CN104490942B - 桑黄作为治疗肿瘤药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了桑黄作为治疗肿瘤药物的应用，所制备的药物对肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃肠间质瘤等肿瘤具有较好的疗效，不仅为桑黄在制备抗肿瘤药物中的应用及其临床推广提供了理论依据，而且对桑黄资源的综合利用和产业化发展具有重要意义，具有重要的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及桑黄作为治疗肿瘤药物的应用，属药品技术领域。
背景技术
肿瘤是一类常见病和多发病，是机体组织细胞在内外各种致瘤因素长期作用下，发生基因突变失去对其生长和分化的正常调控，引起克隆性异常增生和分化所形成的新生物或赘生物。肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，恶性肿瘤又细分为来源于上皮组织的癌、来源于间叶组织的肉瘤和癌肉瘤三类。通常人们所说的“癌症”是泛指所有的恶性肿瘤。
恶性肿瘤是威胁人类健康最主要的恶性疾病之一，是目前全球人口的第一死因，最新数据统计，2007年，全球有约790万人死于各类癌症，占死亡总数的13％，有超过1200万个肿瘤病例被确诊，其中72％以上肿瘤患者和致死病例都发生在不发达国家，且呈不断上升的趋势，预计2015年，全球肿瘤致死人数将增至900万人，2030年将超过1200万人；目前，我国每年癌症发病人数约280万，死亡人数超过40万人，位列我国各类疾病致死原因之首，并呈不断上升趋势。随着社会生活节奏加快，竞争压力增大，以及人类的生活方式和环境的改变，肿瘤发病率和死亡人数正逐年增长，已成为现代社会的常见病和高发病，不仅严重影响患者的生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担，也是困扰全球的重大社会问题，癌症的治疗和预防始终是全球范围类最为迫切的问题之一。目前，化学药物治疗是抗击肿瘤的主要手段，虽然有较好的疗效，但是常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反应，使患者难以坚持治疗，并且化疗药物在治疗过程中出现的耐药性已成为目前临床治疗中的难题之一。近年来，全球抗肿瘤药物市场呈快速增长态势，据美国FDA统计数据，全球抗癌药物市场销售总额由2004年的240亿美元，激增至2007年的396亿美元。虽然全球每年都不断有新型抗肿瘤药物问世，但至今人类仍然没有一种有效的手段战胜癌症，同时不断发现新的癌症种类，以及肿瘤抗/耐药性的产生和增强，使得对发现新型有效抗癌药物的需要显得尤为迫切。纵观全球1981至2002年期间所开发的抗癌药物，约60％直接或间接来自于天然产物，充分表明自然界是人类获取抗肿瘤药物的最重要的源泉。植物中广泛存在着具有抗肿瘤作用的活性成分，喜树碱、长春新碱和紫杉醇等的先后被发现，标志着天然抗癌药物研究所取得的重大进展，我国中药资源丰富，从传统的药用资源中寻找抗肿瘤药物是完全可行的。
桑黄，基原为多孔菌科针层孔菌的子实体，拉丁学名：phellinusigniarius(L.ex Fr.)Quel。又名：火木层孔菌，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形。现代研究证实桑黄含有酚类、黄酮、多糖等有效成分，具有免疫调节、抗肿瘤等多方面的药理活性，因此，桑黄作为抗肿瘤药物是可行的。
发明人所在的研究团队于去年申报了中国发明专利—桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用(发明专利号201410023184.3，已经进入实质审查阶段)，公开了桑黄子实体的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位抗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用。研究组继续对桑黄抗肿瘤作用进一步研究，体外对肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃肠间质瘤等43种肿瘤细胞株进行高通量筛选，发现桑黄对肺癌细胞系H460、H526，结肠癌细胞系COLO205，宫颈癌细胞系Hela，前列腺癌细胞系DU145，人骨肉瘤细胞U20S，肝癌细胞系HepG2，淋巴癌细胞系TMD8、NAMLWA、Z-138，乳腺癌细胞系MCF-7，膀胱癌EJ，急性髓性白血病细胞系NOMO-1、SKM-1、NB4、HEL、Raji，胃肠间质瘤细胞GIST-T1，抑制效果较为明显，在药物测试浓度为150μg/ml时，抑制率均大于80％(见表1)；研究组从上述肿瘤中随机抽取三种，即肺癌、白血病、淋巴癌，在整体动物模型上进行验证，研究发现桑黄对肺癌、白血病、淋巴癌的老鼠有明显的治疗作用。说明不仅桑黄提取物有抗癌作用，桑黄也具有较好的抗癌作用；桑黄不仅对肝癌、子宫颈癌、乳腺癌有疗效，而且对其它肿瘤也有较好的治疗作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桑黄作为治疗肿瘤药物的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
桑黄作为治疗肿瘤药物的应用。
所述药物中以桑黄为唯一活性成分。
所述药物是在现有技术的基础上，采用中药制剂常规方法制备成任何可药用的制剂。
所述肿瘤是肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃肠间质瘤。
本发明的有益效果：
本发明证明了桑黄具有较好的抗肿瘤作用，尤其对肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃肠间质瘤等肿瘤具有较好的疗效，不仅为桑黄在制备抗肿瘤药物中的应用及其临床推广提供了理论依据，而且对桑黄资源的综合利用和产业化发展具有重要意义，具有重要的经济效益和社会效益。
为了更好地理解本发明，下面以桑黄治疗肿瘤的主要药效学试验进一步说明。试验效果旨在进一步说明本发明的作用，而非本发明的限制。
一、桑黄体外抗肿瘤活性评价
(一)实验材料
1、细胞株
肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃肠间质瘤等45种细胞株；安徽医科大学药学院和中国科学院合肥物质研究院提供。
2、药物与试剂
DMEM培养粉：购自美国Gibco公司；
胎牛血清：购自杭州四季青生物材料研究所。置于-20℃冰箱保存，4℃冰箱过夜融化，在56℃水浴30min灭活后使用；
氟尿嘧啶：购自齐鲁制药有限公司；
青霉素：购自哈药集团制药总厂；
链霉素：购自深圳华南南方制药有限公司；
二甲基亚砜(DMSO):购自Sigma公司；
噻唑蓝(MTT):购自Sigma公司；
50mm2细胞培养瓶,96孔板：购自康宁公司
3、主要溶液配制
