CN105535685A

CN105535685A - 抗结肠癌的复方中药及其制备方法

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Publication number: CN105535685A
Application number: CN201610043729.6A
Authority: CN
Inventors: 杜正彩; 罗花; 邓家刚; 廖泽勇
Original assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu Cancer Research Institute Of Traditional Chinese Medicine General Partnership; Outpatient Department Of Chengdu Haida Tcm Cancer Hospital Co ltd
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: CN105535685B

Abstract

本发明公开了一种抗结肠癌的复方中药，由以下重量份的原料药材制成：白头翁6-24份、半枝莲10-30份、生半夏3-12份、薏苡仁15-30份、鸡内金13-60份、茯苓9-40份、白花蛇舌草10-40份。临床证实，本发明具有明显减轻患者便秘结塞等症状，明显延长患者寿命的功效。药效学试验结果也证实本发明在体内外均明显抑制结肠癌细胞COLO205的生长，且能够上调凋亡蛋白Bax和Puma，下调Bcl-2的表达。因此，本发明配方简单、制作简便，毒副作用小，给药方便，成本低廉，可应用于抗结肠癌药物的制备。

Description

抗结肠癌的复方中药及其制备方法

技术领域

本发明属于结肠癌治疗技术领域，尤其涉及一种抗结肠癌的复方中药及其制备方法。

背景技术

结肠癌是指结肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率排在我国癌症的前5位，在世界肿瘤的发生率中也呈明显逐年上升趋势。由于结肠癌与其他癌症一样在起病上具有隐匿渐进性，在病因上具有不确定性，在病机上具有虚、痰、癖、毒的共性，在病性上具有正虚邪实、寒热夹杂的特性，在症状上具有复杂多变性，迄今为止尚无特效治疗方法。目前，西医治疗结肠癌的方法主要有手术、放化疗等，但存在易复发或转移，产生耐药性等劣势。

癌症之所以难治，因其复杂的病状，单用某一味药治疗往往只是杯水车薪，然而，中药复方因具有多靶点多通道、不易产生耐药性并可从整体上进行全面调节等多种特点被越来越多人所接受。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种组方合理、疗效确切，临床使用安全，不良反应较低的抗结肠癌的复方中药及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：抗结肠癌的复方中药，由以下重量份的原料药材制成：白头翁6-24份、半枝莲10-30份、生半夏3-12份、薏苡仁15-30份、鸡内金13-60份、茯苓9-40份、白花蛇舌草10-40份。

上述抗结肠癌的复方中药，由以下重量份的原料药材制成：白头翁12-20份、半枝莲20-30份、生半夏6-12份、薏苡仁20-30份、鸡内金15-30份、茯苓9-20份、白花蛇舌草20-40份。

上述抗结肠癌的复方中药，由以下重量份的原料药材制成：白头翁12份、半枝莲20份、生半夏6份、薏苡仁30份、鸡内金30份、茯苓20份、白花蛇舌草20份。

上述抗结肠癌的复方中药的制备方法，按重量份称取各原料药材，加入原料药材总重8-12倍水浸泡0.5-1.5h，加热煎煮提取2-4次，每次0.5-3h，趁热过滤，滤液合并，滤液浓缩成浸膏或干膏。

在浸膏或干膏中加入适量药用辅料，按常规方法制成制剂。

本发明以广西名中医邓家刚教授多年临床经验方为基础，研制了一种抗结肠癌的复方中药(以下简称复方半枝莲)，由以下重量份的原料药材制成：白头翁6-24份、半枝莲10-30份、生半夏3-12份、薏苡仁15-30份、鸡内金13-60份、茯苓9-40份、白花蛇舌草10-40份。方中以半枝莲、白花蛇舌草为君药，二者均为性寒之品，功能清热解毒，多用于热毒痈肿如肺痈、肠痈、癌肿等病症；白头翁清热解毒、凉血止痢，半夏燥湿化痰、消痞散结，薏苡仁排脓、解毒散结，三者辅助君药解毒散结，共为臣药；茯苓、鸡内金俱为健脾和胃之品，既可扶正驱邪，又可防苦寒药物伤脾碍胃，用作佐药。诸药配伍应用，共奏清热解毒，散结抑癌之功效。临床证实，本发明具有明显减轻患者便秘结塞等症状，明显延长患者寿命的功效。药效学试验结果也证实本发明在体内外均明显抑制结肠癌细胞COLO205的生长，且能够上调凋亡蛋白Bax和Puma，下调Bc1-2的表达。因此，本发明配方简单、制作简便，毒副作用小，给药方便，成本低廉，可应用于抗结肠癌药物的制备。

附图说明

图1是复方半枝莲对COLO205细胞的影响图。

图2是复方半枝莲对COLO205细胞凋亡相关蛋白的调控图，图中从左至右依次为24h空白组，24h复方半枝莲，48h空白组，48h复方半枝莲，72h空白组，72h复方半枝莲。

