CN103463643A - 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用，它是将钌无机药物与人血清白蛋白进行孵育后，浓缩其混合物，再用二次去离子水洗涤反复洗涤至DMSO含量＜0.01%，浓缩，制得人血清白蛋白-钌无机药物复合物，再将该复合物制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂，用于治疗乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌或肝癌疾病。本发明复合物具有高的血管通透性和截留率，药物选择性聚集在肿瘤细胞中，对正常细胞没有任何影响，明显提高了钌无机药物的靶向性，大大降低了毒性。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物，具体是人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用。
背景技术
近年来，钌配合物作为新型抗癌药物被人们广泛的研究。钌配合物由于具有独特的物理和化学性质，国际上普遍认为钌配合物属于低毒性，容易吸收并在体内很快排泄。目前已有上百种钌配合物被合成出来，且NAMI-A 和KP1019已完成I期临床试验，正在进入II期临床阶段研究。然而，我们不得不面临一个现实：抗肿瘤无机药物仍然是一把双刃剑，在治疗疾病的同时，不可避免地产生许多副作用，本文中的NAMI-A 和KP1019虽然已完成临床一期，但仍具有很大毒副作用。显而易见，如何提高抗肿瘤药物的智能性是人们真正急需攻克的难题。与正常组织相比，肿瘤组织的血管丰富、结构特殊，一个重要的表现就是血管内皮间隙较大，这是病变情况下大分子可透过肿瘤组织血管壁的原因。白蛋白符合大分子物质在肿瘤组织的透过性增强及滞留( enhancedpermeability and retention，EPR) 效应，所以白蛋白作为药物载体已经在临床上测试扮有日益重要的角色。
发明内容
本发明的目的是提供白蛋白与三种钌无机药物（KP1090、NAMI-A和RIC）复合物的制备、结构以及该复合物在提高肿瘤药物的药效和靶向性方面的应用。
实现本发明目的的技术方案是：
人血清白蛋白-钌无机药物复合物，它是将人血清白蛋白作为钌无机药物靶向生物载体，其制备包括如下步骤：
（1）将钌无机药物与人血清白蛋白孵育；
（2）浓缩；
（3）用二次去离子水洗涤反复洗涤，制得人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用。
本发明所述钌无机药物的结构式为：
其中： (A) NAMI-A； (B) Ru(ind) ；(C) KP1019
所述的孵育过程如下：称取已制备的药物，用DMSO配置成溶液，将药物的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃静置，使两者反应24小时。
本发明人血清白蛋白-钌无机药物复合物的整体结构是心型，六个脂肪酸分子和两个钌无机药物分子不对称的贯穿其中。在人血清白蛋白的IB亚域，三种钌无机药物完全暴露在水环境中，与组氨酸-146配位结合。在IIA 亚域，三种钌无机药物结合在大疏水腔中。KP1019和Ru(ind)中的钌离子（III）与赖氨酸-199和组氨酸-242形成配位键。NAMI-A中的氧原子与组氨酸-242形成氢键。
本发明人血清白蛋白-钌无机药物复合物在抗肿瘤中的应用，是将人血清白蛋白-钌无机药物复合物制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂，用于治疗乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌等疾病，其剂量为：60-100μM/L。
通过体外细胞实验，证明本发明的白蛋白-钌无机药物复合物对肿瘤细胞具有抑制作用，且抑制率相比钌无机药物有明显的提高，且对正常细胞的抑制率明显下降。白蛋白-钌无机药物复合物对肿瘤细胞的凋亡和周期比钌无机药物有明显的促进作用。
本发明的优点是：本发明首先将人血清白蛋白开发为钌无机药物的靶向生物载体，使钌无机药物复合物具有高的血管通透性和截留率，药物选择性聚集在肿瘤细胞中，对正常细胞没有任何影响，明显提高了钌无机药物的靶向性，大大降低了毒性。
附图说明
图1为人血清白蛋白-钌无机药物复合物的电子云密度图：(1) NAMI-A[A：IB亚域；D：IIA亚域];(2) RIC[B：IB亚域；E：IIA亚域] (3) KP1090[C：IB亚域；F：IIA亚域].绿色表示氯原子，黄色表示硫离子，蓝色表示氮原子，红色表示氧原子。
图2为人血清白蛋白-钌无机药物复合物的整体结构. (A) NAMI-A (B) Ru(ind) (C) KP1090；
图3为钌无机药物在白蛋白与的结合位点和结合腔室. A和D：IB亚域；B和C：IIA亚域
图4为 AO/EB双染的细胞形态图： (A)对照组（细胞未加药物） (B) 细胞中加入80μM的KP1019 (C) 细胞中加入80μM的白蛋白-KP1019复合物 (D) 细胞中加入80μM的Ru(ind) (E) 细胞中加入80μM的白蛋白-Ru(ind)复合物.
图5:Annexin V/propidium iodide双染法定量检测药物处理24小时候的细胞凋亡 (A)对照组（细胞未加药物）(B) 细胞中加入80μM的KP1019 (C) 细胞中加入80μM的白蛋白-KP1019 (D) 细胞中加入80μM的Ru(ind) (E) 细胞中加入80μM的白蛋白-Ru(ind).
