CN108392508A - 白莲蒿提取物在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供白莲蒿提取物在制备抗炎药物中的应用，所述白莲蒿提取物的制备方法为：将白莲蒿用乙醇提取，浓缩干燥后得到乙醇提取物，将乙醇提取物用水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相四种不同活性部位。活性结果表明，石油醚部位活性最高，其次为乙酸乙酯部位。本发明所制备的白莲蒿提取物作为植物源药物，对健康细胞无毒性，表现出明显的NO抑制能力，副作用小，为炎症治疗和癌症预防提供了新的治疗手段，而且对于科学合理和可持续地开发和利用白莲蒿资源具有非常重要的意义。本发明制备工艺简捷环保，开发成本低，经济效益明显。

Description

白莲蒿提取物在制备抗炎药物中的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及白莲蒿提取物在制备抗炎药物中的应用。

背景技术

炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所产生的防御反应，典型的反应是出现红、肿、热、痛等临床症状，是机体对内外环境中有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应。炎症反应是一种保护性防御反应，又是引起人类多种重大疾病的共同通路，参与人体感染、肿瘤、心脑血管病、老年痴呆和神经退行性疾病、变态反应疾病、精神病等许多重大疾病的发生和发展过程。临床上，抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物。炎症特别是慢性炎症，因体内炎症介质的分泌和相关基因的突变，有极大的可能会造成体内细胞的癌变。根据文献报道有高达20％的癌症和慢性炎症相关。

由于现有的合成化学抗炎药包括非甾体抗炎药和甾体抗炎药具有明显的不良反应，而药用植物因其资源丰富、疗效确切、副作用小等优点，从天然植物资源中开发新型抗炎药物逐渐成为研究热点。

白莲篙属菊科篙属植物，别名万年篙、铁杆篙，几乎遍布全中国各地均有分布，资源丰富。性味苦，辛，平。具有清热解毒、凉血止痛、祛风利湿之功效。我国民间用于治疗急慢性肝炎，小儿惊风，退热，杀虫，阑尾炎，急慢性胃肠炎外用适量治疗创伤出血部分地区用其幼苗代替茵陈。药用部位一般为其地上部分，也可为全草。作为朝药，长期被朝鲜族当做民族药材用于治疗肝炎。本发明对于白莲蒿抗炎功能成分开发利用，工艺简单，生产成本低，易于工业化，对于白莲蒿资源的综合开发利用具有重要意义。

发明内容

本发明提供了白莲蒿提取物在制备抗炎药物中的应用，能够有效地对LPS诱导RAW264.7产生的NO表现出明显的抑制活性，抗炎效果显著,可以作为iNOS的选择性抑制剂。

一氧化氮(NO)，是机体重要的信使分子和效应分子，首次发现是在血管内皮的小分子，其具有广泛的生理作用。一氧化氮合酶(NOS)是一种同工酶，分别存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞及神经细胞中。胞内以精氨酸(L-arginine)经一氧化氮合成酶(NOS)催化分解为L-瓜氨酸(L-citrullinine)和NO自由基。机体中NOS可分为结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)两大类，而cNOS又可分为神经元型一氧化氮合成酶(nNOS)，存在于神经元细胞；和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)，存在于内皮细胞。cNOS催化产生固定量的NO，主要维持机体的正常生理活动，包括血管扩张、平滑肌松弛及抑制血小板凝集等作用。当致炎因子如LPS刺激巨噬细胞会产生iNOS，iNOS随后会诱导产生大量的NO，造成血管过度舒张和细胞损伤，导致炎症反应及相关病变，如败血性休克、中风、DNA损伤、基因突变或细胞癌变等。从天然产物中筛选iNOS的选择性抑制剂对人类健康具有重要意义。

本发明就是建立在LPS活化小鼠巨噬细胞RAW 264.7的体外炎症模型中，通过Griess法检测被LPS活化的巨噬细胞产生的NO是否被所制备的药物干预所抑制。

1、白莲蒿提取物的制备

采集成熟期新鲜白莲蒿植物地上部位，阴干粉碎后，加入其10-50倍体积的50-100％乙醇水溶液，超声或加热回流提取10-90分钟，去除乙醇，然后在通风避光处晾干，得白莲蒿提取物。

2、白莲蒿不同活性部位的制备

将白莲蒿提取物用其100-2000倍体积的蒸馏水溶解，再加入白莲蒿提取物2-10倍体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层，下层水溶液用石油醚重复萃取2-5次，合并石油醚层，去除石油醚，制得白莲蒿石油醚相。

