒径分布图和电位图；
图3为实施例中GTTN、Au NCs和Au NCs@GTTN对肿瘤治疗效果的示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
将芘(0.5g,TCI，纯度98％)加入HNO3(25mL)中，50-80℃下反应24小时，冷却后用去离子水(DI)洗涤，用膜清洗去酸。残留物被转移到一个Na2SO3(50mL,0.5mol)在20-40℃搅拌20-40分钟。然后在搅拌下，转移到150毫升陶瓷高压蒸汽和加热反应10-15小时。反应后过滤取滤液。得到芘磺酸盐衍生物GTTN。
将四水合氯金酸加入到牛血清白蛋白溶液中，然后加入氢氧化钠溶液37℃，180rpm反应2分钟。然后37℃，140rpm反应12小时。溶液从黄色变成棕红色，在紫外灯下发红光。得到成金纳米簇Au NCs。
将合成好的(40～60ppm)金纳米簇和(15000～25000ppm)GTTN在20-30℃下50-60rpm搅拌20-30分钟，得到Au NCs@GTTN。
如图2所示：图2中的a-c图分别为金纳米簇Au NCs、芘磺酸盐衍生物GTTN和AuNCs@GTTN(40ppm金纳米簇和15000ppmGTTN在20-30℃下50-60rpm搅拌20-30分钟，得到AuNCs@GTTN。然后将液体滴加在铜网上晾干，拍摄透射电镜。)的电镜图；图2中的d图为GTTN、Au NCs和Au NCs@GTTN的紫外图，根据出峰位置可以发现GTTN和Au NCs结合成新材料AuNCs@GTTN；图2中的e-g图分别为GTTN、Au NCs和Au NCs@GTTN的粒径分布图，其粒径分别为3.53±0.66nm、3.27±0.69nm和18.99±2.95nm；图2中的h为GTTN、Au NCs和Au NCs@GTTN的电位图，金纳米簇成正电与负电的GTTN结合形成正电的新材料Au NCs@GTTN。
取生长状态良好的4T1细胞和U251细胞，同细胞传代步骤收集细胞，加入适量培养基重悬细胞，吹吸均匀后计数，调整细胞悬液密度为4×103个/mL，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，放入细胞培养箱中培养24h，在显微镜下观察，细胞铺满70％-75％后，将培养基弃掉，加入不同实验组(a、b、c、d)药物进行处理，空白对照组(control)为只加完全培养基培养的细胞，在培养箱中培养不同时间(12h、24h、48h)。去掉上清，用D-hanks清洗三次，每孔加入100μL配好的CCK-8工作液(培养基稀释10倍)，放入培养箱中孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
(1)Au NCs@GTTN的细胞毒性
设置Au NCs的实验浓度为40mg/L，GTTN的实验浓度为10、30、50、100、300、500mg/L，孵育细胞4和24h，实验重复3次。如图3中的a图所示，为激光和无激光情况下，40ppm金纳米簇与不同浓度GTTN结合之后处理小鼠乳腺癌细胞4小时和24小时之后细胞毒性。
(2)Au NCs的细胞毒性
设置Au NCs的实验浓度为5、10、20、30、40、50、60mg/L，孵育细胞4和24h，实验重复3次。如图3中的b图所示，为激光和无激光情况下，不同浓度金纳米簇对小鼠乳腺癌细胞的细胞毒性。
(3)对热休克蛋白70(HSP70)等基因mRNA表达水平的变化
将2mL GTTN、Au NCs,Au NCs@GTTN加入6孔板，4T1细胞孵育24h。采用RT-qPCR检测不同处理后热休克蛋白70(HSP70)等基因mRNA表达水平的变化如图3中的c图所示。
(4)皮下瘤治疗效果
4T1皮下瘤模型构建：生理盐水，Au NCs,Au NCs@GTTN分为6组，每组5只(健康雌性BALB/c小鼠(四-五周，20±2g))。选取生长良好的BALB/c小鼠(浓度为0.5×107个细胞/小鼠的4T1细胞悬液注射进入小鼠右后肢皮下，生长2-3周)，待其体积生长至90mm3进行下一步实验。每隔一天给药，共6次，第2天给药，并保持1天，最后处死小鼠。给药5min后，用808nmNIR照射肿瘤部位5W 5min。治疗后每隔一天测量肿瘤大小和小鼠体重。取心、肝、脾、肺、肾、脑、瘤器官，用生理盐水稍微清洗，洗掉上面的血。然后称量肿瘤的重量，肿瘤注意去除上面的脂肪。其他器官依次称重，记下重量。
图3中的d图是AuNCs和AuNCs@GTTN尾静脉注射小鼠六次之后，肿瘤的抑瘤率，可以发现加了GTTN之后，AuNCs@GTTN对肿瘤有了治疗效果和单独金纳米簇加了激光后的治疗效果相同。图3中的e图是治疗之后，肿瘤的重量。图3中的f图是治疗之后肿瘤图片。
脏器制成病理切片进行观察。具体步骤如下：将主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)用4％甲醛固定，然后用石蜡进行包埋，将其切成5μm的切片置于载玻片上，用苏木精-伊红(HE)进行染色，置于光学显微镜下进行观察。如图3中的g图和h图所示，g图是治疗之后无激光组心肝脾肺肾脑的病理切片图片，h图是治疗之后激光组心肝脾肺肾脑的病理切片图片。
以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，其特征在于，所述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN包括共价偶联的芘磺酸盐衍生物GTTN和金纳米簇Au NCs，所述GTTN具有式I所示的结构：
所述式I中M为一价金属离子；
所述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN中芘磺酸盐衍生物GTTN和金纳米簇Au NCs的质量比为250-625:1；
所述金纳米簇Au NCs的粒径为2-4nm，所述GTTN的粒径为2.5nm-4.5nm，所述Au NCs@GTTN的粒径为15-30nm；
所述AuNCs@GTTN的制备方法包括：
(1)将芘和硝酸进行硝化反应后得到的硝基芘、水溶性亚硫酸盐和水混合，进行还原反应，得到芘磺酸盐衍生物GTTN；
所述硝基芘具有式II所示结构：
(2)将四水合氯金酸加入到牛血清白蛋白溶液中，然后加入氢氧化钠溶液中反应，生成金纳米簇Au NCs；
(3)将金纳米簇和芘磺酸盐衍生物混合后搅拌，得到Au NCs@GTTN。
2.根据权利要求1所述的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，其特征在于，所述式I中M为K+或Na+。
3.根据权利要求1所述的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，其特征在于，所述肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN中芘磺酸盐衍生物GTTN和金纳米簇Au NCs的质量比为250-375:1。
4.根据权利要求1所述的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，其特征在于，在步骤(1)中，所述硝化反应的温度为50-80℃，所述还原反应的温度为150-250℃。
5.根据权利要求1所述的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，其特征在于，在步骤(2)中，所述四水合氯金酸与氢氧化钠之间的质量比为1：100，反应温度在30-40℃。
6.根据权利要求1所述的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN，其特征在于，在步骤(3)中，所述金纳米簇和芘磺酸盐衍生物20-30℃下50-60rpm搅拌20-30分钟。
7.一种权利要求1-6任一所述的肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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