CN108079202A - 具有改善睡眠，增强机体免疫力功效的药物组合物及制法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药或保健品领域，具体涉及一种具有改善睡眠，增强机体免疫力功效的药物组合物及制法。本发明所解决的技术问题是提供一种全新的药物组合物旨在益气助阳，滋阴养血，安神定惊，用于改善睡眠，增强机体免疫力，尤其是用于以睡眠紊乱、焦躁易怒等为主要表现的亚健康人群，是以冬虫夏草、天麻、酸枣仁、灵芝、珍珠粉为原料药，重量配比如下：冬虫夏草0.5‑10份、天麻5‑40份、酸枣仁20‑90份、灵芝40‑150份、珍珠粉0.5‑6份。临床试验结果表明，本发明组合物具有显著的改善睡眠质量，提高机体免疫力的功效，为公众提供了一种全新的选择。

Description

具有改善睡眠，增强机体免疫力功效的药物组合物及制法
技术领域
本发明属于医药或保健品领域，具体涉及具有改善睡眠，增强机体免疫力功效的药物组合物及制法。
背景技术
睡眠障碍的临床表现以失眠症最为多见。几乎每个人都有失眠的体会，一般而言，本病很少危及生命，但治疗较困难，使患者焦虑不安，严重影响人们的日常生活、工作和身心健康。睡眠障碍是神经内科复杂的系列疾病之一，分类繁杂广泛，临床表现多样，与病因病机关系密切。睡眠障碍的病因众多，生理—心理因素、遗传基因、机体素质、环境条件、社会人际关系、精神刺激、躯体疾患、精神疾病、药物不良反应等都可引起。这些原因能导致脑内睡眠中枢部位及功能发生异常，或由此导致的神经生化改变，促使睡眠结构和进程出现紊乱。
现代免疫学认为，免疫是机体识别和排除抗原性异物的一种功能，其目的是维护机体的生理平衡。免疫系统具有免疫防御、免疫稳定、免疫监视等多种功能，其基本作用是抵抗微生物和化学因子的侵犯以保护机体的健康。免疫力及免疫状态与感染性疾病和非感染性疾病均有密切关系。当人体免疫力低下时，防御外界细菌、病毒侵犯的能力变弱，从而抵御疾病的能力变弱，更容易出现身体不舒适等状况。现代人的生活节奏较快，精神压力加大，睡眠不足，过于疲劳等因素都会使人体的免疫力下降。
中医对失眠的病机总属于阳盛阴衰，阴阳失交，营卫不合、脏腑功能紊乱是失眠的基本病机。常见证候类型有心脾两虚证、痰火扰神证、肝郁气滞证、阴虚火旺证、心胆气虚证、心肾不交证等。
目前用于改善睡眠的化学药物常用镇静催眠药物，主要有巴比妥类如苯巴比妥、异戊巴比妥等，苯二氮卓类如地西泮、艾司唑仑等，非苯二氮卓类如扎来普隆、唑吡坦等。作用机制多为GABA受体激动剂，常见失眠反跳、成瘾性、耐受性等不良反应。保健食品中，以褪黑素成分为主的改善睡眠产品中，国产有111个产品，进口有26个产品。
中医药在改善睡眠、提高机体免疫力方面有着悠久的历史，有着不少经方验方，如归脾汤、酸枣仁汤、血府逐淤汤、柏子养心汤等，中成药中有天王补心丹、解郁安神颗粒、乌灵胶囊、越鞠保和丸等。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种全新的药物组合物旨在益气助阳，滋阴养血，安神定惊，用于改善睡眠，增强机体免疫力，尤其是用于以睡眠紊乱、焦躁易怒等为主要表现的亚健康人群。
本发明提供了用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物，原料药重量配比如下：冬虫夏草0.5-10份、天麻5-40份、酸枣仁20-90份、灵芝40-150份、珍珠粉0.5-6份。
进一步地，原料药重量配比如下：冬虫夏草1-8份、天麻10-30份、酸枣仁30-80份、灵芝50-120份、珍珠粉1-4。
进一步优选原料药重量配比如下：冬虫夏草2-6份、天麻15-25份、酸枣仁40-70份、灵芝70-110份、珍珠粉1.5-3份。
最优选的原料药重量配比如下：冬虫夏草2.5份、天麻20份、酸枣仁60份、灵芝90份、珍珠粉2份。
上述原料药的来源与中国药典2015版收载的内容一致。
上述原料药干品和鲜品均可使用，优选使用干品，干品的获得方法：除去杂质，洗净，晾干，即得。其中，所述重量份以干品计。
进一步地，所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物是取各原料药，按照常规方法制成口服制剂；或加入药学上可接受的辅料制成常用口服制剂。
进一步地，所述常用口服制剂为散剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或口服液。
本发明提供了所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：取各重量配比的原料药，打粉，或加入水或有机溶剂提取，再加入药学上或保健品中可接受的辅料或者辅助性成分，即得。
本发明提供了所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物的制备方法，包括：
方法一：将各原料药粉碎成细粉，混合即成散剂；
方法二：将各原料药粉碎成细粉，装胶囊即成胶囊剂；
方法三：将各原料药粉碎成细粉，压片即成片剂；
方法四：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，即成颗粒剂；
方法五：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，装胶囊即成胶囊剂；
方法六：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，压片即成片剂；
方法七：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，制成口服液。
本发明提供了所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物的制备方法：取各原料药制备为片剂，包括如下步骤：
A、取天麻、酸枣仁、灵芝加水提取，过滤得滤液，浓缩得浸膏；
B、步骤A所得浸膏干燥，粉碎过筛，得浸膏粉备用；
C、混合浸膏粉、冬虫夏草粉、珍珠粉、辅料；
D、制粒、干燥、整粒；
E、总混：混合润滑剂；
F、压片即得。
进一步地，步骤A加水提取条件为：10-14倍量水，提取1-3次，每次1.0-2.0小时。
优选地，步骤A加水提取条件为12倍量水，提取2次，每次2小时。
进一步地，步骤A所述浓缩得浸膏为减压浓缩至密度1.05～1.20的稠膏，于60℃测定。
步骤A酸枣仁宜破碎后加水提取。
