CN108210539A - 白沙蒿提取物在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供白沙蒿提取物在制备抗炎药物中的应用，所述白沙蒿提取物的制备方法为：将白沙蒿叶用乙醇提取，浓缩干燥后得到乙醇提取物，将乙醇提取物用水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚部位和乙酸乙酯部位。活性结果表明，石油醚部位活性高于乙酸乙酯和水相部位。本发明所制备的白沙蒿提取物作为植物源药物，对健康细胞无毒性，表现出明显的NO抑制能力，副作用小，为炎症治疗和癌症预防提供了新的治疗手段，而且对于科学合理和可持续地开发和利用白沙蒿资源具有非常重要的意义。本发明制备工艺简捷环保，开发成本低，经济效益明显。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及白沙蒿提取物在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所产生的防御反应，典型的反应是出现红、肿、热、痛等临床症状，是机体对内外环境中有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应。炎症反应是一种保护性防御反应，又是引起人类多种重大疾病的共同通路，参与人体感染、肿瘤、心脑血管病、老年痴呆和神经退行性疾病、变态反应疾病、精神病等许多重大疾病的发生和发展过程。临床上，抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物。炎症特别是慢性炎症，因体内炎症介质的分泌和相关基因的突变，有极大的可能会造成体内细胞的癌变。根据文献报道有高达20％的癌症和慢性炎症相关。
由于现有的合成化学抗炎药包括非甾体抗炎药和甾体抗炎药具有明显的不良反应，而药用植物因其资源丰富、疗效确切、副作用小等优点，从天然植物资源中开发新型抗炎药物逐渐成为研究热点。
白沙蒿Artemisia sphaerocephala Kraschen菊科蒿属植物，又名圆头沙蒿。在自然生境中，白沙蒿常年生长在干旱地区，克服着干旱、贫瘠和光照辐射强度高等多种不利因素，体内具有较高含量的黄酮和不饱和脂肪酸成分，形成了自身独特的适应机制。本发明对于白沙蒿抗炎功能成分开发利用，工艺简单，生产成本低，易于工业化，对于白沙蒿资源的综合开发利用和保护具有重要意义。
发明内容
本发明提供了白沙蒿提取物在制备抗炎药物中的应用，能够有效地对LPS诱导RAW264.7产生的NO表现出明显的抑制活性，抗炎效果显著,可以作为iNOS的选择性抑制剂。
一氧化氮(NO)，是机体重要的信使分子和效应分子，首次发现是在血管内皮的小分子，其具有广泛的生理作用。一氧化氮合酶(NOS)是一种同工酶，分别存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞及神经细胞中。胞内以精氨酸(L-arginine)经一氧化氮合成酶(NOS)催化分解为L-瓜氨酸(L-citrullinine)和NO自由基。机体中NOS可分为结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)两大类，而cNOS又可分为神经元型一氧化氮合成酶(nNOS)，存在于神经元细胞；和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)，存在于内皮细胞。cNOS催化产生固定量的NO，主要维持机体的正常生理活动，包括血管扩张、平滑肌松弛及抑制血小板凝集等作用。当致炎因子如LPS刺激巨噬细胞会产生iNOS，iNOS随后会诱导产生大量的NO，造成血管过度舒张和细胞损伤，导致炎症反应及相关病变，如败血性休克、中风、DNA损伤、基因突变或细胞癌变等。从天然产物中筛选iNOS的选择性抑制剂对人类健康具有重要意义。
本发明就是建立在LPS活化小鼠巨噬细胞RAW 264.7的体外炎症模型中，通过Griess法检测被LPS活化的巨噬细胞产生的NO是否被所制备的药物干预所抑制。
本发明提供白沙蒿提取物在制备抗炎药物中的应用，所述白沙蒿提取物的制备方法为：将白沙蒿叶用乙醇提取，浓缩干燥后得到乙醇提取物，将乙醇提取物用水溶解，再用石油醚萃取，收集石油醚萃取液，去除石油醚，得到石油醚部位。
采用上述方法即可得到白沙蒿提取物，用于制备抗炎药物。在以下各优选条件下，产物的得率有所提高。
作为优选，所述将白沙蒿用乙醇提取是将白沙蒿用5-50倍体积的无水乙醇，超声波或加热回流提取，提取时间优选10-90分钟，提取次数优选2-4次。
