CN117959246B - 蒙古莸的提取方法、蒙古莸抗炎软膏及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物领域，公开了蒙古莸的提取方法、蒙古莸抗炎软膏及其制备方法和应用。所述蒙古莸抗炎软膏的制备方法包括将丙三醇和纯净水混合成水相，取凡士林、羊毛脂、硬脂酸混合成油相，加热至80‑90℃，后将吐温‑80缓慢加入到水相中，搅拌均匀后将混合后的水相加入到油相，利用乳化机乳化后，加入蒙古莸干浸膏，继续搅拌至药物均匀分布即得；油相中还混合有单硬脂酸甘油酯和十八醇。蒙古莸抗炎软膏对造模后的关节炎大鼠足跖肿胀度及关节炎评分有明显的改善。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及蒙古莸的提取方法、蒙古莸抗炎软膏及其制备方法和应用。
背景技术
蒙古莸系马鞭草科莸属植物，产于内蒙古、河北、山西、陕西及甘肃，生于海拔1100-1300米干旱旷地。其不仅可以作为干旱地区的水保灌木资源，在蒙医药用方面也有不容小觑的作用。蒙古莸为全草入药，其花、枝、叶均可被制成蒙药，其性味甘、温，具有抗炎，祛风除湿，活血止痛的作用。蒙古莸的花、枝、叶、种子均含有樟香型芳香油成分，有一定的芳香性气味，具有挥发性。
类风湿性关节炎（RA）是一种以关节滑膜炎症为主的慢性、多发性的全身免疫性疾病。该病致残率较高，中西医内服药物副作用较大，外用西药价格偏高，中药软膏贴敷属于中医的外治方法，具有疗效肯定、无副作用、价格低廉的优点。《全国中草药汇编》等历代本草著作中记载蒙古莸具有治疗风湿性关节炎的作用。
在类风湿性关节炎(RA)的各种动物模型中，胶原诱导性关节炎(CIA)是研究和应用最广泛的标准模型，主要是因为CIA和RA在临床前、病理学和免疫学等方面的相似性。
甲氨蝶呤（MTX）可以治疗类风湿性关节炎，虽起效缓慢，但改善和延缓病情发展的疗效显著。
本发明旨在确定蒙古莸的提取工艺，研究一种以蒙古莸为原料的抗类风湿性关节炎的新型软膏剂。
发明内容
本发明提供一种蒙古莸抗炎软膏的制备方法，所述制备方法包括将丙三醇和纯净水混合成水相，取凡士林、羊毛脂、硬脂酸混合成油相，加热至80-90℃，后将吐温-80缓慢加入到水相中，搅拌均匀后将混合后的水相加入到油相，利用乳化机乳化后，加入蒙古莸干浸膏，继续搅拌至药物均匀分布即得；油相中还混合有单硬脂酸甘油酯和十八醇。
具体地，蒙古莸干浸膏用量为1.35-13.5份，硬脂酸用量为2.5-3.5份，凡士林用量为1.0-2.0份，吐温-80用量为5.0-7.0份，丙三醇用量为5.0-7.0份，羊毛脂用量为1-3份。
更优选地，蒙古莸干浸膏用量为2.7份，硬脂酸用量为3.5份，凡士林用量为1.5份，吐温-80用量为5份，丙三醇用量为7.0份，羊毛脂用量为2份。
在具体实施方式中，所述蒙古莸干浸膏由下述方法得到：将干燥的蒙古莸全草粉碎后过筛制得蒙古莸全草粗粉，置于连续回流装置中，加入蒙古莸全草粗粉的8-20倍量的60-95%乙醇溶液，加热回流提取0.5-4小时后，过滤提取液获得蒙古莸提取物，再烘干得到蒙古莸干浸膏。
更优选地，加入蒙古莸全草粗粉的8倍、12倍、14倍、16倍、18倍或20倍量的60%、80%或95%乙醇溶液。
特别优选地，加入蒙古莸全草粗粉的18倍量的80%乙醇溶液，加热回流提取3小时。
另外优选地，油相中单硬脂酸甘油酯用量为0.4-40份，十八醇用量为0.2-20份。
本发明还提供所述的制备方法制备获得的蒙古莸抗炎软膏。
本申请所述蒙古莸提取方法可以获得较高的干浸膏得率，本申请所述蒙古莸软膏可改善关节炎大鼠状态，具有明显的抗炎作用，表现在改善足趾肿胀度、降低关节炎评分。
附图说明
图1为提取方式考察的出峰结果图。
图2为提取溶剂考察的出峰结果图。
图3为醇浓度考察的出峰结果图。