步骤B所述干燥为减压干燥，条件为：40-75℃，-0.1～-0.04Mpa。
优选地，步骤B所述干燥条件为65℃，-0.08～-0.06Mpa。
步骤B粉碎过筛为粉碎过65-100目筛；优选粉碎过80目筛。
步骤C所述辅料包括微晶纤维素、淀粉。
步骤C冬虫夏草粉的粒度为过65-100目筛；优选粉碎过80目筛。
珍珠粉的粒度为过65-100目筛；优选粉碎过80目筛。
辅料的粒度为过65-100目筛；优选粉碎过80目筛。
步骤D制粒采用乙醇作为粘合剂。
优选的，步骤D制粒粘合剂采用50-70％乙醇溶液；优选采用60％乙醇溶液。
步骤D制粒采用10-30目制粒；优选18目制粒。
步骤D干燥温度为40-80℃；优选60℃。
步骤D整粒为10-20目整粒；优选16目整粒。
上述技术方案中，步骤E总混，所述润滑剂为硬脂酸镁。
本发明提供了所述的药物组合物在制备用于改善亚健康人群的睡眠，增强亚健康人群的机体免疫力的药物或保健品中的应用。
进一步地，所述亚健康人群的表现为睡眠紊乱、焦躁易怒。
本发明提供了一种全新的可益气助阳，滋阴养血，安神定惊，用于改善睡眠，增强机体免疫力，尤其是用于以睡眠紊乱、焦躁易怒等为主要表现的亚健康人群。动物试验研究证明，本发明组合物可显著增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力，对抗体合成细胞能力有增强的趋势，显著增强小鼠碳廓清能力，对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能有增强的趋势；同时能明显延长由戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，明显增加对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率，明显缩短由巴比妥钠引发的小鼠睡眠的潜伏期。临床试验结果进一步证明，本发明组合物具有显著的改善睡眠质量，提高机体免疫力的功效，为公众提供了一种全新的选择。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。以下所述“虫草天麻枣仁珍珠紫芝片”即本发明片剂。
本发明以冬虫夏草、天麻、酸枣仁、灵芝、珍珠粉为原料药，提供了具有益气助阳，滋阴养血，安神定惊功效的组合物，用于改善睡眠，增强机体免疫力效果十分显著，尤其适用于以睡眠紊乱、焦躁易怒等为主要表现的亚健康人群。
本发明组合物中，灵芝为君药，补气安神，延年益寿；冬虫夏草、酸枣仁、天麻、珍珠四药共为臣药，冬虫夏草助君药补肾壮阳，益精气；酸枣仁助君药敛气，滋阴养血，气阴双补，又重在养心而安神；天麻助君药养血，益气力；珍珠助君药安神定惊之效。方中诸药共奏既能益气助阳，又能滋阴养血，且安神、定志、轻身而延年，用于以睡眠紊乱、焦躁易怒等为主要表现的亚健康人群，具有改善睡眠，增强机体免疫力的作用。
发明人对本发明组合物进行了拆方研究。临床试验结果表明，本发明组合物能明显改善睡眠质量，提高机体免疫力，效果显著优于服用相同/相近剂量的君药(灵芝)和臣药(冬虫夏草+酸枣仁+天麻+珍珠)；在提高睡眠质量、缩短入睡时间、延长睡眠时间、提高睡眠效率、减轻日间功能障碍、减少胃肠不适和改善皮肤状况等单项指标上，本发明组合物的评价结果也明显更优。
发明人在应用时，在以下重量配比范围内调整原料药的用量，均可以实现改善睡眠，增强机体免疫力的目的：冬虫夏草0.5-10份、天麻5-40份、酸枣仁20-90份、灵芝40-150份、珍珠粉0.5-6份。
经过长期临床或实验应用总结，本发明药物组合物原料药优选重量配比如下：冬虫夏草1-8份、天麻10-30份、酸枣仁30-80份、灵芝50-120份、珍珠粉1-4份。
进一步优选重量配比如下：冬虫夏草2-6份、天麻15-25份、酸枣仁40-70份、灵芝70-110份、珍珠粉1.5-3份。
最优选的重量配比如下：冬虫夏草2.5份、天麻20份、酸枣仁60份、灵芝90份、珍珠粉2份；由上述用量配比关系组成的药物组合物疗效更稳定，可控。
进一步地，本发明组合物优选制备成薄膜衣片使用，主要依据如下：
(1)一般情况下片剂的溶出速率及生物利用度较好；
(2)剂量准确，片剂内药物含量差异较小；
(3)质量稳定，片剂为干燥固体，且某些易氧化变质及潮解的药物可借包衣加以保护，所以光线、空气、水分等对其影响较小；
(4)携带、运输、服用较方便；
(5)机械化生产，产量大，成本低，“卫生指标”也容易达到。
本发明组合物以冬虫夏草粉、天麻、酸枣仁、灵芝、珍珠粉为主要原料，为了方便服用，提高制剂的稳定性，同时便于包装、运输、携带、储存，考虑将其制成片剂，为提高产品稳定性及掩盖片芯气味，因此设计包薄膜衣。
进一步地，本发明还提供了所述组合物的制备方法。
天麻、酸枣仁、灵芝三味药材采用水提的方法比较容易提出有效成分；珍珠粉、冬虫夏草粉外加最适宜。结合片剂的常规工艺，本发明组合物制成片剂根据实际生产条件确定的制备方法，包括提取、浓缩、干燥、混合、制粒、压片、包衣等步骤，工艺路线操作简便，适合于实际大生产。
实施例1 本发明片剂的制备工艺
一、提取工艺确定
1提取工艺确定依据
1.1提取条件的考察
以总皂苷、天麻素为考察指标，以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，设计三因素三水平试验，按L9(34)正交表进行试验，优选水提取工艺条件。因素及水平见表1。
表1正交试验因素水平表
称取天麻20g、酸枣仁60g、灵芝90g(灵芝破碎，天麻切片，酸枣仁粗碎)，9份，每份170g，按照L9(34)表安排试验，提取，滤过，合并滤液，测定滤液中总皂苷、天麻素总量，结果及分析见表2、3。
表2正交实验及总皂苷提取结果表L9(34)
表3方差分析表
误差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
A 272.46 2 136.23 3.69 P＞0.05 无
B 1121.80 2 560.90 15.21 P＞0.05 无
C 2382.11 2 1191.05 32.29 P＜0.05 *
误差(D) 73.76 2 36.88 —— —— ——
F0.05(2,2)＝19.00 F0.01(2,2)＝99.00
由方差分析结果可知，提取次数对总皂苷的提取有显著影响(P＜0.05)，加水量和提取时间对总皂苷的提取量影响不显著，由方差分析可以得较佳条件为A3B3C3，即药材加入14倍量水提取3次，每次2小时。