作为优选，所述将乙醇提取物用水溶解是将乙醇提取物用1-10倍体积的水溶解。
作为优选，所述用石油醚萃取是用水溶液3-10倍体积的石油醚萃取，优选萃取1-10次。
作为优选，所述去除石油醚是在20℃-60℃下减压浓缩风干。
作为优选，将乙醇提取物用水溶解，再用石油醚提取后，收集水溶液，在水溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，去除乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位。
采用上述方法可以得到白沙蒿的乙酸乙酯提取部位，具有抗炎效果。以下各条件下，乙酸乙酯提取部位的得率有所提高。
作为优选，所述在水溶液中加入乙酸乙酯进行萃取是在水溶液中加入水溶液体积2-10倍的乙酸乙酯进行萃取，优选萃取1-10次。
作为优选，所述去除乙酸乙酯是在20℃-60℃下减压浓缩风干。
作为优选，所述抗炎为白沙蒿提取物在制备iNOS的选择性抑制剂中的应用。
作为优选，所述白沙蒿提取物的浓度为12.5-50μg/mL，优选50μg/mL。
本发明所制备的白沙蒿提取物作为植物源药物，对健康细胞无毒性，表现出明显的NO抑制能力，副作用小，为炎症治疗和癌症预防提供了新的治疗手段，而且对于科学合理和可持续地开发和利用白沙蒿资源具有非常重要的意义。本发明制备工艺简捷环保，开发成本低，经济效益明显。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为白沙蒿叶片乙醇提取物及不同萃取部位HPLC(275nm)检测图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
白沙蒿提取物的制备方法：
(1)采集白沙蒿成熟期叶片，阴干粉碎，通过40-200目筛后，用5-50倍体积无水乙醇，超声波或加热回流提取10-90分钟，重复提取2-4次，在低于20-60℃下减压浓缩，在阴暗低温和通风较好的地方，阴干，得到白沙蒿乙醇提取物；
(2)将白沙蒿乙醇提取物用1-10倍体积的水(30-40℃)溶解，用水溶液2-10体积的石油醚萃取1-10次，将石油醚部分合并，在20-60℃下减压浓缩风干，制得石油醚部位；在溶剂浓缩、提取物溶解过程中对温度进行限定是为了保障活性物质不被氧化失活；
(3)用水溶液2-10倍体积的乙酸乙酯萃取剩余水溶液1-10次，将乙酸乙酯部分合并，在20-60℃下减压浓缩风干，制得乙酸乙酯部位；
(4)剩余水溶液减压浓缩，风干，制得水相部位。
在制备过程中，各步骤中在溶剂浓缩、提取物溶解过程中对温度进行限定均是为了保障活性物质不被氧化失活。
应用上述方法均能制备得到本发明的白沙蒿提取物，不同之处仅在于各部分的得率有所不同。
实施例1
白沙蒿提取物的制备方法如下：
采集于阿拉善地区白沙蒿成熟期(8月)新鲜叶片，阴干粉碎，通过100目筛得细粉。将叶片细粉40g加入20倍体积无水乙醇溶液，超声波提取60分钟后，重复提取3次，35℃下减压浓缩。在阴暗低温和通风较好的地方，晾干，制得乙醇提取物。提取物为黑色固体，4.76g，产率11.90％。将白沙蒿乙醇提取物用10倍体积的水(36℃，50mL)溶解，用水溶液2倍体积的石油醚(100mL)萃取3次，将上层石油醚部分合并后在35℃下减压浓缩风干，制得石油醚部位。如果萃取过程中出现严重乳化现象，加入NaCl固体1-3g。石油醚部位为黑色固体，0.7666g，萃取得率16.11％。用水溶液2倍体积的乙酸乙酯(100mL)萃取剩余水溶液3次，将乙酸乙酯部分合并后在35℃下减压浓缩风干，制得乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位为黑色固体，2.4676g，萃取得率51.84％。剩余水溶液在35℃下减压浓缩，风干，制得水相部位。水相部位为黑褐色粘稠状固体，1.3318g，萃取得率27.98％。
通过液相色谱检测，不同极性的成分得到了有效的分离。从图1可以看到，通过萃取不同极性部位的成分得到了分离，各不相同，且比乙醇提取物的成分要简单，且含量不同程度地得到富集提高。同时从图中可以看到，相比石油醚和水相部位，乙酸乙酯部位黄酮含量较高，且成分较多。
图1为白沙蒿叶片乙醇提取物及不同萃取部位HPLC(275nm)检测图。
实施例2
白沙蒿提取物的制备方法如下：