石油醚萃取后的水溶液中加入水溶液2-10倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层水溶液用乙酸乙酯重复萃取2-5次，合并乙酸乙酯层，去除乙酸乙酯，制得白莲蒿乙酸乙酯相。

乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入水溶液2-10倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层；下层水溶液用正丁醇重复萃取2-5次，合并正丁醇层，去除正丁醇，制得白莲蒿正丁醇相。

将正丁醇萃取后剩余水溶液，去除水，制得白莲蒿水相。

作为优选，所述去除乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水是在20℃-60℃下减压浓缩风干。在溶剂浓缩、提取物溶解过程中对温度进行限定是为了保障活性物质不被氧化失活。

作为优选，所述抗炎为白莲蒿提取物在制备iNOS的选择性抑制剂中的应用。

作为优选，所述白莲蒿提取物的浓度为12.5-50μg/mL，优选25μg/mL。

本发明所制备的白莲蒿提取物作为植物源药物，对健康细胞无毒性，表现出明显的NO抑制能力，副作用小，为炎症治疗和癌症预防提供了新的治疗手段，而且对于科学合理和可持续地开发和利用白莲蒿资源具有非常重要的意义。本发明制备工艺简捷环保，开发成本低，经济效益明显。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

白莲蒿提取物的制备方法：

(1)采集白莲蒿成熟期叶片，阴干粉碎，通过40-200目筛后，用5-50倍体积无水乙醇，超声波或加热回流提取10-90分钟，重复提取2-4次，在低于20-60℃下减压浓缩，在阴暗低温和通风较好的地方，阴干，得到白莲蒿乙醇提取物；

(2)将白莲蒿乙醇提取物用1-10倍体积的水(30-40℃)溶解，用水溶液2-10体积的石油醚萃取1-10次，将石油醚部分合并，在20-60℃下减压浓缩风干，制得石油醚部位；在溶剂浓缩、提取物溶解过程中对温度进行限定是为了保障活性物质不被氧化失活；

(3)用水溶液2-10倍体积的乙酸乙酯萃取剩余水溶液1-10次，将乙酸乙酯部分合并，在20-60℃下减压浓缩风干，制得乙酸乙酯部位；

(4)剩余水溶液减压浓缩，风干，制得水相部位。

在制备过程中，各步骤中在溶剂浓缩、提取物溶解过程中对温度进行限定均是为了保障活性物质不被氧化失活。

应用上述方法均能制备得到本发明的白莲蒿提取物，不同之处仅在于各部分的得率有所不同。

实施例1

白莲蒿不同提取组分的制备方法如下：

采集成熟期(8月)新鲜的白莲蒿植物的地上部位，阴干，粉碎。加入20倍体积80％乙醇水溶液，超声提取30分钟，重复提取3次。将提取溶剂在45℃下减压浓缩，得浸膏，在通风避光处，晾干，得白莲蒿提取物。

将制得的白莲蒿提取物用200倍体积的蒸馏水溶解，在水溶液中加入3倍于水溶液体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，在40℃下减压浓缩，制得白莲蒿石油醚部位。将石油醚萃取后剩余水溶液中加入3倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，在35℃下减压浓缩，制得白莲蒿乙酸乙酯部位。将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入3倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层，重复萃取3次，合并正丁醇层，在45℃下减压浓缩，制得白莲蒿正丁醇部位。将正丁醇萃取后剩余水溶液，在45℃下减压浓缩，制得白莲蒿水相。

实施例2

白莲蒿不同提取组分的制备方法如下：

采集成熟期(8月)新鲜的白莲蒿植物的地上部位，阴干，粉碎。加入20倍体积80％乙醇水溶液，回流提取90分钟，重复提取3次。将提取溶剂在42℃下减压浓缩，得浸膏，在通风避光处，晾干，得白莲蒿提取物。

将制得的白莲蒿提取物用1500倍体积的蒸馏水溶解，在水溶液中加入8倍于水溶液体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，在41℃下减压浓缩，制得白莲蒿石油醚部位。将石油醚萃取后剩余水溶液中加入8倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，在38℃下减压浓缩，制得白莲蒿乙酸乙酯部位。将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入8倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层，重复萃取3次，合并正丁醇层，在47℃下减压浓缩，制得白莲蒿正丁醇部位。将正丁醇萃取后剩余水溶液，在50℃下减压浓缩，制得白莲蒿水相。