图3是复方半枝莲对结肠癌移植瘤体积的影响曲线图。

图4是复方半枝莲对结肠癌移植瘤体积的影响图。

具体实施方式

实施例1复方半枝莲散剂

配方：白头翁1.2千克、半枝莲2.0千克、生半夏0.6千克、薏苡仁3.0千克、鸡内金3.0千克、茯苓2.0千克、白花蛇舌草2.0千克。

制法：按配方称取各原料药材，第一次加入原料药材总重10倍量水，浸泡30min后，加热煎煮30min(水沸时开始计时)，第二次加8倍量水，煎煮30min。合并2次煎液，浓缩至膏状，干燥粉碎，过100目筛，分装即得。

实施例2复方半枝莲片剂

配方：白头翁15千克、半枝莲25千克、生半夏9千克、薏苡仁30千克、鸡内金20千克、茯苓15千克、白花蛇舌草30千克。

制法：按配方称取各原料药材，加入原料药材总重10倍水浸泡0.5h，加热煎煮提取2次，每次60min，趁热过滤，滤液合并，滤液浓缩干燥得干膏，干膏粉碎后，加入适量常用药用辅料后混合制粒，压片，分装即得。

实施例3复方半枝莲颗粒剂

配方：白头翁20千克、半枝莲30千克、生半夏12千克、薏苡仁20千克、鸡内金15千克、茯苓9千克、白花蛇舌草40千克。

制法：按配方称取各原料药材，加入原料药材总重12倍水浸泡0.5h，加热煎煮提取2次，每次30min，趁热过滤，滤液合并，滤液浓缩至密度为1.2-1.3的浸膏，加入适量常用药用辅料后，混匀，湿法制粒，烘干，整粒，分装即得。

药效实验

采用实施例1制得的复方半枝莲作为以下实验一至三所用实验药品。

实验一复方半枝莲对结肠癌细胞的增殖抑制作用

1、材料与仪器

1.1细胞株

结肠癌细胞株COLO205，由中国科学院细胞库提供。

1.2药品与试剂

MTT(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)，胰蛋白酶(美国Amresco公司，3518B039)，胎牛血清(美国GIBCO公司，1428479)，顺铂(中国齐鲁制药有限公司(8090162DB))；复方中所有药材均购自广西南宁市仁爱医院；其余试剂均为国产分析纯。

1.3仪器

冻存管，75cm培养瓶，25cm培养瓶，10cm培养皿，HHS恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司)，SB25-12D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BT125D电子分析天平(德国Sartorius公司)，MilliporeSimplicity-185超纯水仪(美国Millipore公司)，101A-3E电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有关公司)，离心机(美国Thermo公司，ST16R)，全波长酶标仪(EPOCH公司，BIOTEK)，CO₂培养箱(美国TheymoForma381型)，倒置显微镜(德国徕卡公司)。

2、实验方法

当细胞存活率大于90％且处在对数生长期时，将新鲜培养的COLO205细胞用胰酶消化，吹打分散细胞，利用细胞计数法计算，制成2×104个·mL^-1悬浮液，共设6组，每组6个复孔，以每孔100μL移接于96孔培养板，共接种三块培养板，培养24h后，弃去原培养液，除空白组加培养液外，其余各组加入含药培养液各180μL，药物浓度分别为阳性组(顺铂)150/μg·mL-1，复方半枝莲高浓度组0.60/g·L^-1、中浓度组0.30/g·L^-1、低浓度组0.15/g·L^-1。

利用MTT法检测复方半枝莲对COLO205的抑制作用，药物与细胞共同培养24、48、72h后置于显微镜下拍照观察细胞形态。每孔加入MTT20μL(5.0/g·L-1)，继续于37℃、5％CO2培养箱内温育4h，终止培养，小心快速翻转弃去孔内培养液及药物，每孔加入150μLDMSO，至于振荡器上充分振荡10min，使结晶充分溶解。检测细胞增殖抑制率各个过程中均不用PBS洗板，以免将细胞或生成的结晶洗落。用酶标仪于490nm波长处测定各孔的吸光度即OD值。细胞增殖抑制率＝1-细胞存活率，即细胞增殖抑制率/％＝(1-试验组OD值/空白组OD值)×100。

实验所得数据以均数±标准差表示，采用SPSS21软件包进行方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

