CN103623144B - 仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用。所述仁青常觉为将其配方药材制备活性成分后制成的浓缩丸或糖衣片或薄膜包衣片或胶囊。所述的活性成分为石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提取物中的一种或多种。本发明克服了现有技术应用方面的技术偏见，通过药理实验发现，仁青常觉的多种提取物体外对卵巢癌细胞有较好的抑制作用，其效果与顺铂相当或略优；仁青常觉的多种提取物的含药血清体外对卵巢癌也均有显著的抑制作用（P<0.05），其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水提取物的效果略优于顺铂。

Description

仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

卵巢癌是女性常见的肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌的病因尚不清楚，其发病可能与年龄、生育、血型、精神因素及环境等有关。

仁青常觉系藏族验方，成方于公元八世纪，最早是藏王、班禅、达赖以及达官贵人专用药，历经一千多年的应用历史，现如今，仁青常觉收载于《中国药典》（2010版）一部中。仁青常觉由珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、诃子、牛黄、人工麝香、西红花等一百余味药组成，功能为清热解毒、调和滋补。用于“隆、赤巴、培根”各病，陈旧性胃肠炎、溃疡，“木布”病，萎缩性胃炎，各种中毒症；梅毒，麻风，陈旧热病，炭疽，疖痛，干黄水，化脓等。现代药效学研究结果表明，本品具有抗炎、抑制溃疡形成、促进溃疡愈合等作用。急性毒性试验，长期毒性试验结果表明，本品无明显毒性。临床应用结果表明，本品治疗消化系统疾病，如各种急慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、肝硬化、化疗后消化道不良反应等方面显示良好疗效，并且有良好的保健作用，是藏医保健药品之一。

仁青常觉的功能主治、文献、专利等方面均未发现其可用于治疗卵巢癌的研究。

发明内容

本发明目的是提供仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

术语说明：

仁青常觉是《中国药典》（2010版）一部中记载的药品名称,市场可购。

本发明的技术方案如下：

仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

优选的，上述仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述仁青常觉为将其配方药材制备活性成分后制成的药学制剂。

上述仁青常觉活性成分包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提取物中的一种或多种，其中所述的：

A、石油醚提取物是按如下方法制得的：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数6倍体积的石油醚沸腾提取3次，每次1小时，40℃-50℃减压回收石油醚，即得；

B、乙酸乙酯提取物是按如下方法制得的：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数6倍体积的乙酸乙酯进行沸腾提取3次，每次1小时，50℃-60℃减压回收乙酸乙酯，即得；

C、乙醇提取物是按如下方法制得的：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数8倍体积的乙醇提取3次，每次1.5小时，50℃-60℃减压回收回收乙醇，干燥，即得；

D、水提取物是按如下方法制得的：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数8倍体积的水煎煮2次，每次2小时，滤过，滤液蒸干，即得。

上述药学制剂为浓缩丸、糖衣片、薄膜包衣片或胶囊。

本发明中体积与重量的对应关系为ml/g或l/kg。

本发明所述的回收乙醇和浓缩工艺参数为-0.07～-0.09Mpa，产品减压干燥的工艺参数为70℃，-0.08～-0.09Mpa，其它未特别说明的均为药学生产上惯用的参数或方法。

有益效果

在仁青常觉的应用治疗领域，人们熟知其清热解毒、调和滋补的作用，熟知其用于“隆、赤巴、培根”各病，陈旧性胃肠炎、溃疡，“木布”病，萎缩性胃炎，各种中毒症；梅毒，麻风，陈旧热病，炭疽，疖痛，干黄水，化脓等的治疗。

本发明克服了上述应用方面的技术偏见，通过药理实验发现，仁青常觉乙酸乙酯提取物、仁青常觉石油醚提取物体外对卵巢癌细胞有较好的抑制作用，其效果与顺铂相当或略优；而仁青常觉的4种提取物的含药血清体外对卵巢癌也均有显著的抑制作用（P<0.05），其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水提取物的效果略优于顺铂。

具体实施方式

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1、仁青常觉各提取物的制备

一、样品

仁青常觉，青海金诃藏药药业股份有限公司生产，批号：20100707

二、方法和步骤

1、石油醚提取物：取仁青常觉研细后的细粉50g，以其重量数6倍体积的石油醚（60℃～90℃）沸腾提取3次，每次1小时。40℃-50℃减压回收石油醚，得石油醚提取物2.71g。

2、乙酸乙酯提取物：取仁青常觉研细后的细粉50g，以其重量数6倍体积的乙酸乙酯进行沸腾提取3次，每次1小时。50℃-60℃减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物7.66g。

3、乙醇提取物：取仁青常觉研细后的细粉50g，以其重量数8倍体积的乙醇提取3次，每次1.5小时，50℃-60℃减压回收回收乙醇，干燥。得乙醇提取物4.68g。

4、水提取物：取仁青常觉研细后的细粉50g，以其重量数8倍体积的水煎煮2次。每次2小时，滤过，滤液蒸干。得水提取物4.76g。

实验例2、仁青常觉对卵巢癌的抑制作用

一、实验原理

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，甲瓒结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的甲瓒结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

