CN107746435B - 马齿苋多糖提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种马齿苋多糖提取物及其制备方法和用途，具体公开了一种马齿苋多糖提取物的制备方法，其包括如下步骤：1)将马齿苋粉碎后过滤，加入水，并加热至40‑60℃，浸提完全后减压过滤，得到滤液I和滤渣I，将滤液I烘烤至粘稠状，加入乙醇后以超声波混悬分散，再加入乙醇用量的0.5‑1.5倍量的纯净水，减压过滤收集滤饼，烘干后得到多糖提取物A；2)将滤渣I加入纯净水中，超声波进行悬浮，加入酶进行酶解至完全，烘烤至粘稠状，加入乙醇后以超声波混悬分散，再加入乙醇用量的0.5‑1.5倍量的纯净水，减压过滤收集滤饼，烘干后得到多糖提取物B；3)将多糖提取物A和多糖提取物B进行混合得到马齿苋多糖提取物。

Description

马齿苋多糖提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及马齿苋多糖提取物。

背景技术

马齿苋为一年生草本植物，全株无毛。马齿苋为中国境内常见的野生草本植物，可以作为种药食两用的植物，古代中医药典中记载：马齿苋性寒，味酸，无毒，入肝、脾、大肠三经，有疏肝理气，健脾养胃，润肠解毒之功效。因为马齿苋是一种可以食用的野菜，产量又很大，所以在过去灾荒严重的时候，马齿苋被做为救灾的粮食来食用，生活条件改善后，也有人在初春时节采摘并食用。中医认为，春夏之间，是人体肝和脾当令的时候，吃一些马齿苋，能够起到降肝火、清胃火的作用，民间也经常用马齿苋来治疗拉肚子、痢疾等肠胃炎症。

多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。多糖在自然界分布极广，亦很重要。有的是构成动植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。多糖的结构单位是单糖，多糖相对分子质量从几万到几千万。结构单位之间以苷键相连接，常见的苷键有α-1，4-、β-1，4-和α-1，6-苷键。结构单位可以连成直链，也可以形成支链，直链一般以α-1，4-苷键(如淀粉)和β-1，4-苷键9如纤维素)连成；支链中链与链的连接点常是α-1，6-苷键。

近20年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等，都有着密切的关系。近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。此外它还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。

基于多糖在多产业的应用，近年来对多糖的研究日趋火热。很多研究者将研究的重点投向了植物多糖提取和应用。仅针对马齿苋的多糖研究就已有多个研究团队在同时进行，并且以取得了一定的成果。例如，专利公开号CN105193876A的发明专利公开了一种马齿苋提取物及其制备方法，本发明提取物由下述方法制备：取马齿苋干燥，采用95％乙醇作为挟带剂，CO2超临界萃取，萃取物加入1，3-丁二醇，有机层回收试剂至尽，干燥得到提取物A；超临界萃取后残渣，进行酶水解，加水提取，过滤，提取液加入活性炭和白土，离心，浓缩干燥，得到提取物B；将提取物A和提取物B混合均匀。制备方法中提取物A中富含α-亚麻酸，本发明得到提取物B中多糖含量高。专利公开号CN103665177A的发明专利公开了一种采用高压脉冲电场提取马齿苋中多糖的方法，高电压脉冲电场技术提取马齿苋多糖的方法，由于是低温提取，最大限度保持了马齿苋中多糖的结构，提高了产品质量。专利公开号CN102241785A的发明专利公开了马齿苋多糖的生产工艺采用微波辅助提取。专利公开号CN103520108A的发明专利公开了一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备及其应用，其通过制剂解决了马齿苋多糖稳定性差，易受光照、温度、氧、pH等影响，易氧化分解，以及溶解性和生物利用度低的问题。虽然现有技术中存在多种提取保存马齿苋多糖的制备方法，但是，一方面，使用高电压脉冲、微波等方式操作复杂，不利于工业上大规模生产。另一方面，其通常提取得到的是破壁后细胞内和细胞间的多糖，而对于植物细胞而言细胞壁多糖通常在提取过程中被损失，而发明人意外地发现对于残渣的二次提取所得的马齿苋多糖能够更有效达到抗肿瘤和抑菌的目的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种马齿苋多糖提取物的制备方法，其包括如下步骤：

1)将马齿苋粉碎后过滤，加入水，并加热至40-60℃，浸提完全后减压过滤，得到滤液I和滤渣I，将滤液I烘烤至粘稠状，加入乙醇后以超声波混悬分散，再加入乙醇用量的0.5-1.5倍量的纯净水，减压过滤收集滤饼，烘干后得到多糖提取物A；