复方半枝莲对人结肠癌CLOL205细胞增殖的抑制作用MTT实验结果，与空白组比较，除低剂量在24h(P＞0.05)外，其它各药物组在不同时间段的OD值均明显减小(P＜0.01)。复方半枝莲对CLOL205细胞增殖的抑制率随着药物剂量的增加而增大，成较好的量效关系。复方半枝莲高、中、低剂量对COLO205细胞增殖的抑制率在48h最大，分别为68.46％，63.11％，54.91％。具体实验结果见表1。在倒置显微镜下观察，空白组的细胞核质均匀，核仁清楚，细胞形态完整，生长良好，形成贴壁的圆形细胞。复方半枝莲干预后，复方低剂量组24h时间点与空白组的细胞形态相似。其它药物组细胞形态逐渐改变，细胞数逐渐减少，细胞变形，形态不规则，体积缩小，折光性差，细胞悬浮、逐渐脱落而死亡。在加MTT前拍摄各组细胞形态，照片显示的细胞形态与所测数值反映的结果基本相符合，结果如图1所示。

表1不同浓度的复方半枝莲对COLO205细胞生长抑制率的影响

注：与空白组比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01。

实验二复方半枝莲对结肠癌COLO205细胞相关凋亡蛋白表达的影响

1、材料与仪器

1.1细胞株

结肠癌细胞株COLO205，由中国科学院细胞库提供。

1.2药品与试剂

胰蛋白酶(美国Amresco公司，3518B039)，胎牛血清(美国GIBCO公司，1428479)，β-actin单抗隆抗体(美国CellSignalingTechnology公司，3700)，Bc1-2Antibody(美国CellSignalingTechnology公司，2870)，BaxAntibody(美国CellSignalingTechnology公司，5023)，PumaAntibody(美国CellSignalingTechnology公司，4976)。复方中所有药材均购自广西南宁市仁爱医院；其余试剂均为国产分析纯。

1.3仪器

75cm培养瓶，25cm培养瓶，10cm培养皿，HHS恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司)，SB25-12D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BT125D电子分析天平(德国Sartorius公司)，MilliporeSimplicity-185超纯水仪(美国Millipore公司)，离心机(美国Thermo公司，ST16R)，CO₂培养箱(美国TheymoForma381型)，倒置显微镜(德国徕卡公司)，蛋白电泳槽、电泳仪和转移槽(美国Bio-Rad公司)。

2、实验方法

2.1给药：人结肠癌COLO205细胞接种于6cm培养皿，共接种6个，每个5×10⁵个细胞，培养过夜后，其中三个皿的细胞分别给予复方半枝莲，继续培养24，48，72h。

2.2提取细胞蛋白：细胞分别经复方半枝莲作用24，48，72h后，用预冷的DPBS轻柔清洗2遍，吸净残余液体，每个皿加入细胞裂解液50μl，于冰上裂解1个小时，用细胞刮刮下细胞，转移至1.5mlEP管，12,000转/分钟，4℃，离心15min，小心收集蛋白上清液。

2.3蛋白定量：采用BCA法测定蛋白浓度。根据BCA蛋白定量试剂盒说明书配制蛋白标准液及工作液。于96孔板中每孔加入标准品、待测样品25μl，BCA工作液200μl，用移液枪上下轻柔吹打混匀后，避光于37℃孵箱中反应30min，取出后置于酶标仪562nm下测定吸光度值，并计算蛋白浓度。

2.4蛋白变性：根据所测蛋白浓度，加入相应SDS-PAGE上样缓冲液，调整浓度一致后，置于试管加热器煮沸5min，待冷却后置于-80℃保存备用。

2.5电泳：配制12％的分离胶和积成胶进行电泳。将蛋白样品与Marker上样后，以90V电压电泳，待溴酚蓝跑出积成胶进入分离胶后，将电压调至130V电泳，跑至溴酚蓝分离到胶底部时，终止电泳。

2.6转膜：将转膜用的夹子打开，分别铺上湿润的海绵、三层滤纸，从电泳槽中取出玻璃板，切去积成胶，将分离胶转至滤纸上，在胶上铺PVDF膜，再加上3层滤纸，赶走气泡后垫上海绵，合上夹子。将夹子安装至转膜槽中，加入转膜液，在转膜槽周围放置冰袋。将电压调至90V，转膜2.5h。

2.7封闭：配制5％的脱脂牛奶封闭液，将封闭液与PVDF膜一起转移至封闭盒中，在脱色摇床上慢摇，室温封闭2.5h。

2.8一抗孵育：用TBST液清夜PVDF膜3遍，每遍10min，孵上相应的抗体，置于4℃冰箱的摇床上孵育过夜。

2.9二抗孵育：用TBST液清夜PVDF膜3遍，每遍10min，孵上相应的二抗，置于摇床上室温慢摇孵育1h。孵育完毕后用TBST液清夜PVDF膜3遍，每遍10min。