因素A2加水12倍量与A3加14倍量结果比较接近；因素C2提取2次和因素C3提取3次对结果影响不大；实际生产中考虑到节能减耗，将最佳提取工艺定为A2B3C2，即加12倍量水提取2次，每次2小时(在沸腾条件下煎煮)。
1.2.提取工艺验证
分别取天麻440g、酸枣仁1320g、灵芝1980g，加12倍水，提取2次，每次2小时；滤过，合并滤液，测定滤液中总皂苷含量，同法共制3份样品，将测定含量后的滤液混合并减压浓缩(60～80℃，-0.08～-0.06Mpa)至相对密度为1.05～1.20(60℃)的浸膏，减压干燥(65℃，-0.08～-0.06Mpa)至干，粉碎，过80目筛，得浸膏粉1091g，备用。具体结果见表4。
表4提取验证试验
经上述提取验证试验，总皂苷总量变化不大，与正交数据基本一致，最终确定提取为：天麻、酸枣仁、灵芝，加12倍量水，提取2次，每次2小时。
2浓缩与干燥工艺
按照生产浓缩和干燥的参数最终确定工艺为：提取滤液减压浓缩(60～80℃，-0.08～-0.06Mpa)，相对密度1.05～1.20(60℃)的浸膏，减压干燥(65℃，-0.08～-0.06Mpa)至干，粉碎，过80目筛，得浸膏粉备用。
3填充剂的选择
压片所用的药物一般应具有良好的流动性和可压性，有一定的黏着性，遇体液能迅速崩解、溶解、吸收而产生应有的疗效，但实际上很少有完全具备这些性能的药物，因此，一般须加入赋形剂使之达到上述要求。取5.3.1.2验证试验中备用的干膏粉(出膏率为9.72％)、珍珠粉、冬虫夏草粉各5份，选用糊精、淀粉、微晶纤维素作为赋形剂进行考察。结果见表5：
表5填充剂的筛选
通过以下几个指标考察所制得的素片质量，见下表6。
表6填充剂筛选结果
结果表明，方案2、4制粒容易，所得颗粒均匀，压片容易，硬度适中，脆碎度合格，崩解时间合适，由于方案4辅料成本较低，优选方案4。故确定本品填充剂为微晶纤维素、淀粉调至总量。
4混合时间选择
分别取天麻2000g、酸枣仁6000g、灵芝9000g，加12倍水，提取2次，每次2小时；滤过，合并滤液，减压浓缩(60～80℃，-0.08～-0.06Mpa)至相对密度为1.05～1.20(60℃)的浸膏，减压干燥(65℃，-0.08～-0.06Mpa)至干，粉碎，过80目筛，得浸膏粉1604g，另取冬虫夏草粉250g、珍珠粉200g、微晶纤维素160g、淀粉986g，分别混合10、20、30分钟考察均匀性，分别于5个不同位置取样，测定总皂苷含量的均一性，结果见表7：
表7混合时间选择结果
由结果看出，混合30分钟后其物料色泽均一，含量均衡，表明物料已经混合均匀，考虑到物料的性质，故确定混合时间为30分钟。
5湿润剂选择
药材提取物具有一定的吸湿性，用水制粒，物料太粘，无法制粒，故选择不同浓度的乙醇作为湿润剂制粒，以制粒的难易程度筛选润湿剂。取5.3.4混合时间选择项下混合均匀的物料1800g，平均分为3份，18目制粒，55℃干燥，16目整粒，考察结果见表8。
表8润湿剂的筛选
根据以上结果，编号2样品颗粒制备容易，粒度较好，故确定用60％乙醇液作为润湿剂。6颗粒干燥时间选择
颗粒的含水量对压片有一定的影响，选择烘干温度55℃时考察湿颗粒的干燥时间。将5.3.5项下实验2湿颗粒平均分为3份，按下表烘干时间进行干燥，以颗粒含水率和压片情况为考察指标，结果见表9。
表9干燥时间考察
结果表明，干燥时间1～1.5小时，压片片面光洁，完整，故确定颗粒干燥时间为1小时，水分控制在5％以下。
7崩解剂及润滑剂的选择
本品原料以中药提取物为主，物料粘性较大，初步筛选的配方制成的素片崩解时间在25分钟左右，崩解时间较优。硬脂酸镁是一种优良的压片润滑剂，我们选用硬脂酸镁为本制剂的润滑剂并优选其用量。
取5.3.4混合时间选择项下混合均匀的物料700g，用60％乙醇制软材，18目制粒，60℃干燥，16目整粒，得干颗粒。取颗粒3份，每份200g(相当于500片)，分别加不同量的硬脂酸镁混合均匀，测定物料休止角及压片情况，考察结果见表10、11。
表10润滑剂用量考察
表11休止角测定
结果表明，试验2、3润滑较好，压片后片面光洁，润滑较好，均符合生产需求，试验2中硬脂酸镁用量为2.5g/1000片时即可起到润滑作用，故确定硬脂酸镁用量为2.5g/1000片，淀粉用量可做调整。
8包衣工艺
为了增加片剂的稳定性，掩盖气味，故对素片进行薄膜包衣。直接采用市售薄膜包衣剂，按使用说明用70％乙醇配制成10％的溶液，取5.3.4混合时间选择项下混合均匀的物料600g，用60％乙醇制软材，18目制粒，60℃干燥，16目整粒，得干颗粒，加3.75g硬脂酸镁混合均匀、压片，素片重0.4g。取3份素片，每份200g，进行包衣考察包衣粉用量，见表12。
表12包衣粉用量考察
试验号 1 2 3
素片 200g 200g 200g
包衣剂 4g 5.5g 7.5g
包衣片外观 片面未被完全掩盖 基本掩盖，但不均匀 掩盖均匀，表面光洁
包衣后重量 202g 203g 204g
结果试验1、2不能完全掩盖素片，片面不光洁，而试验3包衣片表面光洁，衣层均匀，故确定薄膜包衣剂的投料量15g/1000片，包衣增重约2％。
表13配方量
以上原辅料制成1000片，素片重为0.4g，包衣增重按2％计，故本品规格定为0.4g/片。
同时，筛选试验过程中，发明人发现1、因为灵芝吸水量大，与酸枣仁、天麻一起提取的时候出膏率非常低，常规加水量只有8％左右，所以加水量需要提高到12倍。因为出膏率较低，所以压片辅料的空间比较大，最后小试出膏率约10％左右。2、制粒过程中，由于微晶纤维素粘性较大，所以制粒条件：控制温度＜30℃，湿度＜35％；湿润剂加入缓慢，快速制粒，若有轻微结团，可以过筛制粒成型。
二、中试及以上生产规模的工艺验证报告
按确定工艺条件进行了三批中试验证，中试生产量依次为17500片+7kg混合物、15000片和15000片，生产环境符合保健食品GMP的相关要求，中试生产验证结果见下：
表14三批中试生产验证数据表
实施例2 本发明药物组合物日服剂量的验证
本发明药物组合物的日服用剂量及药典参考日服剂量如表15：
表15本发明日服用剂量及药典参考日服剂量
原料 本发明日用量 药材参考日用量
冬虫夏草粉 0.25g 3～9g
天麻 2.0g 3～10g
酸枣仁 6.0g 10～15g
灵芝 9.0g 6～12g
珍珠粉 0.2g 0.1～0.3g
由上可见，采用上述配方的本发明药物组合物，冬虫夏草、天麻、酸枣仁均显著低于药典参考日服剂量。因此，为了避免质疑未达到推荐剂量，发明人特别就以下四组剂量做了对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT)的影响，日用量的比较见表16：
