CN104490877B - 左旋延胡索乙素衍生物的新用途 - Google Patents

左旋延胡索乙素衍生物的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了左旋延胡索乙素衍生物的新用途。所述新用途为式Ⅱ所示的左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤新生血管抑制剂方面的应用。体外抗癌活性试验结果表明，左旋延胡索乙素各衍生物对人非小细胞肺癌A549、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和新生血管的增殖均具有较好的抑制作用。此结果表明，本发明中式Ⅱ所示的左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐可用于制备肿瘤新生血管抑制剂，拓宽了左旋延胡索乙素衍生物的医药应用。

Description

左旋延胡索乙素衍生物的新用途
技术领域
本发明涉及左旋延胡索乙素衍生物的新用途，特别涉及左旋延胡索乙素衍生物在新生血管抑制剂方面的应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康和生命的重大疾病之一。在我国，据卫生部的统计资料表明：目前每年新生肿瘤患者总数约为212.7万人左右，其中有106万左右的恶性肿瘤新生患者。尽管半个多世纪以来抗肿瘤药物的研发与应用取得了重要进展，某些类型肿瘤的化疗取得突出的疗效。但是，目前对于大多数类型的药物治疗效果仍难以令人满意。因此，发现和研发新型抗肿瘤药物仍然是生物医药科学领域重要的课题与任务。
近些年的研究表明，肿瘤血管在实体瘤的发生发展中具有重要的作用。有功能性血供是肿瘤生长及转移的关键,如果没有血管系统提供氧气和养料,实体瘤的增长不会超过1mm3。肿瘤细胞诱导的新生血管结构存在缺陷,分布方式无序,也无完整的微循环功能,与宿主正常组织的血管存在较大差异,属于未分化成熟的血管。肿瘤新生血管越多,肿瘤生长增殖越快,发生转移的机率就越高。肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的关键,调节肿瘤血管的生长就可能控制肿瘤的生长并抑制肿瘤的转移。鉴于其在肿瘤发生发展中的重要作用,肿瘤血管已成为抗肿瘤治疗的一个重要靶点。
延胡索乙素是从中药延胡索中提取的生物碱，其结构式如式Ⅰ所示。延胡索乙素的左旋体具有镇痛作用。左旋延胡索乙素是新中国成立以来用现代科学技术研究中医药获得成功的第一个神经系统药物。近年来的研究还发现，左旋延胡索乙素具有降压、抗心率失常、抗血栓、钙拮抗、抑制胃酸分泌等药理作用(徐婷，金昔陆，曹慧明，延胡索乙素药理作用的研究进展，中国临床药学杂志，2001，10(1)：58-60)。
因此，如何基于延胡索乙素或其衍生物来预防和/或治疗肿瘤亟需深入的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐的新用途。
本发明所提供的新用途为左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐在制备新生血管抑制剂方面的应用。
所述左旋延胡索乙素衍生物的结构式如式II所示，其中R1、R2、R3和R4分别选自OH或OCH3。
所述左旋延胡索乙素衍生物进一步优选为式III、式IV或式V所示的左旋延胡索乙素衍生物。
所述左旋延胡索乙素衍生物药学上可接受的盐具体可为碘盐或溴盐。
所述新生血管为肿瘤新生血管；所述肿瘤为实体瘤；所述实体瘤为肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、辜丸癌、皮肤癌、胃癌、鼻咽癌、结肠癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌。
本发明的另一个目的在于提供一种新生血管抑制剂。
所述新生血管抑制剂的有效成分为式II所示的左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐，优选为式III、式IV或式V所示的左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐。
所述新生血管为肿瘤新生血管；所述肿瘤为实体瘤；所述实体瘤为肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、辜丸癌、皮肤癌、胃癌、鼻咽癌、结肠癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌。
所述左旋延胡索乙素衍生物药学上可接受的盐具体可为碘盐或溴盐。
所述新生血管抑制剂可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
以左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐为活性成分的新生血管抑制剂，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
用左旋延胡索乙素衍生物或其药学上可接受的盐制备的新生血管抑制剂可以制成注液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明所述的式II所示化合物及其或其药学上可接受的盐也属于本发明的保护范围。