实施例3本发明的白莲蒿提取物抗炎活性测试

1.实验方法

使用Griess试剂来检测细胞中的NO分泌水平。该方法是Green等在1982年提出。原理是NO在体内或水中易氧化生成NO₂ ^-，在酸性条件下可以和重氮盐磺胺发生Griess反应生成重氮化合物。该类化合物可以进一步发生显色反应，在540nm处有最大吸收峰。OD值和NO的浓度成线形关系。

在体外实验中，使用RAW264.7细胞来进行实验。细胞培养在塑料培养皿中，使用DMEM培养基加10％体积的FBS(胎牛血清)，在37℃，5％CO₂的条件下进行培养。细胞在培养皿中，不使用E酶，枪头吹打下来，因RAW细胞较小，数量较多，因此稀释以后，使用计数板计数。然后按照2×10⁴每孔在96孔板上种板。在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁完全。

本次加入的样品分别为实施例1制得的样品。先加入不同浓度的药物，然后加入1μg/mL的LPS诱导炎症的发生。共培养24h后。取上清液50μL至新的96孔板中加入同体积的Griess试剂(Sigma公司)，孵育10min，在酶标仪上进行NO含量的检测。波长使用540nm。NO的含量使用预先用亚硝酸钠测定的标准曲线进行浓度计算。每种药物测3次。

2.数据处理

抑制率通过以下公式计算：

抑制率％＝(OD_对照－OD_样品)/OD_对照×100。

表1白莲蒿提取物各部位的NO抑制活性

由表1可知，石油醚部位和乙酸乙酯部位均对LPS所引起的NO具有明显抑制效果，其中石油醚部位活性最高，在12.5μg/mL时就能产生50％的抑制活性，当浓度为25μg/mL时，抗炎活性高于80％，具有非常理想的应用前景。其次为乙酸乙酯部位，在50μg/mL对NO抑制率超过90％。正丁醇部位活性差，水相活性最低，在抗炎治疗方面没有可利用价值。本发明的结果，充分说明活性成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯部位中，为中小极性成分。这将为本发明的生产应用和成功推广提供了理论依据。

为了进一步提高本发明的实用性，对活性较高的活性部位进行毒性检查，结果见表2。本发明所制备的活性成分均对正常细胞没有细胞毒活性，安全系数高。

表2白莲蒿提取物各部位的安全性评价

本发明的研究结果将有利于科学、综合和可持续地开发和利用白莲蒿资源，同时也能提高人们环境保护和参与生态环境修复的积极性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种白莲蒿提取物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：采集成熟期新鲜白莲蒿植物样品，阴干粉碎后，加入其10-50倍体积的50-100％乙醇水溶液，超声或加热回流提取10-90分钟，去除乙醇，然后在通风避光处晾干，得白莲蒿提取物。

2.根据权利要求1所述的一种白莲蒿提取物，其特征在于，白莲蒿石油醚部位的制备方法为：将白莲蒿提取物用其100-2000倍体积的蒸馏水溶解后，加入白莲蒿提取物2-10倍体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层，下层水溶液用石油醚重复萃取1-6次，合并石油醚层，去除石油醚，制得白莲蒿石油醚部位。

3.根据权利要求1所述的一种白莲蒿提取物，其特征在于，白莲蒿乙酸乙酯部位的制备方法为：石油醚萃取后的水溶液中加入水溶液2-10倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层水溶液用乙酸乙酯重复萃取1-6次，合并乙酸乙酯层，去除乙酸乙酯，制得白莲蒿乙酸乙酯部位。

4.根据权利要求1所述的一种白莲蒿提取物，其特征在于，白莲蒿正丁醇部位的制备方法为：乙酸乙酯萃取后的水溶液中加入水溶液2-10倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层；下层水溶液用正丁醇重复萃取1-6次，合并正丁醇层，去除正丁醇，制得白莲蒿正丁醇部位；将正丁醇萃取后剩余水溶液减压浓缩，制得白莲蒿水相。

5.根据权利要求1所述的一种白莲蒿提取物，其特征在于，所述去除乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水，是在20℃-60℃下减压浓缩风干。

6.根据权利要求1-4任一项所述的一种白莲蒿提取物，其特征在于，白莲蒿提取物在制备iNOS的选择性抑制剂中的应用和在抗炎中的应用。

7.根据权利要求1-4任一项所述的一种白莲蒿提取物，其特征在于，所述白莲蒿提取物的浓度为12.5-50μg/mL。

8.根据权利要求1-4任一项所述的一种白莲蒿提取物，其特征在于，所述白莲蒿提取物的浓度为50μg/mL。