表16日用量
原料 本发明日用量 药材参考日用量下限 药材参考日用量中间值 药材参考日用量上限
冬虫夏草粉 0.25g 3g 6g 9g
天麻 2.0g 3g 7g 10g
酸枣仁 6.0g 10g 12g 15g
灵芝 9.0g 6g 9g 12g
珍珠粉 0.2g 0.1g 0.2g 0.3g
试验剂量 1.7g生药/kg 3.6生药/kg 5.7生药/kg 7.7生药/kg
分组 配方A 配方B 配方C 配方D
取以上四组相应用量的药材，冬虫夏草粉、珍珠粉、微晶纤维素、淀粉分别过80目筛，备用；酸枣仁破碎，备用；称取天麻、酸枣仁、灵芝，加12倍量水提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至密度1.05～1.20(60℃)的稠膏，减压干燥(65℃，-0.09Mpa)，粉碎过80目筛，得浸膏粉，备用。按配方量称取浸膏粉、冬虫夏草粉、珍珠粉混合均匀备用(不加辅料)。临用前配置成动物试验可灌胃的合适浓度。
1、试验方法
对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT)：将小鼠连续灌服45天各剂量药液，无菌取脾,Hank’s液中将脾磨碎制成单细胞悬液，Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。将细胞悬浮于1mL的完全培养液，台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度至3×106个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO237℃CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入lmL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行孔，用酶标仪以570nm下测定OD值。
延长戊巴比妥钠睡眠时间实验：各组动物每天按前述剂量经口给予受试样品1次，灌胃容积为20ml/kgBW，空白对照组给同容积纯净水，每天1次，连续45天。动物末次给予受试样品后30min，各组动物腹腔注射46mg/kg戊巴比妥钠，注射容积为0.2ml/20g BW，观察动物，以翻正反射消失为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。
2、试验结果
试验结果见表17、表18：
表17对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
与空白对照组比较：*P<0.05
表18对延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
与空白对照组比较：*P<0.05
3、试验结论
表17可见，经口给予小鼠不同配方的本品45d后，与空白对照组比较，各剂量组均能显著提高淋巴细胞增值能力(P<0.05)，即能显著提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力；表18可见，经口给予小鼠不同配方的本品45d后，与空白对照组比较，辐照后第3天，各组显著延长小鼠戊巴比妥睡眠时间(P<0.05)。即本发明配方能够显著增强免疫力，改善睡眠。
实施例3 本发明药物组合物增强免疫力的动物实验
按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)功能学评价检验方法中的“增强免疫力功能检验方法”进行试验：
1材料和方法
1.1样品：虫草天麻枣仁珍珠紫芝片，规格：0.4g/片×40片/瓶，批号：20150910，青海春天药用资源科技利用有限公司提供，样品性状：棕褐色薄膜衣片，保存条件：常温、密闭保存。人体推荐剂量每日2次，每次4片，口服(3.2g/60kgBW/日,即0.0533g/kg BW/日)。
1.2实验动物、饲料及饲养环境：
动物：BALB/c小鼠，近交系，雄性，来源于长春生物制品研究所有限责任公司，许可证号码SCXK(吉)-2011-0003，初始体重18-22g；豚鼠，封闭群，雄性，6只，来源于长春生物制品研究所有限责任公司，许可证号码SCXK(吉)-2012-0001。
试验饲料：大小鼠生长繁殖饲料来源于北京科澳协力饲料有限公司，产品批号16013131。
饲养环境：清洁级，实验动物使用许可证号：SYXK-(吉)2015-0009；动物室温度：20-23℃；相对湿度：45-65％。
1.3剂量选择、分组及受试物给予方式
按人群推荐日摄入量0.0533g/kg BW扩大5、10、30倍设置低、中、高三个剂量组，即0.267g/kg BW、0.533g/kg BW、1.600g/kg BW。
小鼠按批次分I、II、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五个大组，每大组80-84只小鼠，分成6组：空白对照组(30天预试)、受试物中剂量组(30天预试)、空白对照组、受试物低、中、高三个剂量组。
每个剂量组12-14只。其中I组小鼠进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化、NK细胞活性试验；II组小鼠进行迟发型变态反应试验(DTH)；Ⅲ组小鼠进行抗体生成细胞检测和血清溶血素的测定；Ⅳ组小鼠进行小鼠碳廓清试验；Ⅴ组小鼠进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。
受试样品用纯净水配制，低、中、高剂量配制浓度分别为13.3mg/mL、26.7mg/mL、80.0mg/mL，经口每日1次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为0.2mL/10g BW。连续灌胃30天或45天后，测定各项增强免疫力功能指标。
1.4主要仪器、器械、试剂：
分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴、酶标仪、显微镜等。
无菌手术器械、游标卡尺(精密度0.02mm)、微量注射器(25μL)、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、直径35mm小培养皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等。