DMEM细胞培养液：DMEM粉末一包，丙酮酸钠0.11g，谷氨酰胺0.58g，碳酸氢钠2.0g，加入三蒸水定容至1000ml，0.22μm过滤除菌，分装后置于-20℃保存备用。临用前37℃水浴融化，后加入105IU/L青霉素，100mg/L链霉素，10％小牛血清(10％胎牛血清用于培养乳腺癌细胞)。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HPO412H2O，0.2gKH2PO4；溶解于适量三蒸水，调节PH值至7.2，定容至1L，过滤分装，高压灭菌后，-20℃保存备用。
MTT溶液：MTT粉剂溶于PH为7.4的PBS溶液中，浓度5mg/ml，避光、超声助溶，过滤除菌，现配现用，4℃保存。
4、仪器与设备
4℃，-20℃低温冰箱：日本三洋公司；
MDF-U40865型-80℃超低温冰箱：日本三洋公司；
SB25-12DTD型超声波清洗机：宁波新芝公司；
DHG-9243BS-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗；
DK-8D三孔电热恒温水槽：合肥科隆公司；
3-16K型冷冻离心机：Sigma公司；
TGL高速冷冻离心机：长沙湘智离心仪器有限公司；
2306-Z型CO2培养箱：美国Shellab公司；
立式压力蒸汽灭菌器：
SW-CJ-IF型净化工作台：苏州净化公司产品；
Rios83olPE超纯水机：美国密理博公司产品；
MULISKAN MK3酶标仪：Thermo forma仪器有限公司；
移液器：法国PIPETMA公司；
XD-202倒置显微镜：合肥科隆；
(二)实验方法
2.1细胞培养
本实验所用的肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃肠间质瘤等45种细胞均为贴壁生长的细胞株，用含10％的胎牛血清DMEM培养液，并加入青霉素10IU/mL和链霉素100μg/mL的培养体系培养。培养环境为37℃，5％的CO2培养箱，每2天更换培养液一次，细胞长满培养瓶时消化传代，(细胞种类不同，传代比例不同)，取处于对数生长期的细胞进行实验。
2.2MTT法检测细胞增殖情况
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在492nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值A，来判断活细胞数量，A值越大，细胞活性越强。
细胞以5×105个/ml的浓度接种于96孔培养板中，每孔接种量为100μL。待细胞贴壁后，分为空白对照组，溶剂对照组(1％DMSO)，阳性对照5-Fu组，每组设5个复孔组，每孔总体积为200μL，分别于48h、72h后，弃去孔内液体，用PBS清洗2便，之后加入180μL无血清培养液，并加入MTT(浓度为5mg/mL)20μL，继续在培养箱培养4h后，弃上清，每孔加入150μL的DMSO，震荡摇匀，使甲瓒颗粒充分溶解。于酶联免疫检测仪上，以波长492nm，试剂对照组调零，测吸光度(A492)值，重复3次，取其平均值。按照下列公式计算细胞生长抑制率：
细胞生长抑制率＝〔(对照组平均A492值-空白组平均A492值)-实验组平均A492值-空白组平均A492值)/对照组平均A492值-空白组平均A492值〕×100％。
(三)实验结果
经过对肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃肠间质瘤等45种细胞进行的高通量筛选结果显示:
1、桑黄对仓鼠正常细胞CHL、CHO均无明显抑制作用，显示：桑黄对正常细胞无毒副作用；
2、桑黄对肺癌细胞系H460、H526，结肠癌细胞系COLO205，宫颈癌细胞系Hela，前列腺癌细胞系DU145，人骨肉瘤细胞U20S，肝癌细胞系HepG2，淋巴癌细胞系TMD8、NAMLWA、Z-138，乳腺癌细胞系MCF-7，膀胱癌EJ，急性髓性白血病细胞系NOMO-1、SKM-1、NB4、HEL、Raji，胃肠间质瘤细胞GIST-T1，抑制效果较为明显，在药物测试浓度为150μg/ml时，抑制率均大于80％(见表1)，并显示出较好的选择性。
3、桑黄对其余肿瘤细胞株均无明显抑制作。
表1桑黄对43个肿瘤细胞的抑制作用
二、桑黄体内抗肿瘤活性研究
(一)桑黄对裸鼠肺癌移植瘤的治疗作用
1、实验材料
1.1实验动物和细胞株
BALB/C(nu/nu)裸鼠,雄性，体重16-19g，4-5周龄，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于安徽省动物实验中心SPF级动物房，先适应性饲养7天；实验室温度控制在20-25℃，湿度在50％-60％，自由饮水与进食。
肺癌H526细胞株购买于中科院上海细胞库，用含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、体积分数为5％的CO2、完全饱和湿度条件下的培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2实验药品
5-氟尿嘧啶由天津金耀氨基酸有限公司提供；
DMEM培养粉，二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，中性红均为美国sigma公司产品；
细胞裂解液：乙酸与无水乙醇按体积比为1：1配置；
白介素1(IL-1)、细胞坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒购买于RD公司；
NO试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。
其余试剂均为国产AR级别。
1.3传代瘤组织的制备
肺癌H526细胞，显微镜下观察细胞细胞排布紧密,贴壁生长,细胞为多边形，核分裂相多见,有细胞重叠,细胞圆亮、饱满，细胞间连接紧密。细胞长到90％以上，消化后收集细胞，胎盘兰染色存活率>95％，用PBS调节细胞浓度为1×107/ml；0.2ml/只注射于裸鼠右前肢背部皮下，待细胞成瘤后，脱臼处死裸鼠，肺癌瘤体体内传代3次。3代以后，瘤组织作为瘤源进行皮下移植。
1.4分组与给药
待肿瘤直径为0.4-0.5cm时，90只成瘤裸鼠随机分为6组，每组15只，分为模型组(不做任何处理，让其自由进食)，阳性药组(氟尿嘧啶,5-Fu,20mg/kg/d)，给药组低剂量组(50mg/kg/d)，给药组中剂量组(100mg/kg/d)，给药组高剂量组(200mg/kg/d)；连续给药10天。停药24h后，颈椎脱臼处死裸鼠，在超净台上取组织，检测指标。给药期间每2天记录肿瘤的长、短径以及体重。
1.5移植瘤体称重与体积测量
灌胃给药10天，末次给药结束后第二天眼球取血，脱臼处死裸鼠，75％乙醇浸泡后，剪开右前肢背部皮肤，剥离瘤体，去除瘤体表面的非肿瘤组织，称瘤重；给药期间每2天用游标卡尺测量瘤体的长径(a)、短径(b)。
1.6相对肿瘤抑制增值率的计算
裸鼠接种肿瘤细胞后密切观察移植瘤生长情况以及裸鼠的一般状况，每隔1天测量裸鼠体重以及移植瘤的长径(a)、短径(b)，按照下面的公式计算肿瘤体积(V)、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增值率(T/C)：