2)将滤渣I加入纯净水中，超声波进行悬浮，加入酶进行酶解至完全，烘烤至粘稠状，加入乙醇后以超声波混悬分散，再加入乙醇用量的0.5-1.5倍量的纯净水，减压过滤收集滤饼，烘干后得到多糖提取物B；

3)将多糖提取物A和多糖提取物B进行混合得到马齿苋多糖提取物。

在本发明的技术方案中，其中步骤2中所用的酶选自纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶或木聚糖酶。

在本发明的技术方案中，其中步骤2中酶解的条件为40-70℃下酶解1-10h；优选为50℃下酶解2h。

在本发明的技术方案中，加入纯净水的用量为乙醇用量的1倍量。

在本发明的技术方案中，所述的乙醇为95％的乙醇。

本发明另一个方面提供了一种马齿苋多糖提取物，其采用本发明所述的方法制备。

本发明再一个方面提供了一种马齿苋多糖提取物在制备治疗或预防便秘或者肠道菌群失调以及由于肠道菌群失调导致的腹泻的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，所述的肠道菌群失调为双歧杆菌或乳酸菌失调。

本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其包含了本发明所述的马齿苋多糖提取物和药物辅料。

有益效果

本发明利用了常见的野生植物马齿苋提取了活性成分多糖，并发现了其对于肠道疾病有较好的效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但这并不说明本发明仅限于这些实施例。

实施例中采用的各种原料如无特别说明均采用市售产品。

实施例1制备马齿苋多糖提取物

将马齿苋鲜品100g，以粉碎机进行粉碎并过40目筛网过滤，过滤得到的滤液加入5L纯净水，加热至50℃，蒸发水溶液至2L后减压过滤，得到滤液I和滤渣I，将滤液I置于80℃烤箱中烘烤至粘稠状，加入100ml 95％乙醇后以超声波进行分散，得到白色混浊絮状物加入100ml纯净水搅拌均匀，减压过滤，收集滤饼，置于烘干箱中50℃烘干，得到多糖提取物A。

将滤渣I加入80ml纯净水中，超声进行悬浮，加入400mg纤维素酶50℃下酶解2h，置于80℃烤箱中烘烤至粘稠状，加入100ml 95％乙醇后以超声波进行分散，得到白色混浊絮状物加入100ml纯净水搅拌均匀，减压过滤，收集滤饼，置于烘干箱中50℃烘干，得到多糖提取物B1。

实施例2

将实施例1中的纤维素酶替换为木瓜蛋白酶，其他条件不变，得到多糖提取物B2。

实施例3

将实施例1中的纤维素酶替换为果胶酶，酶解时调节pH至4.0，其他条件不变，得到多糖提取物B3。

实施例4

将实施例1中的纤维素酶替换为木聚糖酶，其他条件不变，得到多糖提取物B4。

实施例5

分别将各实施例中提取得到的多糖提取物A和相应的多糖提取物B1、多糖提取物B2、多糖提取物B3、多糖提取物B4进行合并得到组合物C1、C2、C3、C4。

实施例6马齿苋多糖的测定

采用苯酚一硫酸比色法对马齿苋多糖含量进行检测，以α-无水葡萄糖作为标准品。精密称取α-无水葡萄糖对照品50mg，干燥至恒重后置于50mL容量瓶中，加水溶解至刻度，精密吸取该溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL于50mL容量瓶中(相应的浓度为C_l＝0.02mg/mL，C₂＝0.04mg/mL，C₃＝0.06mg/mL，C₄＝0.08mg/mL，C₅＝1.00mg/mL)，加水稀释至刻度，各取1mL于10mL比色管中，分别加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，匀速加入5mL浓硫酸，并冷却至室温，以蒸馏水同法做空白参比，在485nm处吸收度最大。

(2)标准曲线的绘制

根据已确定的最大吸收度(485nm)，以浓度C做横坐标，以吸收度做纵坐标绘制标准品曲线，并得出回归方程A＝12.025C+0.0743，R²＝0.9998。

(3)样品中多糖的测定

称取干燥后所得的多糖提取物A1、B1、B2、B3、B4各50.0mg置50mL容量瓶中，加水溶解至刻度，精密吸取该溶液2.0于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，各取1mL置于10mL比色管中，分别加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，匀速加入5mL浓硫酸，立即摇匀后冷却至室温，以蒸馏水同法做空白参比，两种方法的样品选择在485nm处测定吸收度。