本发明人以左旋延胡索乙素为母核，设计得到了一系列左旋延胡索乙素的衍生物，并筛选出在肿瘤新生血管抑制方面活性较强的左旋延胡索乙素的衍生物，通过利用四氮唑(MTT)还原法检测左旋延胡索乙素系列衍生物的体外抗肿瘤活性。并利用人脐带静脉内皮细胞模型，评价了左旋延胡索乙素对肿瘤新生血管的抑制作用，发现左旋延胡索乙素系列衍生物或其药学上可接受的盐对肿瘤新生血管具有较强的抑制作用，通过阻断肿瘤新生血管给肿瘤提供氧气和养料的通道，控制肿瘤的生长及转移。其可用于制备预防和/或治疗与肿瘤新生血管相关的疾病的药物。本发现不仅拓宽了该左旋延胡索乙素系列衍生物或其药学上可接受的盐的药用范围，而且非常有希望开发成为一种新型高效、低毒的抗肿瘤药物，尤其是抗肿瘤新生血管相关疾病的药物。
附图说明
图1为实施例3中左旋延胡索乙素衍生物(V)对CAM新生血管抑制作用图，其中，A为阴性对照组，B为左旋延胡索乙素衍生物(V)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的式III、式IV和式V所示的左旋延胡索乙素衍生物的合成路线参照下述文献：Zhong-Ze Ma,Wei Xu,Niels H.Jensen,Bryan L.Roth,Lee-Yuan Liu-Chenand David Y.W.Lee,Molecules 2008,13,2303-2312；Ying-Hong Li,Peng Yang,Wei-JiaKong,Yan-Xiang Wang,Chang-Qin Hu,Zeng-Yan Zuo,Yue-Ming Wang,Hong Gao,Li-MeiGao,Yan-Chun Feng,Na-Na Du,Ying Liu,Dan-Qing Song and Jian-Dong Jiang,J.Med.Chem.2009,52,492–501.
实施例1、左旋延胡索乙素衍生物对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制实验
1、材料：
四甲基偶氮唑蓝(MTT)：用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT，使其终浓度为5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
细胞株：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购于北京协和细胞资源中心)；
2、具体操作步骤如下：
1)参照相关文献方法(中国药理学与毒理学杂志，2011，25(6)：543-545；药学学报，2009,44(12):1359-1363；黑丑提取物的抗肿瘤活性及其机理研究，解放军药学学报，2010,26(6):489-492)，将处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞
(HUVEC)制成细胞悬液，在96孔板每孔接种含有1.0×104个HUVEC细胞的100μl培养基，于37℃，5％CO2的培养箱内培养24h。
2)将左旋延胡索乙素衍生物(III、IV和V)分别溶解于DMSO中，用DMEM完全培养液稀释成20μg/mL，其中DMSO含量为1％(体积百分含量)；将左旋延胡索乙素衍生物(III、IV和V)加入上述人脐静脉内皮细胞的培养孔内，各自接种5个孔，每孔加入100μl，对照组分别对应为上述人脐静脉内皮细胞的培养孔内加入含1％(体积百分含量)DMSO的DMEM完全培养液100μl，也接种5个孔；将96孔培养板置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养48h。
3)向步骤2)中已培养48h后的96孔培养板的每孔中加入20μl新鲜配制的5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液，37℃，5％CO2的培养箱内继续培养4h。
4)弃去上清液，每孔加入150μL的DMSO溶解MTT formazon沉淀，并将96孔培养板置于微量震荡器上震荡5min，以使紫色结晶充分溶解，然后，置酶联免疫检测仪上，测定波长570nm处的各孔的吸光度。按下列公式计算HUVEC细胞的生长抑制率：
左旋延胡索乙素衍生物(III、IV和V)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制作用见表1。
表1 左旋延胡索乙素衍生物对人脐静脉内皮细胞增殖抑制实验结果
上述结果表明，左旋延胡索乙素衍生物对人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖具有抑制作用。
实施例2、MTT还原法检测左旋延胡索乙素衍生物的体外抗癌活性试验
MTT法的基本原理为：四氮唑[MTT，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5–diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP、nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲瓒，而死细胞则无此功能。用二甲基亚砜(DMSO、Dimethyl sulfoxide)溶解甲瓒后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。
1、材料：