图4为料液比考察的出峰结果图。
图5为提取时间和料液比对干浸膏得率的影响。
图6为提取时间和醇浓度对干浸膏得率的影响。
图7为造模后动物踝关节肿胀情况。
图8为蒙古莸对关节炎大鼠体重的影响。
图9为蒙古莸对关节炎大鼠足跖肿胀度的影响。
图10为蒙古莸对关节炎大鼠关节炎评分的影响。
具体实施方式
1材料与方法
1.1材料与试剂
材料：蒙古莸：2023年7月7日采摘于内蒙古自治区乌兰察布市凉城县，洗净，阴干，将干燥的蒙古莸全草粉碎后过40目筛制得蒙古莸全草粗粉。
试剂：甲醇、乙醇、丙三醇、哇哈哈纯净水、凡士林、羊毛脂、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十八醇、吐温-80、牛II型胶原蛋白、弗氏完全佐剂、甲氨蝶呤。
1.2 仪器与设备
SB-120DT超声清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE3000C旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。乳化机；电热套；真空干燥箱；烘箱。
1.3 实验动物
SD雌性大鼠（180-200g）8周龄，由内蒙古卡尔文生物技术有限公司提供。
2 实验方法及结果
2.1蒙古莸提取工艺的单因素考察
2.1.1 提取方式考察
将干燥的蒙古莸全草粉碎后过40目筛制得蒙古莸全草粗粉。取蒙古莸全草粗粉，置于连续回流装置中，加入蒙古莸全草粗粉的12倍量的95%乙醇溶液，分别采用加热回流一小时和超声一小时提取（回流加热温度100℃，超声80Hz， 40℃），采用0.45微米滤膜过滤得到过滤液，过滤液采用高效液相色谱分析（液相条件是：A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液，1ml/min流速，梯度洗脱，洗脱条件为0-60min，90%B-73%B，60-80min，73%B-20%B，80-81min，20%B-0%B，81-90min，0%B，波长331nm，进样量10ul）。结果表明（详见图1），回流提取效率最高，因此后续针对回流提取进行研究。其中，过滤提取液获得的蒙古莸提取物，再在干燥箱中烘干得到蒙古莸干浸膏。
2.1.2 提取溶剂考察
取蒙古莸全草粗粉适量，置于连续回流装置中，加入甲醇溶液、乙醇溶液及水溶液，加热回流提取。提取后，滤过，进样。结果表明（详见图2），甲醇与乙醇提取效率相当，均高于水溶液提取效率。考虑到服用安全性，选用乙醇作为提取溶剂。
2.1.3 醇浓度考察
取蒙古莸全草粗粉适量，置于连续回流装置中，分别加入 20%、40%、60%、80%、95%乙醇溶液、加热回流提取。提取后，滤过，进样。结果表明（详见图3），95%乙醇提取效率最高。
2.1.4 料液比考察
取蒙古莸全草粗粉适量，置于连续回流装置中，分别加入8倍、12倍、14倍、16倍、18倍和20倍的95 %乙醇溶液，加热回流提取。提取后，滤过，进样。结果表明（详见图4），料液比为1:18时，提取效率最高。
2.2 提取工艺的响应面考察
2.2.1响应面法优选设计：在单因素试验结果的基础上，依据响应面实验设计原理，选择提取时间（A）、料液比（B）、醇浓度（C）进行优化设计，因素水平见表1。
表1 响应面实验因素与水平
2.2.2响应面优化实验结果
2.2.2.1回归方程拟合及方差分析：采用Design-Expert 13软件对数据进行多元回归拟合,最后计算出蒙古莸干浸膏得率对提取时间（A）、料液比（B）、醇浓度（C）的二元多项回归方程：Y=25.6+3.50A+B+2.25C+1.25AB+0.75AC+0.25BC-5.42A²-5.43B²-7.43C²。响应面设计方案及实验结果见表2。
表2 响应面设计方案及实验结果