V＝a×b2/2；RTV＝V/V0(V0为给药前肿瘤体积，V为处死前肿瘤体积)；
T/C＝治疗组RTV/模型组RTV×100％；
1.7荷瘤小鼠脾脏指数的测定
颈椎脱臼处死裸鼠后，剥离脾脏，称重。公式为脾脏指数＝脾脏重量(mg)/裸鼠体重(g)；
1.8ConA诱导脾淋巴细胞增殖反应的测定
颈椎脱臼处死裸鼠后，剥离脾脏，置于无菌平皿中过4层200目尼龙网筛并用注射器针芯研磨，用预冷的PBS冲洗，收集PBS于离心管中，离心2000rpm，10min，之后去上层液，加入红细胞裂解液，混均匀，静止5min，再次离心，2000rpm，10min，去上层液体。台盼蓝染色细胞计数，活细胞>95％，用RPMI-1640培养液调节脾细胞浓度为1×107个/ml，接种于96孔板中每孔细胞悬液为10μl，再加入100μl的ConA(5mg/ml)，设置5个复孔，于培养箱中培养36h，培养结束后弃掉上清液，每孔加入20μl的MTT(5mg/ml)和180μl无血清培养液，继续在培养箱中培养4h，离心(2000rpm，5min)，弃上清液，加入150μl/孔的DMSO，在酶标仪上于570nm测量吸光度(A)值。
1.9荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的检测
颈椎脱臼处死小鼠后，浸于75％的乙醇溶液中1min，于超净台内操作。腹腔注射预冷的PBS溶液5ml，用手轻轻揉腹部，用5ml注射器吸出腹腔内液体，于4℃离心(12000rpm，10min)弃掉上清液，用PBS清洗两次，用含有10％的胎牛血清RPMI-1640培养液重悬细胞，细胞计数，并调节细胞浓度为1×107个/ml，接种于96孔板中，每孔为100μl，另加完全培养基RPMI-1640为空白对照组，置于细胞培养箱中培养4h，去除费贴壁细胞，即得到所需要的巨噬细胞浓度。
96孔板的巨噬细胞每孔加入0.075％的中性红生理盐水溶液100μl，继续培养30min，弃掉上清液，用PBS清洗3次，每孔加入细胞裂解液(乙酸：无水乙醇＝1：1)150μl，室温静置3h，待细胞溶解后，在酶标仪上于570nm处测量吸光度(A)值。
1.10酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中IL-1、TNF-α含量
裸鼠眼球取血后，室温放置1h，离心2000rpm，10min，吸上清液，血清分装于EP管中，50μl/管。-80℃保存，按照ELISA试剂盒的测量方法测量。
1.11硝酸还原酶法侧脸裸鼠血清中NO的含量
裸鼠眼球取血后，室温放置1h，离心2000rpm，10min，吸上清液，血清分装于EP管中，50μl/管。-80℃保存。用NO试剂盒检测血清中NO的含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书方法进行。
1.12NK效应细胞活性的检测
(1)效应细胞：常规无菌取裸鼠脾淋巴细胞，用10％胎牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞浓度为1×107个/ml的细胞悬液。
(2)靶细胞的制备：取传代培养24-48h的YAC-1细胞，，用10％胎牛血清的RPMI-1640培养液洗涤两次后，用0.5％BSA-RPMI-1640培养液洗涤一次，台盼蓝染色确认细胞存活率>95％，调整细胞浓度为3×105个/ml。
(3)活性测定：96孔板中，实验孔加入效应细胞、靶细胞各100μl；靶细胞对照孔加入靶细胞、培养液各100μl；效应细胞对照孔加入效应细胞、培养液各100μl，设置3个复孔。置于培养箱中培养4h后，实验孔加入10μl的MTT培养液，在继续培养4h。培养结束后，弃掉上清液，实验孔各加入150μl的DMSO，0.05mol(pH10.5)甘氨酸缓冲液20μl，置酶标仪上于570nm处测量OD值。
NK细胞活性计算公式如下：
NK细胞活性(％)＝[1－(实验组OD值－效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值]×100％；
1.13观察小鼠生存期
用于观察生存期的裸鼠继续给予水和食物饲养，待各组裸鼠衰竭时处死或者自然死亡，记录死亡时间，计算平均生存期和生命延长率，计算公式如下：
生命延长率(％)＝(用药组平均存活时间－模型组平均存活时间)/模型组平均存活时间×100％
1.14数据处理
实验数据按照均数标准差(χ±S)表示，采用SPSS17.0软件进行统计学数据处理，组比较用One-way ANOVA检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2、实验结果
2.1肺癌移植瘤模型建立成功
瘤组织悬液注射入腋窝一周后，即可见皮下绿豆大小的小突起，几周后可见瘤体积越来越大。
2.2荷瘤裸鼠的体重变化以及移植瘤的抑制率
在整个实验过程中无裸鼠死亡，各组裸鼠均能活动，饮水进食均正常，体重均有增加，各组的体重之间无统计学意义(P>0.05)。给药组的瘤重与模型组比较均明显减少(P<0.01，P<0.05)，桑黄200mg/kg组与5-Fu组比较瘤体重量均减少(P<0.01)，实验结果如表1所示。
表1桑黄对荷瘤裸鼠的移植瘤的抑制率的影响(χ±S，n＝6)
**P<0.01，*P<0.05vs.模型组；#P<0.05，##P<0.01vs 5-Fu组
2.3桑黄对裸鼠移植瘤体积变化的影响
在实验过程中，各组裸鼠的饮水和进食均正常，无裸鼠死亡。裸鼠经过体内皮下接种瘤组织悬液后10天后，皮下可见结节，15天后肿瘤直径约为0.3-0.5cm，成瘤率100％。裸鼠皮下肺癌移植瘤为结节状，边界清楚。给药前各组移植瘤的体积变化没有差异性(P>0.05)，在给药期间，桑黄各剂量组和阳性药组的肿瘤生长均相对减慢，而模型组则相反，移植瘤均生长较快，个别裸鼠的瘤体出现了破溃现象。给药结束后桑黄各剂量组和阳性药组的RTV与模型组比较均有明显的差异(P<0.05，P<0.01)。桑黄各剂量组可以明显减少移植瘤的体积，且具有剂量依赖性，相对肿瘤增值率逐渐减小，结果如表2所示：
表2桑黄对裸鼠移植瘤体积变化的影响(χ±S，n＝6)
**P<0.01，*P<0.05vs.模型组
2.4桑黄对荷瘤裸鼠脾脏指数的影响
药物和5-Fu组指数脾脏与模型组的脾脏指数比较无统计学意义，药物(100、200mg/kg)组荷瘤裸鼠的脾脏指数与模型组比较均升高，且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。实验结果如表3所示。
表3桑黄对荷瘤小裸鼠脾脏指数的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.5桑黄对荷瘤裸鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