四氮唑盐(MTT)：用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT，使其终浓度为5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
肿瘤细胞株：人非小细胞肺癌细胞株A549(中国科学院上海细胞生物学研究所)；
2、具体操作步骤如下：
1)将对数生长期的人肺癌细胞A-549用0.25％的胰蛋白酶消化，然后用含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM完全培养液制成细胞悬液，将肿瘤细胞稀释至1.0×105个/ml，分别接种至96孔培养板中，每孔200μl，于37℃，5％CO2的培养箱内培养24h，然后倾去各孔培养液。
2)将左旋延胡索乙素衍生物(III、IV和V)分别溶解于DMSO中，用DMEM完全培养液稀释成50μg/mL，其中DMSO含量为1％(体积百分含量)；将左旋延胡索乙素衍生物(III、IV和V)加入上述肿瘤细胞A-549的培养孔内，各自接种5个孔，每孔加入200μl；对照组分别对应为上述肿瘤细胞的培养孔内加入含1％(体积百分含量)DMSO的DMEM完全培养液至孔内体积200μl，也接种5个孔；空白组为向不含肿瘤细胞的空培养孔内加入200μl的DMEM完全培养液；将其置于37℃，5％CO2的培养箱内培养72h。
3)3天后向每孔加入20μl新鲜配制的5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液，37℃，5％CO2的培养箱内继续培养4h。
4)小心弃上清，每孔加入200μL DMSO溶解MTT formazon沉淀，室温放置15-20min，每5min振荡一次。
5)在酶标仪上测定波长490nm处的光密度值(OD值)，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。
本实验中的OD对照、OD实验值均为扣除掉OD空白的值。
实验设三次重复，左旋延胡索乙素衍生物(III、IV和V)对人肺癌细胞A-549的抑制作用的结果见表2。
表2 左旋延胡索乙素衍生物对人肺癌细胞株A549的体外细胞毒性试验结果
上述结果表明，左旋延胡索乙素衍生物(III、IV和V)对人非小细胞肺癌A-549具有一定程度的抑制作用。
实施例3、鸡胚绒毛尿囊膜法(CAM)测定左旋延胡索乙素衍生物(III、IV或V)对新生血管的抑制实验
鸡胚绒毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)形成于胚胎早期，此时鸡胚机体的免疫系统尚未完全建立，对各种异物几乎不发生排斥反应，将含药载体置于其表面，可观察药物对血管生成的影响，该鸡胚模型对抗血管生成药物敏感，目前被采用于药物筛选[Ribatti D.The chick embryo chorioallantoic membrane in the studyof tumor angiogenesis[J].Rom J Morphol Embryol,2008,49(2):131-135；RibattiD.The chick embryo chorioallantoic membrane as an in vivo assay to studyantiangiogenesis[J].Pharmaceuti cals,2010,3(3):482-513.]。
实验具体操作如下：
将德国罗曼鸡胚蛋(其中，德国罗曼鸡胚蛋由北京农业大学畜牧养殖场提供，蛋质量50～60g)放于37℃，恒湿65％的孵化箱中孵育3天，在无菌的环境下，用注射器每蛋抽取约2mL蛋清后石蜡封闭针孔，继续孵育4天。于蛋气囊顶端无菌开一直径约1cm左右小窗口，而后迅速在每颗蛋的CAM上分别植入载有左旋延胡索乙素衍生物的直径约3mm的明胶海绵(其中，左旋延胡索乙素衍生物III、IV或V的载入量为20μg/蛋，左旋延胡索乙素衍生物III、IV或V溶于含有1％CMC-Na的生理盐水中，并通过明胶海绵进行吸附)，放于尿囊膜上。无菌透明胶带封闭窗口，放回孵育箱再次孵育48小时。揭开封口胶带，以甲醇-丙酮(1：1)溶液固定10min，剥离CAM膜置于载玻片上，解剖显微镜下拍照。借助图像处理软件(ImageProfessional Plus 5.0)，评价左旋延胡索乙素衍生物(III、IV或V)对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。其相应结果如表3和图1所示。
表3 左旋延胡索乙素衍生物(III、IV或V)对CAM新生血管抑制作用

Claims (3)

1.式IV或式V所示化合物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤新生血管抑制剂方面的应用，
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述式IV或式V所示化合物的药学上可接受的盐为碘盐或溴盐。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为实体肿瘤；
所述实体肿瘤为肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、鼻咽癌、结肠癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌。
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