多糖浓度C(mg/ml)＝(A₄₈₅-0.0743)/12.025

待测多糖提取物中多糖重量＝多糖浓度C*稀释倍数

多糖占多糖提取物的百分比＝多糖重量/多糖提取物重量*100％

表1每100g马齿苋鲜品中经紫外检测所得多糖含量

通过上述实验可知，通过水浸提后还有部分多糖未被完全提取，通过加入不同的酶进行酶解可以达到进一步浸提多糖的目的。不同的酶对于浸提效果不同，其中木聚糖酶提取效率最高，达到5.269g。而通过比较多糖检测值与多糖提取物实测值可知，采用步骤1)的方法获得的多糖提取物A中几乎全部为多糖纯品，而采用酶解方法处理后的多糖B1、B2、B3、B4中多糖含量明显偏低，发明人推测这有可能是由于酶解致使多糖一部分被水解，从而导致多糖含量偏低。

实施例7组合物治疗便秘试验

采用昆明种小鼠60只，体重18～22g，将小鼠随机分为x组。将复方地芬诺酯配置成2.5mg/ml。

实验开始前，将小鼠禁食12h后，将复方地芬诺酯以20mg/kg灌胃制备便秘小鼠模型，正常对照组以生理盐水灌胃。给予复方地芬诺酯后半小时，以墨汁进行灌胃，模型组分为5组，分别给予纯净水、以及组合物A、C1-C4。分笼进行饲养，并记录小鼠排出首例黑便的时间，10小时内排便次数以及粪便含水率。

表2组合物治疗便秘试验数据

通过排便实验数据可知，本发明组合物C1-4能显著增加首次排便的时间，同时增加单位时间内排便质量，C3-4能够使粪便含水量上升至正常水平。

实施例8组合物对小鼠肠道性能试验

选取昆明小鼠，雌雄各半，18-20g，常规词养。模型组50只小鼠每天灌胃盐酸林可霉素20mg/只，制备肠道菌群失调的小鼠模型。空白组20只小鼠每天同一时间灌胃等量生理盐水，连续一周。模型组小鼠饮食下降，大便湿溏，外形正常含水分较多。将50只模型组小鼠，随机分为5组。第一组每日灌胃生理盐水2ml，第二组每日灌胃2ml组合物C1，第三组每日灌胃2ml组合物C2，第四组每日灌胃2ml组合物C3，第五组每日灌胃2ml组合物C4，第六组每日灌胃2ml多糖提取物A。饲养14天后称重。样品组配置方法为配置浓度为0.1g/ml的组合物溶液。造模成功后，以及给药14天后分别称取小鼠体重，同时分别观察粪便情况，并在无菌条件下收集粪便，进行微生物培养，测定双歧杆菌、乳杆菌和大肠杆菌的数量。

表3体重数据

表4小鼠粪便中菌群数据log cfu/g

通过实验结果可知，组合物C1-4对小鼠体重增加均有较好效果，通过观察粪便情况发现，随着服用组合物C1-4次数的增加，小鼠粪便成形性变高，至14日时，小鼠粪便排出情况与正常组几乎无肉眼差别。小鼠的进食量也有所增加，这也体现在体重的增加上。另一方面，通过对小鼠肠道菌群的分析可知，C1-4对小鼠肠道内双歧杆菌和乳酸菌的数量有较大影响，可以使其恢复至正常水平。

Claims (8)

1.一种马齿苋多糖提取物的制备方法，其包括如下步骤：

1)将马齿苋粉碎后过滤，加入水，并加热至40-60℃，浸提完全后减压过滤，得到滤液I和滤渣I，将滤液I烘烤至粘稠状，加入乙醇后以超声波混悬分散，再加入乙醇用量的0.5-1.5倍量的纯净水，减压过滤收集滤饼，烘干后得到多糖提取物A；

2)将滤渣I加入纯净水中，超声波进行悬浮，加入酶进行酶解至完全，烘烤至粘稠状，加入乙醇后以超声波混悬分散，再加入乙醇用量的0.5-1.5倍量的纯净水，减压过滤收集滤饼，烘干后得到多糖提取物B；

3)将多糖提取物A和多糖提取物B进行混合得到马齿苋多糖提取物；

其中步骤2中所用的酶选自木聚糖酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤2)中酶解的条件为40-70℃下酶解1-10h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤2)中酶解的条件为为50℃下酶解2h。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，在步骤1)和2)中，加入纯净水的用量为乙醇用量的1倍量。

5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，所述的乙醇为95％的乙醇。

6.一种马齿苋多糖提取物，其采用权利要求1-5任一项所述的方法制备获得。

7.权利要求6所述的马齿苋多糖提取物在制备治疗或预防便秘或者肠道菌群失调以及由于肠道菌群失调导致的腹泻的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的肠道菌群失调为双歧杆菌或乳酸菌失调。