桑黄(100、200mg/kg)组荷瘤裸鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力与模型组的吞噬能力相比较，吞噬能力明显增强且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，其余组别的吞噬能力跟模型组的吞噬能力相比较无统计学意义。实验结果表4所示。
表4.桑黄对荷瘤裸鼠巨噬细胞吞噬中性红能力的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.6桑黄对荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响
人肺癌H526细胞株的荷瘤裸鼠血清中NO的水平比正常裸鼠对照组显著升高，桑黄可以显著降低荷瘤裸鼠血清中的NO含量，并有一定的剂量依懒性关系。实验结果如图1所示。
2.7桑黄对人肺癌A594细胞株荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响
荷瘤裸鼠连续给药10天后，桑黄组、阳性药组的荷瘤裸鼠的NK细胞杀伤活性与模型组比较有显著提高(P<0.05，P<0.01)，实验结果如图2所示。
2.8桑黄对ConA诱导的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响
与正常组比较，ConA诱导的模型组脾淋巴细胞增殖反应明显低于正常组(P<0.01)，连续给药10天后，桑黄组和5-Fu组跟模型组比较有统计学意义，(P<0.01，P<0.05)桑黄高剂量组可以使ConA诱导的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞增殖反应增强，恢复至正常水平。实验结果如图3所示。
1.9桑黄对荷瘤裸鼠血清中IL-1、TNF-α含量的影响
荷瘤裸鼠连续给药10天后，桑黄中、高剂量组可以使裸鼠血清中IL-1和TNF-α的分泌水平提高，与模型组比较且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，实验结果如表所示，根据表5、表6中数据可知桑黄可以提高裸鼠免疫因子的表达，对裸鼠机体的免疫力有提高作用。
表5.桑黄对荷瘤裸鼠血清中分泌IL-1的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
表6.桑黄对荷瘤裸鼠血清中分泌TNF-α的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
1.10桑黄对荷瘤裸鼠生存期的影响
于SPF级动物房饲养裸鼠至其自然死亡，记录死亡时间。阳性药组和桑黄高剂量组可以延长荷瘤裸鼠的生存期，并且与模型组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。记录结果如表7所示。
表7.桑黄A对荷瘤裸鼠生存期的影响(χ±S，n＝7)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
(二)桑黄对裸鼠白血病移植瘤的治疗作用
1、实验材料
1.1实验动物和细胞株
NOD/SCID小鼠，雌性，6-7周龄，体重18～22g，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于安徽省动物实验中心SPF级动物房，先适应性饲养7天；实验室温度控制在20-25℃，湿度在50％-60％，自由饮水与进食。
急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞株购买于中科院上海细胞库，用含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、体积分数为5％的CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2实验药品
5-氟尿嘧啶由天津金耀氨基酸有限公司提供；
DMEM培养粉，二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，中性红均为美国sigma公司产品；
细胞裂解液：乙酸与无水乙醇按体积比为1：1配置；
白介素1(IL-1)、细胞坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒购买于RD公司；
NO试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。
其余试剂均为国产AR级别。
1.3传代瘤组织的制备
急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞，显微镜下观察圆形，体积较大，核/浆比例大，浆少呈淡蓝色；核圆形，核仁清楚，染色质不均匀，呈不规则的粗粒或结块状，细胞长到90％以上，消化后收集细胞，胎盘兰染色存活率>95％，收集对数生长期细胞,以腹腔一次性注射3×106个/只,待细胞成瘤后，脱臼处死裸鼠，瘤体体内传代3次。3代以后，瘤组织作为瘤源进行皮下移植。
1.4分组与给药
待肿瘤直径为0.3-0.5cm时，90只成瘤裸鼠随机分为6组，每组15只，分为模型组(不做任何处理，让其自由进食)，阳性药组(氟尿嘧啶,5-Fu,20mg/kg/d)，给药组低剂量组(50mg/kg/d)，给药组中剂量组(100mg/kg/d)，给药组高剂量组(200mg/kg/d)；连续给药10天。停药24h后，颈椎脱臼处死裸鼠，在超净台上取组织，检测指标。给药期间每2天记录肿瘤的长、短径以及体重。
1.5移植瘤体称重与体积测量
灌胃给药10天，末次给药结束后第二天眼球取血，脱臼处死裸鼠，75％乙醇浸泡后，剪开左下肢处皮肤，剥离瘤体，去除瘤体表面的非肿瘤组织，称瘤重；给药期间每2天用游标卡尺测量瘤体的长径(a)、短径(b)。
1.6相对肿瘤抑制增值率的计算
裸鼠接种肿瘤细胞后密切观察移植瘤生长情况以及裸鼠的一般状况，每隔1天测量裸鼠体重以及移植瘤的长径(a)、短径(b)，按照下面的公式计算肿瘤体积(V)、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增值率(T/C)：
V＝a×b2/2；RTV＝V/V0(V0为给药前肿瘤体积，V为处死前肿瘤体积)；
T/C＝治疗组RTV/模型组RTV×100％；
1.7荷瘤小鼠脾脏指数的测定
颈椎脱臼处死裸鼠后，剥离脾脏，称重。公式为脾脏指数＝脾脏重量(mg)/裸鼠体重(g)；
1.8ConA诱导脾淋巴细胞增值反应的测定
颈椎脱臼处死裸鼠后，剥离脾脏，置于无菌平皿中过4层200目尼龙网筛并用注射器针芯研磨，用预冷的PBS冲洗，收集PBS于离心管中，离心2000rpm，10min，之后去上层液，加入红细胞裂解液，混均匀，静止5min，再次离心，2000rpm，10min，去上层液体。台盼蓝染色细胞计数，活细胞>95％，用RPMI-1640培养液调节脾细胞浓度为1×107个/ml，接种于96孔板中每孔细胞悬液为10μl，再加入100μl的ConA(5mg/ml)，设置5个复孔，于培养箱中培养36h，培养结束后弃掉上清液，每孔加入20μl的MTT(5mg/ml)和180μl无血清培养液，继续在培养箱中培养4h，离心(2000rpm，5min)，弃上清液，加入150μl/孔的DMSO，在酶标仪上于570nm测量吸光度(A)值。