图6: 流式细胞仪定量检测药物处理48小时候的细胞周期变化(A)对照组（细胞未加药物）(B) 细胞中加入80μM的KP1019 (C) 细胞中加入80μM的白蛋白-KP1019 (D) 细胞中加入80μM的Ru(ind) (E) 细胞中加入80μM的白蛋白-Ru(ind)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：人血清白蛋白-NAMI-A钌无机药物复合物的制备
NAMI-A根据文献制备：1g RuCl3 加入到30ml的乙醇中，回流3小时得到暗绿色溶液，过滤、浓缩至十分之一的初始体积，然后加入1ml浓盐酸和2ml的DMSO中，在80℃中保持15分钟，得到明亮的橙色溶液。冷却溶液至室温，加入10ml丙酮，得橙红色晶体，加入乙醚几滴，加速其结晶，过滤收集。用冷的丙酮20ml洗涤，然后用乙醚洗涤10ml，真空干燥，得1.5g，产率72%。将1.0g的上述产物悬浮在20ml丙酮中，加入0.49g咪唑，搅拌4小时，颜色由橙色变成砖红色，用10ml丙酮和10ml乙醚洗涤，产物在60℃干燥。称取已制备的NAMI-A药物，用DMSO配置成400mM的溶液，将NAMI-A的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃孵育24小时。浓缩HSA与钌无机抗癌药物的混合物，反复用二次去离子水洗涤，使DMSO的含量不超过0.01%，再浓缩至所需体积，即得橙色的白蛋白-钌无机药物复合物。
实施例2： 人血清白蛋白- Ru(ind)钌无机药物复合物的制备
Ru(ind)根据文献制备：60-70℃时0.2g,1.7mmol的吲唑溶解在1ml的2N HCl，2ml的Ru(Ⅲ)溶液加入到热的溶液中，立刻出现红棕色的固体。过滤，乙醇和乙醚洗涤，真空干燥，产物1.82g，产率50%。称取已制备的RIC药物，用DMSO配置成100mM的溶液，人血清白蛋白（HSA）用二次去离子水配制成1.5mM的溶液。将RIC的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃孵育24小时。浓缩HSA与钌无机抗癌药物的混合物，反复用二次去离子水洗涤，使DMSO的含量不超过0.01%，再浓缩至所需体积，即得深红色的白蛋白载体钌无机药物。
实施例3：人血清白蛋白- KP1019钌无机药物复合物的制备
KP1019根据文献制备：70℃时吲唑(0.6g;5.1 mmol)溶解在8ml的12 N HCl中， 2ml的Ru(Ⅲ)溶液加入到热的溶液中，在80-90℃时搅拌15分钟，立刻出现赭石色的物质出现，继续搅拌以除去HCl残基，过滤，乙醇和乙醚洗涤，真空干燥得产物0.296g，产率87%。称取已制备的NAMI-A药物，用DMSO配置成400mM的溶液，人血清白蛋白（HSA）用二次去离子水配制成1.5mM的溶液。称取已制备的KP1019药物，用DMSO配置成100mM的溶液，人血清白蛋白（HSA）用二次去离子水配制成1.5mM的溶液。将KP1019的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃孵育24小时。浓缩HSA与钌无机抗癌药物的混合物，反复用二次去离子水洗涤，使DMSO的含量不超过0.01%，再浓缩至所需体积，即得深绿色的白蛋白载体钌无机药物。
实施例4：人血清白蛋白-钌无机药物复合物的结构测定
将HSA(1.5mM,100μL)、饱和十六脂肪酸（2.5mM,960μL)、药物(100mM,1.5μL)混合，孵育24小时，离心去除沉淀，然后浓缩，并用二次去离子水反复洗涤，最后浓缩至100μL，在坐滴板中，通过气相扩散法（26-30%的PEG3350、5%的甘油、5%的2-甲基-1,3-丙二醇）培养适合X－射线衍射的白蛋白-脂肪酸-金属药物复合物晶体。利用上海同步辐射光源收集晶体数据。用HKL2000对数据进行处理后，采用ccp4的molrep程序，以蛋白质数据库中与该蛋白氨基酸序列同源性强的蛋白作为模板，快速旋转和平移函数的寻找适合的模板，并进行整合。如果现有蛋白质数据库中没有同源性强的蛋白能够作为模板，将采用浸泡重原子的方法确定实验相角，从而建立结构模型。获得电子密度图和合适的坐标文件后,将使用Coot,0等程序对结构进行修正。获得适合的模型后,采用Refmac，Phenix，CNS等程序对结构进行精修。
人血清白蛋白-KP1019、Ru(ind)和NAMI-A的复合物的整体结构是心型，六个脂肪酸分子和两个钌无机药物分子不对称的贯穿其中（图2）。在人血清白蛋白的IB亚域，三种钌无机药物完全暴露在水环境中，与组氨酸-146配位结合。在IIA 亚域，三种钌无机药物结合在大疏水腔中。KP1019和Ru(ind)中的钌离子（III）与赖氨酸-199和组氨酸-242形成配位键（图1和3）。NAMI-A中的氧原子与组氨酸-242形成氢键。
实施例5：钌无机药物/人血清白蛋白-钌无机药物复合物体外对肿瘤细胞增殖的影响