二、药物及试剂

1、动物

SPF级健康昆明种小鼠90只，体重30±2g，由山东鲁抗医药股份有限公司新实验动物提供，动物合格证号：SCXK鲁20130001。

2、实验细胞

卵巢癌（skov3）细胞，由山东省立医院提供。

3、实验药物

实验药物：实验例1制备的仁青常觉各提取物，各加生理盐水配制成500ml的混悬液。

阳性对照药物：顺铂，批号：1010041DC。

试剂：1640细胞培养基（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胎牛血清（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胰酶细胞消化液（碧云天）,青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺铂（齐鲁制药有限公司，批号：1010041DC）。

4、实验仪器

立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50FBS,上海申安）；双人单面净化工作台（SW-CJ-1C，苏州净化）；二氧化碳培养箱；台式离心机；酶标仪(MK3,赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱（101，上海鹏顺科学仪器有限公司）；倒置显微镜（XDS-1B，重庆光学仪器厂）；水浴恒温振荡器（SHZ-82，金坛市医疗仪器厂）；移液器；培养瓶；96孔板。

三、实验方法

1、仁青常觉体外对卵巢癌细胞的抑制作用实验

（1）细胞复苏和培养

从超低温冰箱中取冻存的卵巢癌（skov3）细胞，迅速投入预先加热到37℃的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心三分钟，收集细胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鲜培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养。

（2）接种

待细胞生长至80%融合时，以0.25%的胰酶细胞消化液（含0.02%EDTA）进行消化，以1×10^{^4}个细胞每孔接种于96孔板中，预留三个调零孔，调零孔只加不含血清的1640培养基，不加细胞。

（3）加药

待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组、空白对照组加100μL不含血清的1640培养基，阳性对照组加10μg/ml顺铂100μl。其他给药组每孔分别加入含梯度稀释浓度的筛选药物的1640培养基100μl，加药一排。然后细胞在37℃、5%CO₂培养箱中继续培养24h，所加药物浓度为折算后的仁青常觉原药浓度。

（4）测定

MTT法测定细胞存活率：在每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl于培养箱内避光反应4h。然后加入100μLDMSO用酶标仪于492nm测定OD值，计算抑制率：细胞生长抑制率=（对照组吸光度平均值—实验组吸光度平均值）/对照组吸光度平均值×100％。

2、仁青常觉含药血清体外对卵巢癌细胞的抑制作用实验

（1）细胞复苏和培养

从超低温冰箱中取冻存的卵巢癌（skov3）细胞，迅速投入预先加热到37℃的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心三分钟，收集细胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鲜培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养。

（2）含药血清的制备

昆明种小鼠90只，随机分为6组，空白对照组、顺铂组、仁青常觉石油醚提取物组、仁青常觉乙酸乙酯提取物组、仁青常觉乙醇提取物组、仁青常觉水提取物组，每组15只。仁青常觉各提取物组的给药浓度相当于10mg仁青常觉原药/ml，顺铂组给药浓度为10μg/ml。各组小鼠连续灌胃3天，每天每只0.5ml，相当于人体最大建议剂量的100倍。其中空白对照组给予生理盐水。最后一天灌胃后1小时，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3000转/min离心，取上层血清，-80℃保存。同组血清混合，0.22μm微孔滤膜过滤除菌于备用。

（3）MTT法测定含药血清对不同肿瘤细胞生长的抑制状况

将CO2培养箱中培养的卵巢癌（skov3）细胞，以0.25%的胰酶细胞消化液（含0.02%EDTA）进行消化，以1×10^{^4}个细胞每孔接种于96孔板中，预留三个调零孔，调零孔只加不含血清的1640培养基，不加细胞。待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组、空白对照组加100μL不含血清的1640培养基，每孔分别加入含含药血清的1640培养基100μl，每个浓度的药物加6孔。然后细胞在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h。加入5mg/mlMTT溶液20μl于培养箱内避光反应4h。然后加入100μLDMSO用酶标仪于492nm测定OD值，计算抑制率：细胞生长抑制率=（对照组吸光度平均值—实验组吸光度平均值）/对照组吸光度平均值×100％。

四、实验结果

所有数据均以（X±SD）显示，采用GraphPadPrism5软件分析处理数据，利用t检验观察各组与空白组之间是否存在显著性差异，P<0.05为差异显著。

1、仁青常觉体外对卵巢癌细胞的抑制作用实验

对各种药物进行IC50计算，IC50值低于250μg/ml的药物进行验证。验证后的所有数据以X±SD表示，t检验比较组间差异的显著性，P<0.05为差异显著。

IC₅₀值低于250μg/ml的药物为：仁青常觉石油醚提取物，IC₅₀值为92.29。其他药物IC₅₀值偏大或者对癌细胞没有抑制作用，不再做验证试验。其中，仁青常觉乙醇提取物、仁青常觉乙酸乙酯提取物的量效关系不明显，选择对癌细胞抑制作用较好的浓度做验证试验。实验结果见表1：