1.9荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的检测
颈椎脱臼处死小鼠后，浸于75％的乙醇溶液中1min，于超净台内操作。腹腔注射预冷的PBS溶液5ml，用手轻轻揉腹部，用5ml注射器吸出腹腔内液体，于4℃离心(12000rpm，10min)弃掉上清液，用PBS清洗两次，用含有10％的胎牛血清RPMI-1640培养液重悬细胞，细胞计数，并调节细胞浓度为1×107个/ml，接种于96孔板中，每孔为100μl，另加完全培养基RPMI-1640为空白对照组，置于细胞培养箱中培养4h，去除费贴壁细胞，即得到所需要的巨噬细胞浓度。
96孔板的巨噬细胞每孔加入0.075％的中性红生理盐水溶液100μl，继续培养30min，弃掉上清液，用PBS清洗3次，每孔加入细胞裂解液(乙酸：无水乙醇＝1：1)150μl，室温静置3h，待细胞溶解后，在酶标仪上于570nm处测量吸光度(A)值。
1.10酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中IL-1、TNF-α含量
裸鼠眼球取血后，室温放置1h，离心2000rpm，10min，吸上清液，血清分装于EP管中，50μl/管。-80℃保存，按照ELISA试剂盒的测量方法测量。
1.11硝酸还原酶法侧脸裸鼠血清中NO的含量
裸鼠眼球取血后，室温放置1h，离心2000rpm，10min，吸上清液，血清分装于EP管中，50μl/管。-80℃保存。用NO试剂盒检测血清中NO的含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书方法进行。
1.12NK效应细胞活性的检测
(1)效应细胞：常规无菌取裸鼠脾淋巴细胞，用10％胎牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞浓度为1×107个/ml的细胞悬液。
(2)靶细胞的制备：取传代培养24-48h的YAC-1细胞，，用10％胎牛血清的RPMI-1640培养液洗涤两次后，用0.5％BSA-RPMI-1640培养液洗涤一次，台盼蓝染色确认细胞存活率>95％，调整细胞浓度为3×105个/ml。
(3)活性测定：96孔板中，实验孔加入效应细胞、靶细胞各100μl；靶细胞对照孔加入靶细胞、培养液各100μl；效应细胞对照孔加入效应细胞、培养液各100μl，设置3个复孔。置于培养箱中培养4h后，实验孔加入10μl的MTT培养液，在继续培养4h。培养结束后，弃掉上清液，实验孔各加入150μl的DMSO，0.05mol(pH10.5)甘氨酸缓冲液20μl，置酶标仪上于570nm处测量OD值。
NK细胞活性计算公式如下：
NK细胞活性(％)＝[1－(实验组OD值－效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值]×100％；
1.13观察小鼠生存期
用于观察生存期的裸鼠继续给予水和食物饲养，待各组裸鼠衰竭时处死或者自然死亡，记录死亡时间，计算平均生存期和生命延长率，计算公式如下：
生命延长率(％)＝(用药组平均存活时间－模型组平均存活时间)/模型组平均存活时间×100％
1.14数据处理
实验数据按照均数标准差(χ±S)表示，采用SPSS17.0软件进行统计学数据处理，组比较用One-way ANOVA检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2、实验结果
2.1白血病移植瘤模型建立成功
瘤组织悬液注射入腹腔一周后，即可见皮下绿豆大小的小突起，几周后可见瘤体积越来越大。
2.2荷瘤裸鼠的体重变化以及移植瘤的抑制率
在整个实验过程中无裸鼠死亡，各组裸鼠均能活动，饮水进食均正常，体重均有增加，各组的体重之间无统计学意义(P>0.05)。给药组的瘤重与模型组比较均明显减少(P<0.01)，桑黄200mg/kg组与5-Fu组比较瘤体重量减少(P<0.05,P<0.01)，结果如表1所示。
表1桑黄对荷瘤裸鼠抑制率的影响(χ±S，n＝6)
**P<0.01，*P<0.05vs.模型组；#P<0.05，##P<0.01vs 5-Fu组
2.3桑黄对裸鼠移植瘤体积变化的影响
在实验过程中，各组裸鼠的饮水和进食均正常，无裸鼠死亡。裸鼠经过体内皮下接种瘤组织悬液后10天，皮下可见结节，15天后肿瘤直径约为0.4-0.6cm，成瘤率100％。裸鼠皮下肝癌移植瘤为结节状，边界清楚。给药前各组移植瘤的体积变化没有差异性(P>0.05)，在给药期间，桑黄各剂量组和阳性药组的肿瘤生长均相对减慢，而模型组则相反，移植瘤均生长较快，个别裸鼠的瘤体出现了破溃现象。给药结束后桑黄各剂量组和阳性药组的RTV与模型组比较均有明显的差异(P<0.05，P<0.01)。桑黄各剂量组可以明显减少移植瘤的体积，且具有剂量依赖性，相对肿瘤增值率逐渐减小，结果如表2所示：
表2桑黄对裸鼠移植瘤体积变化的影响(χ±S，n＝6)
**P<0.01，*P<0.05vs.模型组
2.4桑黄对荷瘤裸鼠脾脏指数的影响
桑黄(50mg/kg)组和5-Fu组指数脾脏与模型组的脾脏指数比较无统计学意义，桑黄(100、200mg/kg)组荷瘤裸鼠的脾脏指数与模型组比较均升高，且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。实验结果如表3所示。
表3桑黄对荷瘤小裸鼠脾脏指数的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.5桑黄对荷瘤裸鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
桑黄(100、200mg/kg)组荷瘤裸鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力与模型组的吞噬能力相比较，吞噬能力明显增强且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，其余组别的吞噬能力跟模型组的吞噬能力相比较无统计学意义。实验结果表4所示。
表4桑黄对荷瘤裸鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.6桑黄对荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响
急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株的荷瘤裸鼠血清中NO的水平比正常裸鼠对照组显著升高，桑黄可以显著降低荷瘤裸鼠血清中的NO含量，并有一定的剂量依懒性关系。实验结果如图4所示。
2.7桑黄对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响
荷瘤裸鼠连续给药10天后，药物组荷瘤裸鼠的NK细胞杀伤活性与模型组比较有显著提高(P<0.05，P<0.01)，实验结果如图5所示。