绵羊红细胞(SRBC)、鸡红细胞、补体(豚鼠血清)、YAC-1细胞、生理盐水、Hank’s液(pH7.2-7.4)、Gey's液、SA缓冲液、PBS缓冲液(pH7.2–7.4)、0.2mol/L的Tris–HCl缓冲液(pH8.2)、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、MTT、琼脂糖、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、l％NP40、印度墨汁、l％冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇(96mL异丙醇加4mL盐酸)、丙酮、甲醇、Giemsa染液等。
1.5方法
1.5.1脏器/体重比值测定
小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
1.5.2ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)
无菌取脾,Hank’s液中将脾磨碎制成单细胞悬液，Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。将细胞悬浮于1mL的完全培养液，台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度至3×106个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO237℃CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入lmL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行孔，用酶标仪以570nm下测定OD值。
1.5.3绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法DTH)
取羊血，生理盐水洗涤，小鼠用2％(V/V)SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL/只(约1×108个SRBC)。免疫后4天，测量左后足跖部厚度，测量部位皮下注射20％(V/V)SRBC，20μL/只(约1×108个SRBC)，注射后24h测量左后足跖部厚度三次，计算平均值。
1.5.4抗体生成细胞检测(溶血空斑试验)
免疫动物：取脱纤维羊血，用生理盐水洗涤，实验结束前5天将小鼠用2％(v/v)的SRBC细胞悬液腹腔注射0.2mL/只进行免疫。
制备补体：取豚鼠血清5mL，加入1mL压积的SRBC，4℃的冰箱放置30min，每隔5min振荡一次，2000r/min，10min，离心取上清液，分装，-70℃保存。用时以SA缓冲液按1:10稀释。
制备底层琼脂糖培养皿：取4.2g的琼脂糖加入Gey's液至300mL，加热溶解，取2mL平铺于直径35mm的培养皿上，暴露于室温，12h后备用。
脾细胞悬液的制备：将SRBC免疫的小鼠脱臼处死，取出脾脏，放在有Hank's液的小平皿內轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目筛网，2000r/min离心10min，再用Hank's液洗涤2遍，最后将脾细胞悬浮在5mL的RPMI1640培养液中，计数细胞，细胞浓度调至5×106个/mL。
空斑测定：在1.5mL的EP管中加入1mL的上层琼脂糖液(1g琼脂糖加蒸馏水至100ml，加热溶解，放在47℃的水浴锅备用)，加入50μL的羊红细胞(25％)，25μL的脾细胞(5×106个/mL)，迅速混匀，倾倒在底层铺琼脂糖的培养皿上。放入37℃的CO2培养箱中，孵育2h，取出轻轻加入鼠补体1mL(1:10稀释)，再放入37℃的CO2培养箱中，孵育1h，取出室温放置1h，之后放在4℃冰箱中，放置一夜，第二天计数溶血空斑数。
1.5.5血清溶血素测定(血凝法)
免疫动物：取脱纤维羊血，用生理盐水洗涤，实验结束前5天将小鼠用2％(v/v)的SRBC细胞悬液腹腔注射0.2mL/只进行免疫。
凝集反应
①末次给予受试样品后60min，摘除眼球取血放予离心管内，放置1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
②用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100ul，再加入100ul0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃CO2培养箱孵育3h，观察血球凝集程度。
血清凝集成度一般分为5级(0-IV)记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项试验结果阳性。
抗体水平＝(S1+2S2+3S3……nSn)
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
0级红细胞全部下沉，集中在孔板底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。
I级红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞。
II级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
III级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。
IV级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
1.5.6小鼠碳廓清实验
动物末次给予受试样品后50min，各组动物尾静脉注入稀释的印度墨汁(用生理盐水稀释3-4倍)，注射容积为10ml/kg BW，待墨汁注入，注入墨汁后2、10min，分别从内毗静脉丛取血20μL，并立即将其加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中。用722分光光度计在600nm波长处测光密度(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。