2.10ECL化学发光，显影，定影，将胶片进行扫描，用ImageJ等软件进行处理分析统计。

3、结果

Bc1-2蛋白家族在调节线粒体凋亡方面起着重要作用，按功能可分为两类，一类可抑制凋亡，如Bc1-2，而另一类则可促进凋亡，如Bax。Bcl-2和Bax可结合形成异二聚体，促进细胞凋亡。用WesternBlot检测发现经复方半枝莲干预的人结肠癌COLO205细胞蛋白Bax和Puma的表达上调，而Bc1-2的表达下调。结果如所示图2所示。

实验三

1、材料与仪器

1.1细胞株

结肠癌细胞株COLO205，由中国科学院细胞库提供。

1.2动物SPF级别BALB/C裸鼠，雄性，体重20±2g，4-6周龄，购买于广西医科大学动物实验中心(合格证号：SCXK桂2014-0002)。

1.2药品与试剂

胰蛋白酶(美国Amresco公司，3518B039)，胎牛血清(美国GIBCO公司，1428479)，紫杉醇(美国Invitrogen公司)，Matrigel基质(美国BD公司)，RIPA1640培养基(美国Gibco公司)，复方中所有药材均购自广西南宁市仁爱医院；

1.3仪器

75cm培养瓶，10cm培养皿，HHS恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司)，SB25-12D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BT125D电子分析天平(德国Sartorius公司)，MilliporeSimplicity-185超纯水仪(美国Millipore公司)，101A-3E电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有关公司)，离心机(美国Thermo公司，ST16R)，CO₂培养箱(美国TheymoForma381型)，倒置显微镜(德国徕卡公司)，细胞计数板(美国BD公司)。

2、实验方法

制成2×10⁶个·mL^-1悬浮液，裸鼠饲养于符合SPF级实验动物环境中，环境温度为23～26℃，相对湿度为55％～65％。自由进食纯净水及高压消毒灭菌不含致敏原的饲料。每周更换垫料2次；当细胞存活率大于90％且处在对数生长期时，将新鲜培养的COLO205细胞用胰酶消化，吹打分散细胞，利用细胞计数法计算，将COLO205细胞与Martrigel胶混悬配成2×10⁷个·mL^-1的细胞悬浮液，于每只裸鼠右背处皮下注射0.1mL，待瘤子形成肉眼可观时，用游标卡尺测瘤子体积。根据瘤子体积大小进行随机分组，每组4只，分组后每隔3天秤量裸鼠体重，测量瘤块大小，并记录。设复方半枝莲高、低浓度组，紫杉醇组，空白组。紫杉醇(PTX)每周腹腔注射一次，20mg·kg^-1，其余组每天灌胃一次，给药组浓度分别为100mg·kg^-1，50mg·kg^-1，第30天时，脱颈处死小鼠，剥离瘤子，称重，拍照。

实验所得数据以均数±标准差(夏±S)表示，采用SPSS21软件包进行方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

由图3和图4可看出，复方半枝莲在体内也可抑制结肠癌COLO205细胞的增殖，并与复方浓度成正相关作用，与空白组比较具有显著性差异(P＜0.05)。

参照以上药效实验，分别对实施例2与3的复方半枝莲制剂进行研究，结果与实验一至三类似，在此不做赘述。

此外，在本发明复方半枝莲治疗结肠癌的临床疗效观察中，对照病例(白花蛇舌草与半枝莲两味药组方)与本发明病例临床疗效进行比较。治疗3个周期后，本发明疗效明显优于对照病例，且患者便秘结塞等症状明显减轻，患者的寿命也明显延长。

研究表明，本发明复方半枝莲在体内外均明显抑制结肠癌细胞的生长，具有显著的抗结肠癌作用，可用于制备抗结肠癌药物。

Claims

1.一种抗结肠癌的复方中药，其特征在于由以下重量份的原料药材制成：白头翁6-24份、半枝莲10-30份、生半夏3-12份、薏苡仁15-30份、鸡内金13-60份、茯苓9-40份、白花蛇舌草10-40份。

2.根据权利要求1所述的抗结肠癌的复方中药，其特征在于由以下重量份的原料药材制成：白头翁12-20份、半枝莲20-30份、生半夏6-12份、薏苡仁20-30份、鸡内金15-30份、茯苓9-20份、白花蛇舌草20-40份。

3.根据权利要求2所述的抗结肠癌的复方中药，其特征在于由以下重量份的原料药材制成：白头翁12份、半枝莲20份、生半夏6份、薏苡仁30份、鸡内金30份、茯苓20份、白花蛇舌草20份。

4.权利要求1所述抗结肠癌的复方中药的制备方法，其特征在于按重量份称取各原料药材，加入原料药材总重8-12倍水浸泡0.5-1.5h，加热煎煮提取2-4次，每次0.5-3h，趁热过滤，滤液合并，滤液浓缩成浸膏或干膏。

5.根据权利要求4所述抗结肠癌的复方中药的制备方法，其特征在于在浸膏或干膏中加入适量药用辅料，按常规方法制成制剂。