2.8桑黄对ConA诱导的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响
与正常组比较，ConA诱导的模型组脾淋巴细胞增殖反应明显低于正常组(P<0.01)，连续给药10天后，药物组和5-Fu组跟模型组比较有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，药物高剂量组可以使ConA诱导的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞增殖反应增强，恢复至正常水平。实验结果如图6所示。
2.9桑黄对荷瘤裸鼠血清中IL-1、TNF-α含量的影响
荷瘤裸鼠连续给药10天后，桑黄中、高剂量组可以使裸鼠血清中IL-1和TNF-α的分泌水平提高，与模型组比较且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，实验结果如表所示，根据表5、表6中数据可知桑黄可以提高裸鼠免疫因子的表达，对裸鼠机体的免疫力有提高作用。
表5桑黄对荷瘤裸鼠血清中分泌IL-1的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
表6桑黄对荷瘤裸鼠血清中分泌TNF-α的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.10桑黄对荷瘤裸鼠生存期的影响
于SPF级动物房饲养裸鼠至其自然死亡，记录死亡时间。阳性药组和药物高剂量组可以延长荷瘤裸鼠的生存期，并且与模型组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。记录结果如表7所示。
表7桑黄对荷瘤裸鼠生存期的影响(χ±S，n＝7)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
(三)桑黄对裸鼠淋巴癌移植瘤的治疗作用
1、实验材料
1.1实验动物和细胞株
BALB/C(nu/nu)裸鼠,雄性，体重15-20g，5-6周龄，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于安徽省动物实验中心SPF级动物房，先适应性饲养7天；实验室温度控制在20-25℃，湿度在50％-60％，自由饮水与进食。
小鼠淋巴瘤TMD8细胞株购买于中科院上海细胞库，用含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、体积分数为5％的CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2实验药品
5-氟尿嘧啶由天津金耀氨基酸有限公司提供；
DMEM培养粉，二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，中性红均为美国sigma公司产品；
细胞裂解液：乙酸与无水乙醇按体积比为1：1配置；
白介素1(IL-1)、细胞坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒购买于RD公司；
NO试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。
其余试剂均为国产AR级别。
1.3传代瘤组织的制备
小鼠淋巴瘤EL4细胞，显微镜下观察细胞圆型，有些可见细胞核，细胞长到90％以上，消化后收集细胞，胎盘兰染色存活率>95％，用PBS调节细胞浓度为1×107/ml；0.2ml/只注射于裸鼠右侧腋下空白处，待细胞成瘤后，脱臼处死裸鼠，瘤体体内传代3次。3代以后，瘤组织作为瘤源进行皮下移植。
1.4分组与给药
待肿瘤直径为0.4-0.5cm时，90只成瘤裸鼠随机分为6组，每组15只，分为模型组(不做任何处理，让其自由进食)，阳性药组(氟尿嘧啶,5-Fu,20mg/kg/d)，给药组低剂量组(50mg/kg/d)，给药组中剂量组(100mg/kg/d)，给药组高剂量组(200mg/kg/d)；连续给药10天。停药24h后，颈椎脱臼处死裸鼠，在超净台上取组织，检测指标。给药期间每2天记录肿瘤的长、短径以及体重。
1.5移植瘤体称重与体积测量
灌胃给药10天，末次给药结束后第二天眼球取血，脱臼处死裸鼠，75％乙醇浸泡后，剪开腋窝处皮肤，剥离瘤体，去除瘤体表面的非肿瘤组织，称瘤重；给药期间每2天用游标卡尺测量瘤体的长径(a)、短径(b)。
1.6相对肿瘤抑制增值率的计算
裸鼠接种肿瘤细胞后密切观察移植瘤生长情况以及裸鼠的一般状况，每隔1天测量裸鼠体重以及移植瘤的长径(a)、短径(b)，按照下面的公式计算肿瘤体积(V)、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增值率(T/C)：
V＝a×b2/2；RTV＝V/V0(V0为给药前肿瘤体积，V为处死前肿瘤体积)；
T/C＝治疗组RTV/模型组RTV×100％；
1.7荷瘤小鼠脾脏指数的测定
颈椎脱臼处死裸鼠后，剥离脾脏，称重。公式为脾脏指数＝脾脏重量(mg)/裸鼠体重(g)；
1.8ConA诱导脾淋巴细胞增值反应的测定
颈椎脱臼处死裸鼠后，剥离脾脏，置于无菌平皿中过4层200目尼龙网筛并用注射器针芯研磨，用预冷的PBS冲洗，收集PBS于离心管中，离心2000rpm，10min，之后去上层液，加入红细胞裂解液，混均匀，静止5min，再次离心，2000rpm，10min，去上层液体。台盼蓝染色细胞计数，活细胞>95％，用RPMI-1640培养液调节脾细胞浓度为1×107个/ml，接种于96孔板中每孔细胞悬液为10μl，再加入100μl的ConA(5mg/ml)，设置5个复孔，于培养箱中培养36h，培养结束后弃掉上清液，每孔加入20μl的MTT(5mg/ml)和180μl无血清培养液，继续在培养箱中培养4h，离心(2000rpm，5min)，弃上清液，加入150μl/孔的DMSO，在酶标仪上于570nm测量吸光度(A)值。
1.9荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的检测
颈椎脱臼处死小鼠后，浸于75％的乙醇溶液中1min，于超净台内操作。腹腔注射预冷的PBS溶液5ml，用手轻轻揉腹部，用5ml注射器吸出腹腔内液体，于4℃离心(12000rpm，10min)弃掉上清液，用PBS清洗两次，用含有10％的胎牛血清RPMI-1640培养液重悬细胞，细胞计数，并调节细胞浓度为1×107个/ml，接种于96孔板中，每孔为100μl，另加完全培养基RPMI-1640为空白对照组，置于细胞培养箱中培养4h，去除费贴壁细胞，即得到所需要的巨噬细胞浓度。
96孔板的巨噬细胞每孔加入0.075％的中性红生理盐水溶液100μl，继续培养30min，弃掉上清液，用PBS清洗3次，每孔加入细胞裂解液(乙酸：无水乙醇＝1：1)150μl，室温静置3h，待细胞溶解后，在酶标仪上于570nm处测量吸光度(A)值。
1.10酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中IL-1、TNF-α含量