末次取血后立即将小鼠处死，取肝脏、脾脏和胸腺，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。
1.5.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
动物末次给予受试样品后60min，每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以丙酮:甲醇＝l:l溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。
油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数
在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能，通常分为4级：
I级：未消化——被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫色；
II级：轻度消化——胞质浅黄绿色、胞核固缩呈紫蓝色；
III级：重度消化——胞质淡染，胞核淡浅灰色；
IV级：完全消化——巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。
计算：以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，式中P为吞噬百分率，用小数表示，再进行方差分析。
1.5.8NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
实验前24h传代培养靶细胞YAC-l，应用前以Hank’s液洗3次，含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至4×105个/mL。受试小鼠脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，Hank’s液洗3次，每次1500r/min离心10min，用2mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度至2×107个/mL，使效靶比为50:1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和l％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，37℃，5％CO2培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入lmol的HCl溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测定OD值，计算NK活性：
1.6实验数据统计
一般采用方差分析方法进行数据处理，但需按方差分析的程序先进性方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：本组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
1.7结果判定
在细胞免疫功能(ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化，迟发型变态反应(足跖增厚法DTH))、体液免疫功能(抗体生成细胞检测，血清溶血素测定)、单核-巨噬细胞功能(小鼠碳廓清，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞)、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
其中细胞免疫功能测定项目中的两个试验结果均为阳性，或任一个试验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定结果中两个试验结果均为阳性，或任一个试验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个试验结果均为阳性，或任一个试验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定试验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。
2结果：
2.1虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠体重的影响
虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠体重无明显影响，各剂量组与空白对照组比较P>0.05，见表19、表20、表21、表22、表23。
表19实验Ⅰ组(ConA诱导的淋转、NK细胞活性)试验前后小鼠体重变化
表20实验Ⅱ组(迟发型变态反应)试验前后小鼠体重变化
表21实验Ⅲ组(抗体生成细胞和血清溶血素的测定)试验前后小鼠体重变化
表22实验Ⅳ组(小鼠碳廓清试验)试验前后小鼠体重变化
表23实验Ⅴ组(小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验)试验前后小鼠体重变化
2.2虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠胸腺、脾脏器官的影响
表24虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠淋巴器官/体重比值的影响
由表24可见，经统计学处理，经口给予受试物30天或45天，虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠胸腺/体重比值和脾脏/体重比值无明显影响，各剂量组与空白对照组比较均为P>0.05，见表24。
2.3虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法DTH)的影响
表25虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法DTH)的影响
由表25可见，经口给予受试物30天或45天，经统计学处理，各剂量组足跖肿胀度与空白对照组比较差异均无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法DTH)无显著影响。