采集于阿拉善地区白沙蒿成熟期(8月)新鲜叶片，阴干粉碎，通过100目筛子得细粉。将叶片细粉40g加入50倍体积无水乙醇溶液，超声波提取60分钟后，重复提取3次，在35℃下减压浓缩。在阴暗低温和通风较好的地方，晾干，制得乙醇提取物。提取物为黑色固体，5.16g，产率12.90％。将白沙蒿乙醇提取物用3倍体积的水(36℃，15mL)溶解，用与水溶液4倍体积的石油醚(60mL)萃取3次，将上层石油醚部分合并后在35℃下减压浓缩风干，制得石油醚部位。如果萃取过程中出现严重乳化现象，加入NaCl固体1-3g。石油醚部位为黑色固体，0.8109g，萃取得率15.72％。用水溶液4倍体积的乙酸乙酯(60mL)萃取剩余水溶液5次，将乙酸乙酯部分合并后在35℃下减压浓缩风干，制得乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位为黑色固体，1.8275g，萃取得率35.42％。剩余水溶液在35℃下减压浓缩，风干，制得水相部位。水相部位为黑褐色粘稠状固体，2.7359g，萃取得率53.02％。
该制备方法与实施例1相比，乙醇用量大，但收率提高不多，而且萃取过程中得到的水相部位成分较多。
实施例3
白沙蒿提取物的制备方法如下：
采集于阿拉善地区白沙蒿成熟期(8月)新鲜叶片，阴干粉碎，通过100目筛子得细粉。将叶片细粉40g用10倍体积无水乙醇溶液，超声波提取60分钟后，重复提取3次，在35℃下减压浓缩。在阴暗低温和通风较好的地方，晾干，制得乙醇提取物。提取物为黑色固体，3.99g，产率9.98％。将白沙蒿乙醇提取物用5倍体积的水(36℃，20mL)溶解，用与水溶液10倍体积的石油醚(200mL)萃取2次，将上层石油醚部分合并后在35℃下减压浓缩风干，制得石油醚部位。如果萃取过程中出现严重乳化现象，加入NaCl固体1-3g。石油醚部位为黑色固体，0.8039g，萃取得率20.15％。用水溶液10倍体积的乙酸乙酯(100mL)萃取剩余水溶液2次，将乙酸乙酯部分合并后在35℃下减压浓缩风干，制得乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位为黑色固体，1.7656g，萃取得率44.25％。剩余水溶液在低于35℃温度下减压浓缩，风干，制得水相部位。水相部位为黑褐色粘稠状固体，0.9108g，萃取得率22.83％。
该制备方法与实施例1相比，乙醇提取物收率低，而且萃取过程中得到的乙酸乙酯部位产率低。
实施例4
白沙蒿提取物的制备方法如下：
采集于阿拉善地区白沙蒿成熟期(8月)新鲜叶片，阴干粉碎，通过40目筛得细粉。将叶片细粉40g加入5倍体积无水乙醇溶液，超声波提取10分钟后，重复提取2次，在20℃下减压浓缩。在阴暗低温和通风较好的地方，晾干，制得乙醇提取物。提取物为黑色固体。将白沙蒿乙醇提取物用1倍体积的水(30℃)溶解，用水溶液5倍体积的石油醚萃取1次，将上层石油醚部分合并后在60℃下减压浓缩风干，制得石油醚部位。如果萃取过程中出现严重乳化现象，加入NaCl固体。石油醚部位为黑色固体。用水溶液5倍体积的乙酸乙酯萃取剩余水溶液1次，将乙酸乙酯部分合并后在60℃下减压浓缩风干，制得乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位为黑色固体。剩余水溶液在20℃下减压浓缩，风干，制得水相部位，水相部位为黑褐色粘稠状固体。
实施例5
白沙蒿提取物的制备方法如下：
采集于阿拉善地区白沙蒿成熟期(8月)新鲜叶片，阴干粉碎，通过200目筛得细粉。将叶片细粉40g加入50倍体积无水乙醇溶液，回流提取90分钟后，重复提取2次，在60℃温度下减压浓缩。在阴暗低温和通风较好的地方，晾干，制得乙醇提取物。提取物为黑色固体。将白沙蒿乙醇提取物用8倍体积的水(40℃)溶解，用水溶液6倍体积的石油醚萃取10次，将上层石油醚部分合并后在20℃下减压浓缩风干，制得石油醚部位。如果萃取过程中出现严重乳化现象，加入NaCl固体。石油醚部位为黑色固体。用水溶液7倍体积的乙酸乙酯萃取剩余水溶液10次，将乙酸乙酯部分合并后在20℃下减压浓缩风干，制得乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位为黑色固体。剩余水溶液在60℃下减压浓缩，风干，制得水相部位，水相部位为黑褐色粘稠状固体。
实施例6白沙蒿水提物
本发明的白沙蒿水提物的制备方法如下：
采集于阿拉善地区白沙蒿成熟期(8月)新鲜叶片，阴干粉碎，通过100目筛子得细粉。将叶片细粉40g用20倍体积蒸馏水，加热回流提取60分钟后，重复提取3次，在35℃下减压浓缩。在阴暗低温和通风较好的地方，晾干，制得白沙蒿水提物。提取物为深褐色粘稠固体，5.56g，产率13.90％。
实施例7本发明的白沙蒿提取物抗炎活性测试
1.实验方法