裸鼠眼球取血后，室温放置1h，离心2000rpm，10min，吸上清液，血清分装于EP管中，50μl/管。-80℃保存，按照ELISA试剂盒的测量方法测量。
1.11硝酸还原酶法侧脸裸鼠血清中NO的含量
裸鼠眼球取血后，室温放置1h，离心2000rpm，10min，吸上清液，血清分装于EP管中，50μl/管。-80℃保存。用NO试剂盒检测血清中NO的含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书方法进行。
1.12NK效应细胞活性的检测
(1)效应细胞：常规无菌取裸鼠脾淋巴细胞，用10％胎牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞浓度为1×107个/ml的细胞悬液。
(2)靶细胞的制备：取传代培养24-48h的YAC-1细胞，，用10％胎牛血清的RPMI-1640培养液洗涤两次后，用0.5％BSA-RPMI-1640培养液洗涤一次，台盼蓝染色确认细胞存活率>95％，调整细胞浓度为3×105个/ml。
(3)活性测定：96孔板中，实验孔加入效应细胞、靶细胞各100μl；靶细胞对照孔加入靶细胞、培养液各100μl；效应细胞对照孔加入效应细胞、培养液各100μl，设置3个复孔。置于培养箱中培养4h后，实验孔加入10μl的MTT培养液，在继续培养4h。培养结束后，弃掉上清液，实验孔各加入150μl的DMSO，0.05mol(pH10.5)甘氨酸缓冲液20μl，置酶标仪上于570nm处测量OD值。
NK细胞活性计算公式如下：
NK细胞活性(％)＝[1－(实验组OD值－效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值]×100％；
1.13观察小鼠生存期
用于观察生存期的裸鼠继续给予水和食物饲养，待各组裸鼠衰竭时处死或者自然死亡，记录死亡时间，计算平均生存期和生命延长率，计算公式如下：
生命延长率(％)＝(用药组平均存活时间－模型组平均存活时间)/模型组平均存活时间×100％
1.14数据处理
实验数据按照均数标准差(χ±S)表示，采用SPSS17.0软件进行统计学数据处理，组比较用One-way ANOVA检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2、实验结果
2.1淋巴癌移植瘤模型建立成功
瘤组织悬液注射入腋窝一周后，即可见皮下绿豆大小的小突起，几周后可见瘤体积越来越大。
2.2荷瘤裸鼠的体重变化以及移植瘤的抑制率
在整个实验过程中无裸鼠死亡，各组裸鼠均能活动，饮水进食均正常，体重均有增加，各组的体重之间无统计学意义(P>0.05)。给药组的瘤重与模型组比较均明显减少(P<0.01)，桑黄100mg/kg、200mg/kg组与5-Fu组比较瘤体重量均减少(P<0.05,P<0.01)，结果如表1所示。
表1桑黄对荷瘤裸鼠抑制率的影响(χ±S，n＝6)
**P<0.01，*P<0.05vs.模型组；#P<0.05，##P<0.01vs 5-Fu组
2.3桑黄对裸鼠移植瘤体积变化的影响
在实验过程中，各组裸鼠的饮水和进食均正常，无裸鼠死亡。裸鼠经过体内皮下接种瘤组织悬液后一周，皮下可见结节，15天后肿瘤直径约为0.3-0.5cm，成瘤率100％。裸鼠皮下肝癌移植瘤为结节状，边界清楚。给药前各组移植瘤的体积变化没有差异性(P>0.05)，在给药期间，桑黄各剂量组和阳性药组的肿瘤生长均相对减慢，而模型组则相反，移植瘤均生长较快，个别裸鼠的瘤体出现了破溃现象。给药结束后桑黄各剂量组和阳性药组的RTV与模型组比较均有明显的差异(P<0.05，P<0.01)。桑黄各剂量组可以明显减少移植瘤的体积，且具有剂量依赖性，相对肿瘤增值率逐渐减小，结果如表2所示：
表2桑黄对裸鼠移植瘤体积变化的影响(χ±S，n＝6)
**P<0.01，*P<0.05vs.模型组
2.4桑黄对荷瘤裸鼠脾脏指数的影响
桑黄(50mg/kg)组和5-Fu组指数脾脏与模型组的脾脏指数比较无统计学意义，桑黄(100、200mg/kg)组荷瘤裸鼠的脾脏指数与模型组比较均升高，且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。实验结果如表3所示。
表3桑黄对荷瘤小裸鼠脾脏指数的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.5桑黄对荷瘤裸鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
桑黄(100、200mg/kg)组荷瘤裸鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力与模型组的吞噬能力相比较，吞噬能力明显增强且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，其余组别的吞噬能力跟模型组的吞噬能力相比较无统计学意义。实验结果表4所示。
表4桑黄对荷瘤裸鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.6桑黄对荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响
小鼠淋巴瘤EL4细胞株的荷瘤裸鼠血清中NO的水平比正常裸鼠对照组显著升高，桑黄可以显著降低荷瘤裸鼠血清中的NO含量，并有一定的剂量依懒性关系。实验结果如图7所示。
2.7桑黄对小鼠淋巴瘤EL4细胞株荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响
荷瘤裸鼠连续给药10天后，药物组荷瘤裸鼠的NK细胞杀伤活性与模型组比较有显著提高(P<0.05，P<0.01)，实验结果如图8所示。
2.8桑黄对ConA诱导的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响
与正常组比较，ConA诱导的模型组脾淋巴细胞增殖反应明显低于正常组(P<0.01)，连续给药10天后，药物组和5-Fu组跟模型组比较有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，药物高剂量组可以使ConA诱导的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞增殖反应增强，恢复至正常水平。实验结果如图9所示。
2.9桑黄对荷瘤裸鼠血清中IL-1、TNF-α含量的影响
荷瘤裸鼠连续给药10天后，桑黄中、高剂量组可以使裸鼠血清中IL-1和TNF-α的分泌水平提高，与模型组比较且有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，实验结果如表所示，根据表5、表6中数据可知桑黄可以提高裸鼠免疫因子的表达，对裸鼠机体的免疫力有提高作用。
表5桑黄对荷瘤裸鼠血清中分泌IL-1的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