2.4虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
表26虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
注：各实验组与空白对照组比较，*P<0.05，***P<0.001
由表26可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物45天，经统计学处理，各剂量组淋巴细胞的增殖能力与空白对照组间比较均存在显著性差异(P<0.05)，即受试物能显著提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力。
2.5虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠抗体生成细胞的影响
表27虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠抗体生成细胞功能的影响
由表27可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物45天，经统计学处理，中剂量组、高剂量组对抗体生成细胞数(空斑数)有增加的趋势(P＝0.077和P＝0.055)。
2.6虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠血清溶血素滴度水平的影响
表28虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠溶血素滴度水平的影响
由表28可见，经口给予受试物30天或45天，经统计学处理，各剂量组血清溶血素抗体积数与空白对照组比较均无显著性差异(P>0.05)，即受试物对小鼠血清溶血素滴度水平无显著影响。
2.7虫草天麻枣仁珍珠紫芝片小鼠碳廓清实验结果
表29虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠碳廓清功能的影响
注：各实验组与空白对照组比较,*P<0.05
由表29可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物45天，经统计学处理，中剂量组、高剂量组能显著提高小鼠碳廓清吞噬指数，与空白对照组比较P<0.05，即受试物能显著提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬能力。
2.8虫草天麻枣仁珍珠紫芝片腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能结果
表30虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响
由表30可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物45天，经统计学处理，中剂量组、高剂量组有提高吞噬率、吞噬指数的趋势，与空白对照组比较,P>0.05。
2.9虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠NK细胞活性的影响
表31虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠NK细胞活性的影响
由表31可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物45天，经统计学处理，各剂量组NK细胞活性与空白对照组间比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠的NK细胞活性无明显影响。
3小结
根据送检单位提供的人群推荐日摄入量0.0533g/kg BW/日，扩大5、10、30倍设置低、中、高三个剂量组，即0.267g/kg BW、0.533g/kg BW、1.600g/kg BW，另设空白对照组。采用SPF级近交系BALB/c小鼠，连续灌胃给予，30天或45天后开始检测有关指标。实验结果以P<0.05判断为显著性差异，各剂量组与空白对照组比较，结果显示：
1)各剂量组对小鼠体重、淋巴器官/体重比值无影响；
2)各剂量组能显著性增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力；
3)各剂量组对绵阳红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应无明显影响；
4)中剂量组、高剂量组对抗体生成细胞能力有增强的趋势(P＝0.077和P＝0.055)；
5)各剂量组对小鼠血清溶血素含量无明显影响；
6)中剂量组、高剂量组能显著性增强小鼠碳廓清能力；
7)中剂量组、高剂量组对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能有增强的趋(P＝0.288和P＝0.110)；
8)各剂量组对小鼠NK细胞活性无明显影响。
综上可见，虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖实验三个剂量组结果均呈阳性，对小鼠碳廓清实验两个剂量组呈阳性。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)增强免疫力功能动物实验结果标准判定，受试样品具有增强免疫力功能的作用。
实施例4本发明药物组合物改善睡眠的动物实验
按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)功能学评价检验方法中的“改善睡眠功能检验方法”进行试验：
1材料和方法
1.1样品：虫草天麻枣仁珍珠紫芝片，规格：0.4g/片×40片/瓶，批号：20150910，青海春天药用资源科技利用有限公司提供，样品形态为棕褐色薄膜衣片，常温、密闭保存。人体推荐剂量每日2次，每次4片，口服(3.2g/60kgBW/日,即0.0533g/kg BW/日)。
1.2实验动物、饲料及饲养环境：
动物：昆明种小鼠，封闭群，来源于长春生物制品研究所有限责任公司，许可证号码SCXK(吉)-2011-0003，初始体重18-22g。
试验饲料：大小鼠维持饲料来源于北京科澳协力饲料有限公司，产品批号16023221。