表1不同提取物对卵巢癌细胞的抑制率（n=6，±SD）

与空白对照组比较，*P<0.05

采用GraphPadPrism5软件分析处理数据，利用t检验观察各组与空白组之间是否存在显著性差异，结果显示，顺铂、仁青常觉乙酸乙酯提取物、仁青常觉石油醚提取物与空白组有显著性差异，其他各组与空白组之间没有显著性差异，说明仁青常觉乙酸乙酯提取物、仁青常觉石油醚提取物对卵巢癌细胞有较好的抑制作用，其效果与顺铂相当或略优。

2、仁青常觉含药血清体外对卵巢癌细胞的抑制作用实验

表2、仁青常觉含药血清对卵巢癌的抑制率（n=15，x±SD，单位：%）

注：与空白对照组比较，*P<0.05，

由表2结果可以看出，仁青常觉4种提取物的含药血清对卵巢癌均具有显著的抑制作用（P<0.05），其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水提取物的效果略优于顺铂。

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

实施例1

仁青常觉，1g/丸，1日1丸，隔3—7天服1克(1丸)；研碎后黎明空腹服用。

实施例2

仁青常觉浓缩丸，0.2g/丸，1日1丸，隔3—7天服1丸，是按如下方法制备的：

A、石油醚提取物：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数6倍体积的石油醚沸腾提取3次，每次1小时，40℃-50℃减压回收石油醚，即得。

B、乙酸乙酯提取物：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数6倍体积的乙酸乙酯进行沸腾提取3次，每次1小时，50℃-60℃减压回收乙酸乙酯，即得。

C、乙醇提取物：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数8倍体积的乙醇提取3次，每次1.5小时，50℃-60℃减压回收回收乙醇，干燥，即得。

D、水提取物：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数8倍体积的水煎煮2次，每次2小时，滤过，滤液蒸干，即得。

将上述石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物粉碎后，混合均匀，以水泛丸成0.2g/丸，即得，每丸相当于仁青常觉原制剂2丸。

实施例3

仁青常觉糖衣片，0.5/片，1日1片，隔3—7天服1片，含石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物四种活性组分，其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物的制备方法同实施例2，最后将四种活性组分粉碎后，混合均匀，加入淀粉、滑石粉等辅料制成素片并包糖衣，即得，每片相当于仁青常觉原制剂2丸。

实施例4

仁青常觉薄膜包衣片，0.5/片，1日1片，隔3—7天服1片，含石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物四种活性组分，其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物的制备方法同实施例2，最后将四种活性组分粉碎后，混合均匀，加入淀粉、滑石粉等辅料制成素片并包薄膜衣，即得，每片相当于仁青常觉原制剂2丸。

实施例5

仁青常觉胶囊，0.5/粒，1日1粒，隔3—7天服1粒，含石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物四种活性组分，其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物的制备方法同实施例2，最后将四种活性组分粉碎后，混合均匀，加入淀粉、滑石粉等辅料制成胶囊，即得，每粒相当于仁青常觉原制剂2丸。

实施例6

仁青常觉胶囊，0.5/粒，1日1粒，隔3—7天服1粒，含石油醚提取物、乙酸乙酯提取物两种活性组分，两种活性组分的制备方法同实施例2，最后将两种活性组分粉碎后，混合均匀，加入淀粉、滑石粉等辅料制成胶囊，即得，每粒相当于仁青常觉原制剂2丸。

实施例7

仁青常觉浓缩丸，0.5/丸，1日1丸，隔3—7天服1丸，含石油醚提取物、乙酸乙酯提取物两种活性组分，两种活性组分的制备方法同实施例2，最后将两种活性组分粉碎后，混合均匀，用水泛丸即得，每丸相当于仁青常觉原制剂2丸。

实施例8

仁青常觉浓缩丸，0.5/丸，1日1丸，隔3—7天服1丸，含石油醚提取物一种活性组分，活性组分的制备方法同实施例2，最后将该活性组分粉碎后，混合均匀，用水泛丸即得，每丸相当于仁青常觉原制剂2丸。

实施例9

仁青常觉胶囊，0.5/粒，1日1粒，隔3—7天服1粒，含乙酸乙酯提取物一种活性组分，该活性组分的制备方法同实施例2，最后将该活性组分粉碎后，混合均匀，加入淀粉、滑石粉等辅料制成胶囊，即得，每粒相当于仁青常觉原制剂2丸。

Claims (2)

1.仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述仁青常觉为将其配方药材制备活性成分后制成的药学制剂；所述仁青常觉活性成分包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物中的一种或两种，其中所述的：

A、石油醚提取物是按如下方法制得的：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数6倍体积的石油醚沸腾提取3次，每次1小时，40℃-50℃减压回收石油醚，即得；

B、乙酸乙酯提取物是按如下方法制得的：取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，以其重量数6倍体积的乙酸乙酯进行沸腾提取3次，每次1小时，50℃-60℃减压回收乙酸乙酯，即得。

2.根据权利要求1的仁青常觉在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述药学制剂为浓缩丸、糖衣片、薄膜包衣片或胶囊。