表6桑黄对荷瘤裸鼠血清中分泌TNF-α的影响(χ±S，n＝6)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
2.10桑黄对荷瘤裸鼠生存期的影响
于SPF级动物房饲养裸鼠至其自然死亡，记录死亡时间。阳性药组和药物高剂量组可以延长荷瘤裸鼠的生存期，并且与模型组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。记录结果如表7所示。
表7桑黄对荷瘤裸鼠生存期的影响(χ±S，n＝7)
*P<0.05，**P<0.01vs.模型组
附图说明
图1为桑黄对肺癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响分析图；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组；#P<0.05，##P<0.01vs.正常组。
图2为桑黄对肺癌荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响分析图；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组。
图3为桑黄对肺癌荷瘤裸鼠ConA诱导脾淋巴细胞增殖反应的影响；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组；##P<0.01vs.正常组。
图4为桑黄对白血病荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响分析图；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组；#P<0.05，##P<0.01vs.正常组。
图5为桑黄对白血病荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响分析图；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组。
图6为桑黄对白血病荷瘤裸鼠ConA诱导脾淋巴细胞增殖反应的影响；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组；##P<0.01vs.正常组。
图7为桑黄对淋巴癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响分析图；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组；#P<0.05，##P<0.01vs.正常组。
图8为桑黄对淋巴癌荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响分析图；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组。
图9为桑黄对淋巴癌荷瘤裸鼠ConA诱导脾淋巴细胞增殖反应的影响；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组；##P<0.01vs.正常组。
具体实施方式
实施例1：桑黄颗粒剂制备
称取桑黄2000g，按下列方法制备：
(a)第一次加水15倍量，煎煮2小时，第二次加水12倍量，煎煮2小时，合并药液，药液滤过，取滤液，浓缩至相对密度1.10-1.15(60℃)时，加入95％乙醇使含醇量达到80％，沉淀，静置24小时，过滤，得沉淀物，滤液经回收乙醇，得水提液；
(b)水提液浓缩，干燥，粉碎，得干膏粉；
(c)沉淀物干燥，粉碎，得沉淀粉；
(d)将所得干膏粉和沉淀粉与适量糊精充分混匀，以乙醇液作黏合剂制粒，干燥，制成颗粒剂。
实施例2：桑黄颗粒剂制备
称取桑黄3000g，按下列方法制备：
(a)加95％乙醇15倍量回流提取两次，第一次3小时，第二次2小时。合并药液，药液滤过，回收乙醇，得醇提液；
(b)醇提后的药渣共同加水煎煮两次，第一次加水15倍量，煎煮2小时，第二次加水12倍量，煎煮2小时，合并药液，药液滤过，取滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.15(60℃)时，加入95％乙醇使含醇量达到80％，沉淀，静置24小时，吸取上清液，回收乙醇，得水提液；
(c)所得醇提液和水提液合并，浓缩，干燥，粉碎，得干膏粉；
(d)将所得干膏粉与适量淀粉充分混匀，以乙醇液作黏合剂制粒，干燥，制成颗粒剂。
实施例3：桑黄片剂制备
称取桑黄25000g，按下列方法制备：
(a)第一次加水15倍量，煎煮2小时，第二次加水12倍量，煎煮2小时，合并药液，药液滤过，取滤液，浓缩至相对密度1.10-1.15(60℃)时，加入95％乙醇使含醇量达到70％，沉淀，静置24小时，吸取上清液，回收乙醇，得水提液；
(b)浓缩，干燥，粉碎，得干膏粉；
(c)沉淀物干燥，粉碎，得沉淀粉；
(d)将所得干膏粉和沉淀粉与适量蔗糖充分混匀，以乙醇液作黏合剂制粒，干燥，加入适量硬脂酸镁混匀，制成片剂。
实施例4：桑黄胶囊剂制备
称取桑黄15000g，按下列方法制备：
将上述原料药按下列方法制备：
(a)加80％乙醇15倍量回流提取两次，第一次3小时，第二次2小时。合并药液，药液滤过，回收乙醇，得醇提液；
(b)醇提后的药渣共同加水煎煮两次，第一次加水15倍量，煎煮2小时，第二次加水12倍量，煎煮2小时，合并药液，药液滤过，取滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.15(60℃)时，加入95％乙醇使含醇量达到80％，沉淀，静置24小时，吸取上清液，回收乙醇，得水提液；
(c)所得醇提液和水提液合并，浓缩，干燥，粉碎，得干膏粉；
(d)将所得干膏粉与适量微分硅胶充分混匀，以乙醇液作黏合剂制粒，干燥，加入适量硬脂酸镁混匀，装入明胶硬胶囊。
实施例5：桑黄软胶囊剂制备
(a)取包括大豆油、蜂蜡、山梨酸酐单油酸酯和甘氨酸的辅料加热溶解，与上述实施例1或实施例2或实施例3或实施例4所得干膏粉混合，搅拌均匀，用胶体磨研磨，得软胶囊内容物。
(b)将软胶囊内容物与由明胶、甘油、水、崩解剂和着色剂制成的囊皮一起，采用压制法，进行压制、定型、洗丸、干燥、拣完、抛光、制得软胶囊。
实施例6：桑黄散剂制备
称取桑黄6000g，按下列方法制备：
将桑黄粉碎，过80目筛，分装成每袋2g。
Claims (1)
1.桑黄在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述药物中以桑黄为唯一活性成分，所述肿瘤是肺癌细胞系H526。
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| 桑黄及其药用研究进展;薛忠民等;《中国蚕业》;20070331;第28卷(第1期);第71页左栏第1段，右栏第3段，第72页右栏第1段 * |
| 桑黄抗肿瘤作用的实验研究;刘妍等;《中草药》;20061231;第37卷;第38页左栏第1段以及第39页讨论 * |
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