方差分析结果表明，本模型F值为29.48，P＜0.0001，表明模型效果极显著；使用该模型对成型工艺进行的分析试验是合理的。根据F值可知，各因素对蒙古莸干浸膏得率影响的大小顺序为提取时间（A）＞醇浓度（C）＞料液比（B）。模型的确定系数R2 adj值为0.9412，拟合度较高，表明此模型对蒙古莸干浸膏得率进行的分析是准确的。
由回归模型和方差分析可知，方程一次项A、C和二次项A2、B2、C2对得率的影响极显著（P＜0.01），方程一次项B和交互项AB、AC、BC对蒙古莸干浸膏得率的影响不显著。
表3 响应面实验因素与水平
注*P＜0.05，*P＜0.01。
2.2.2.2交互作用分析：经Design-Expert 13软件分析，考察交互项对于干浸膏得率的影响。A和B因素交互的等高线图和响应面图如图5所示，提取时间（A）和料液比（B）的等高线呈椭圆形；A和C因素交互的等高线图和响应面图如图6所示，提取时间（A）和醇浓度（C）的等高线呈椭圆形；响应面陡峭，响应面越敏感，效果越佳。
2.2.2.3 最佳工艺的确定：经上述实验可知，最佳成型性工艺条件为提取时间3h，醇浓度为80%，料液比为1:18。
2.3 蒙古莸软膏的制备工艺
2.3.1 乳膏剂的制备方法
称取适量的水相和油相，分别置于两个烧杯中，按照适当配比将丙三醇和纯净水混合成水相，取适量的凡士林、羊毛脂、硬脂酸混合成油相，加热至85℃，后将吐温-80缓慢加入到水相中，搅拌均匀后将混合后的水相加入到油相，利用乳化机采用200r/min转速乳化15min后，加入蒙古莸干浸膏，继续搅拌至药物均匀分布即得。
2.3.2 正交试验设计
选择硬脂酸用量（A）、凡士林用量（B）、吐温-80用量（C）、丙三醇用量（D）作为影响因素，以耐寒实验、耐热试验、离心试验及感官评价为指标对蒙古莸软膏进行评价，评分细则如表4，并采用L9（34）正交试验设计优选最佳处方并进行方差分析。
表4 蒙古莸软膏评分标准表
2.3.3 正交试验结果
正交试验设计结果表明如表5所示。其中可知，影响因素A、B、C、D对蒙古莸软膏评分影响为B＞D＞A＝C。方差分析结果见表6，由表6可知吐温-80用量对蒙古莸软膏成型的影响显著（P＜0.05）。最优处方为A3B2C1D3(即表5中A3B2C1D3是方案8的处方配比)，即最优处方组成为硬脂酸3.5份、凡士林1.5份、吐温-80 5份、丙三醇7份。因此，软膏配方为丙三醇7份、水18份，吐温-80 5份、硬脂酸3.5份、单硬脂酸甘油酯4份、凡士林1.5份、十八醇2份、羊毛脂2份，蒙古莸干浸膏2.7份,即，油相中再加入4份单硬脂酸甘油酯和2份十八醇。
表5 正交试验设计结果
表6 方差分析表
注：*P＜0.05。
2.4 动物实验
2.4.1 分组与给药
基于上述研究，采用下述配方的蒙古莸软膏进行动物实验：蒙古莸干浸膏用量为2.7份，硬脂酸用量为3.5份，凡士林用量为1.5份，吐温-80用量为5份，丙三醇用量为7.0份，羊毛脂用量为2份。
将大鼠适应性饲养一周后随机分为空白对照组、胶原诱导性关节炎模型组、甲氨蝶呤阳性药组(MTX组)，蒙古莸软膏组，每组10只。在冰浴环境下将牛II型胶原蛋白和弗氏完全佐剂等比例混合并完全乳化，制得牛II型胶原乳剂，浓度为1 mg/mL。除空白对照组外，其余各组于大鼠尾基部注射0.2 mL牛II型胶原乳剂。7 d后进行加强免疫，于大鼠尾基部注射0.2 mL牛II型胶原乳剂，建立CIA大鼠模型。关节炎评分≥4分视为造模成功。空白对照组大鼠则于尾基部注射等量的生理盐水。在加强免疫后第7天开始给药干预。MTX组给药方式为灌胃给药，蒙古莸软膏组给药方式为体外涂抹，蒙古莸软膏组给药量为0.144 g/kg/d（临床等效计量4倍）。MTX组给药量为0.33 mg/kg/d。所有组别均连续给药28天。
2.4.2 一般状态观察