使用Griess试剂来检测细胞中的NO分泌水平。该方法是Green等在1982年提出。原理是NO在体内或水中易氧化生成NO2 -，在酸性条件下可以和重氮盐磺胺发生Griess反应生成重氮化合物。该类化合物可以进一步发生显色反应，在540nm处有最大吸收峰。OD值和NO的浓度成线形关系。
在体外实验中，使用RAW264.7细胞来进行实验。细胞培养在塑料培养皿中，使用DMEM培养基加10％体积的FBS(胎牛血清)，在37℃，5％CO2的条件下进行培养。细胞在培养皿中，不使用E酶，枪头吹打下来，因RAW细胞较小，数量较多，因此稀释以后，使用计数板计数。然后按照2×104每孔在96孔板上种板。在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，使细胞贴壁完全。
本次加入的样品分别为实施例1和实施例6制得的样品。先加入不同浓度的药物，然后加入1μg/mL的LPS诱导炎症的发生。共培养24h后。取上清液50μL至新的96孔板中加入同体积的Griess试剂(Sigma公司)，孵育10min，在酶标仪上进行NO含量的检测。波长使用540nm。NO的含量使用预先用亚硝酸钠测定的标准曲线进行浓度计算。每种药物测3次。
2.数据处理
抑制率通过以下公式计算：
抑制率％＝(OD对照－OD样品)/OD对照×100。
表1白沙蒿提取物各部位的NO抑制活性
由表1可知，石油醚部位和乙酸乙酯部位均对LPS所引起的NO具有明显抑制效果，其中石油醚部位活性最高，在50μg/mL时就能产生大于90％的抑制活性，具有非常理想的应用前景。其次为乙酸乙酯部位，在50μg/mL对NO抑制率超过70％。水相部分活性较差，低于乙醇提取物，说明活性成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯部位中，为中小极性成分。这将为本发明的生产应用提供了理论依据。而单纯的水提物没有抑制活性，也说明水溶性成分不具备NO抑制活性，本发明所筛选的方法对于白沙蒿抗炎活性开发具有非常重要的作用。
为了进一步提高本发明的实用性，对不同提取部位进行毒性筛查，结果见表2。本发明所制备的活性成分均对正常细胞没有细胞毒活性，安全系数高。
表2白沙蒿提取物各部位的安全性评价
本发明的研究结果将有利于科学、综合和可持续地开发和利用白沙蒿资源，同时也能提高人们种植固沙植物和参与生态环境修复的积极性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.白沙蒿提取物在制备抗炎药物中的应用，其特征在于：所述白沙蒿提取物的制备方法为：将白沙蒿叶用乙醇提取，浓缩干燥后得到乙醇提取物，将乙醇提取物用水溶解，再用石油醚萃取，收集石油醚萃取液，去除石油醚，得到石油醚部位。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述将白沙蒿用乙醇提取是将白沙蒿用5-50倍体积的无水乙醇，超声波或加热回流提取，提取时间优选10-90分钟，提取次数优选2-4次。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述将乙醇提取物用水溶解是将乙醇提取物用1-10倍体积的水溶解。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用石油醚萃取是用水溶液3-10倍体积的石油醚萃取，优选萃取1-10次。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述去除石油醚是在20℃-60℃下减压浓缩风干。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：将乙醇提取物用水溶解，再用石油醚萃取后，收集水溶液，在水溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，去除乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述在水溶液中加入乙酸乙酯进行萃取是在水溶液中加入水溶液体积2-10倍的乙酸乙酯进行萃取，优选萃取1-10次。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述去除乙酸乙酯是在20℃-60℃下减压浓缩风干。
9.根据权利要求1-8任一项所述的应用，其特征在于：所述抗炎为白沙蒿提取物在制备iNOS的选择性抑制剂中的应用。
10.根据权利要求1-9所述的应用，其特征在于：所述白沙蒿提取物的浓度为12.5-50μg/mL，优选50μg/mL。
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