用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中，用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞，将培养板放至CO2培养箱中，于37℃湿润环境中温育，待细胞贴壁，肿瘤细胞中加入上述制备的不同浓度的钌无机药物和白蛋白载体钌无机药物处理48小时后，加入MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐），继续培养4 h后，弃上清，加入100ml的DMSO，于酶标仪570 nm处测光密度值。连续重复3次。得到钌无机药物和白蛋白载体钌无机药物对细胞的半数抑制率值，即IC50。表1显示：相比钌无机药物，白蛋白-钌无机药物复合物对肿瘤细胞的半数抑制率值降低了2-5倍，而对正常细胞HL-7702的半数抑制率值没有影响。
表1：白蛋白-钌无机药物复合物对癌细胞和正常细胞的IC50值
| Drugs/HSA-drugs | MGC-803 | HCT-15 | SKOV-3 | MDA-MB-231 | HL-7702 |
| KP1019 | 158.6±5.9 | 159.3±4.6 | 146.5±7.2 | 110.4±6.3 | 171.6±1.3 |
| KP1019-HSA | 35.3±2.6 | 63.1±5.6 | 50.5±1.7 | 49.4±2.2 | 255.2±1.8 |
| Ru(ind) | 162.9±1.4 | 119.8±3.7 | 124.3±3.9 | 95.1±3.4 | 203.3±2.9 |
| Ru(ind)-HSA | 30.1±3.2 | 65.9±1.2 | 59.2±4.1 | 70.5±5.5 | 245.2±4.7 |
| NAMI-A | — | — | — | — | — |
| NAMI-A-HSA | — | — | — | — | — |
实施例6：钌无机药物/人血清白蛋白-钌无机药物复合物诱导肿瘤细胞凋亡的影响
（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中，用加样器在平底6孔板的各孔中加入2ml细胞悬液，每孔加5×103-100×103 个细胞，将培养板放至CO2培养箱中，于37℃湿润环境中温育，待细胞贴壁，肿瘤细胞中加入上述制备的同样浓度的钌无机药物和白蛋白白蛋白载体钌无机药物处理后，以吖啶橙和溴化乙锭联合对细胞进行染色，利用荧光倒置显微镜，定性检测钌无机药物和白蛋白-钌无机药物诱导肿瘤细胞的凋亡情况。图中对照组（图4A）为绿色，凋亡后为黄绿色，有凋亡小体出现。图4C和4E显示：钌无机药物制成白蛋白载体药物后，图5C和5E，细胞凋亡明显比裸药（图4B和4D）增多；
（2）按上述方法处理细胞以FITC-PI双染，采用流式细胞仪，定量检测在不同浓度和孵化时间下，钌无机药物和白蛋白-钌无机药物对肿瘤细胞早期凋亡情况情况。 图5显示：白蛋白有助于药物促使细胞凋亡。当浓度均为80μM时，钌无机药物对癌细胞的凋亡率为12.3%（图5B和5D），而白蛋白-钌无机药物复合物对癌细胞的凋亡率增加到22.7%（图5C和5E）。
实施例7：钌无机药物/白蛋白-钌无机药物诱导肿瘤细胞增殖周期的影响
按上述方法处理细胞后，以碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）为探针，采用流式细胞仪，定量检测在不同浓度和孵化时间下，无机药物/白蛋白-无机药物对肿瘤细胞周期的抑制情况。图6显示: 药物和白蛋白-药物复合物对细胞的阻滞期在G2期。白蛋白-药物复合物（图6C和6E）对G2期的阻滞明显比裸药（图6B和6D）增强。白蛋白更能促进药物阻止或延迟细胞的复制。
Claims (3)
1.人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备方法，其特征是：它是将人血清白蛋白作为钌无机药物的靶向生物载体，其制备方法包括如下步骤：
（1）将钌无机药物与人血清白蛋白孵育：称取钌无机药物，用DMSO配置成溶液，将药物的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃静置，使两者反应24小时，得DMSO与HAS混合物；
（2）浓缩混合物；
（3）用二次去离子水洗涤反复洗涤至DMSO含量＜0.01%，制得人血清白蛋白-钌无机药物复合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述人血清白蛋白钌无机药物复合物呈心型结构，六个脂肪酸分子和两个钌无机药物分子不对称的贯穿其中，在人血清白蛋白的IB亚域，钌无机药物完全暴露在水环境中，与组氨酸-146配位结合，在IIA 亚域，钌无机药物结合在大疏水腔中。
3.权利要求1所述的人血清白蛋白-钌无机药物复合物的应用，其特征是：将人血清白蛋白-钌无机药物复合物制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂，用于治疗乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌疾病，其剂量为：60~100μM/L。
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