试验期间，每天观察并记录动物的进食量、行为、状态、毛色等一般情况。且在牛II型胶原乳剂初次免疫前及初次免疫后每3天进行大鼠体重测量，并记录数值。初次免疫后第3日，造模动物相继出现足趾皮肤发红、发热，轻度肿胀；致炎第9日，足背及踝关节明显肿胀，部分动物出现骨关节僵硬，活动减少，体重增长减慢，毛发无光泽，详见图7。
2.4.3 关节肿胀程度及关节炎指数评价
牛II型胶原乳剂初次免疫前及初次免疫后每3天采用游标卡尺及卷尺测量大鼠足部关节肿胀及踝关节周长情况，并参照关节炎评分标准对各组大鼠进行关节炎指数评价。评分标准如下：
0分：无红色斑点或关节部位肿胀；
1分：有红色斑点或关节部位轻度肿胀；
2分：关节部位中度肿胀；
3分：关节部位严重肿胀；
4分：关节部位肿胀严重，且影响正常活动。
每只大鼠评分为四肢足部评分总和，上限为16分，评分越高说明关节炎症状越严重。
2.4.4 蒙古莸软膏对关节炎大鼠体质量、肿胀度及关节炎指数评价的影响
经过14天的Ⅱ型胶原造模后，大鼠体质量减轻，足趾相继出现红肿，关节肿大，关节畸形，导致行走艰难，严重的甚至会丧失活动能力，说明成功建立了CIA关节炎大鼠模型。连续给药过程中检测大鼠的体质量、足趾肿胀度及关节炎评分，如图8、9、10所示。结果表明随着给药时间的延长，蒙古莸软膏组及甲氨蝶呤阳性药组可改善关节炎大鼠的体质量。给药7天后，蒙古莸软膏显著降低大鼠的足趾肿胀度，给药10～28天后蒙古莸软膏组及甲氨蝶呤阳性药组均显著降低足趾肿胀度。在给药4天后，蒙古莸软膏组和阳性药组的关节炎评分均明显下降，随着给药时间的延长，直至给药28天时，软膏组和阳性药组均可显著降低模型组大鼠的关节炎评分。综上说明，蒙古莸软膏可改善关节炎大鼠状态，具有明显的抗炎作用，表现在改善足趾肿胀度、降低关节炎评分方面。
Claims (5)
1.一种蒙古莸抗炎软膏的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将丙三醇和纯净水混合成水相，取凡士林、羊毛脂、硬脂酸混合成油相，加热至80-90℃，后将吐温-80缓慢加入到水相中，搅拌均匀后将混合后的水相加入到油相，利用乳化机乳化后，加入蒙古莸干浸膏，继续搅拌至药物均匀分布即得；油相中还混合有单硬脂酸甘油酯和十八醇；
其中，蒙古莸干浸膏用量为1.35-13.5份，硬脂酸用量为2.5-3.5份，凡士林用量为1.0-2.0份，吐温-80用量为5.0-7.0份，丙三醇用量为5.0-7.0份，羊毛脂用量为1-3份；
且所述蒙古莸干浸膏由下述方法得到：将干燥的蒙古莸全草粉碎后过筛制得蒙古莸全草粗粉，置于连续回流装置中，加入蒙古莸全草粗粉的8-20倍量的60-95%乙醇溶液，加热回流提取0.5-4小时后，过滤提取液获得蒙古莸提取物，再烘干得到蒙古莸干浸膏；
以及油相中单硬脂酸甘油酯用量为0.4-40份，十八醇用量为0.2-20份。
2.根据权利要求1所述的蒙古莸抗炎软膏的制备方法，其特征在于，蒙古莸干浸膏用量为2.7份，硬脂酸用量为3.5份，凡士林用量为1.5份，吐温-80用量为5份，丙三醇用量为7.0份，羊毛脂用量为2份。
3.根据权利要求1所述的蒙古莸抗炎软膏的制备方法，其特征在于，加入蒙古莸全草粗粉的8倍、12倍、14倍、16倍、18倍或20倍量的60%、80%或95%乙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的蒙古莸抗炎软膏的制备方法，其特征在于，加入蒙古莸全草粗粉的18倍量的80%乙醇溶液，加热回流提取3小时。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法制备获得的蒙古莸抗炎软膏。
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