饲养环境：清洁级，实验动物使用许可证号：SYXK(吉)2015-0009；动物室温度：20-23℃；相对湿度：45-65％。
1.3剂量选择、分组及受试品给予方式
按人群推荐日摄入量0.0533g/kg BW扩大5、10、30倍设置低、中、高三个剂量组，即0.267g/kg BW、0.533g/kg BW、1.600g/kg BW。
小鼠按批次分I、II、Ⅲ、Ⅳ四个大组；每大组80-84只小鼠，分成6组：空白对照组(30天预试)、受试品中剂量组(30天预试)、空白对照组、受试品低、中、高三个剂量组。
每个剂量组12-14只。其中I组小鼠进行直接睡眠实验；II组小鼠进行延长戊巴比妥钠睡眠时间实验；Ⅲ组小鼠进行戊巴比妥钠阈下剂量睡眠实验；Ⅳ组小鼠进行巴比妥钠睡眠潜伏期实验。
受试样品用纯净水配制，低、中、高剂量配制浓度分别为13.3mg/ml、26.7mg/ml、80.0mg/ml，经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为0.2ml/10g BW。连续灌胃30天或45天后，测定各项改善睡眠功能指标。
1.4主要仪器与试剂：
1.4.1主要仪器：
T-1000型电子天平，精度1/10，美国双杰兄弟(集团)有限公司常熟双杰测试仪器厂，仪器编号：GD1-20，称小鼠体重用。
ALC-2104型电子天平，精度1/10000，北京赛多利斯科学仪器有限公司，仪器编号：GD2-10，称固体试剂用。
1.4.2试剂:
戊巴比妥钠(C11H17N2NaO3)
巴比妥钠(C8H11N2NaO3)
1.5方法
1.5.1直接睡眠实验
各组动物每天按前述剂量经口给予受试样品1次，灌胃容积为20ml/kgBW,空白对照组给同容积纯净水，每天1次，连续30或45天。观察是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过30-60sec不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录空白对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间。
1.5.2延长戊巴比妥钠睡眠时间实验
各组动物每天按前述剂量经口给予受试样品1次，灌胃容积为20ml/kgBW，空白对照组给同容积纯净水，每天1次，连续30天或45天。动物末次给予受试样品后30min，各组动物腹腔注射46mg/kg戊巴比妥钠，注射容积为0.2ml/20g BW，观察动物，以翻正反射消失为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。
1.5.3戊巴比妥钠阈下剂量睡眠实验
各组动物每天按前述剂量经口给予受试样品1次，灌胃容积为20ml/kgBW，空白对照组给同容积纯净水，每天1次，连续30天或45天。动物末次给予受试样品后40min，各组动物腹腔注射25mg/kgBW戊巴比妥钠，注射容积为0.2ml/20g BW，动物置24-25℃安静环境下，观察动物以翻正反射消失达1min以上为入睡动物，记录每组30min内入睡动物数。
1.5.4巴比妥钠睡眠潜伏期实验
各组动物每天按前述剂量经口给予受试样品1次，灌胃容积为20ml/kgBW，空白对照组给同容积纯净水，每天1次，连续30天或45天。动物末次给予受试样品后20min，各组动物腹腔注射巴比妥钠275mg/kgBW，注射容积为0.2ml/20gBW，观察动物，以翻正反射消失为指标，观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。
1.6实验数据统计：
2.3.1延长戊巴比妥钠睡眠时间实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验，一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
2.3.2戊巴比妥钠阈下剂量睡眠实验和直接睡眠实验中，入睡动物数为计数资料，用X2检验(确切概率法)。
1.7结果判定
延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量睡眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期三项实验中二项阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该受试物样品具有改善睡眠功能作用。2结果：
2.1虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠体重的影响
虫草天麻枣仁珍珠紫芝片由表32、33、34、35可见，虫草天麻枣仁珍珠紫芝片按0.267g/kg BW、0.533g/kg BW、1.600g/kg BW剂量,每天灌胃1次，连续30及45天，对小鼠体重无明显影响。
表32实验Ⅰ组试验前后小鼠体重变化—直接睡眠实验
表33实验Ⅱ组试验前后小鼠体重变化—延长戊巴比妥钠睡眠时间实验
表34实验Ⅲ组试验前后小鼠体重变化—戊巴比妥钠阈下剂量睡眠实验
表35实验Ⅳ组试验前后小鼠体重变化—巴比妥钠睡眠潜伏期实验
2.2虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠直接睡眠的影响
表36对小鼠直接睡眠的影响
由表36可见，小鼠连续30天经口给予虫草天麻枣仁珍珠紫芝片0.533g/kgBW，每日1次，对小鼠直接睡眠作用与空白对照组比较无明显差异。小鼠连续45天给予虫草天麻枣仁珍珠紫芝片按0.267g/kgBW、0.533g/kgBW、1.600g/kgBW受试品每日1次，各剂量组对小鼠直接睡眠作用与空白对照组比较均无明显差异。
2.3虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
表37虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
注：各实验组与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
由表37可见，小鼠连续30天经口给予虫草天麻枣仁珍珠紫芝片0.533g/kgBW，每日1次，对延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间与空白对照组比较无明显差异；小鼠连续45天给予虫草天麻枣仁珍珠紫芝片按0.267g/kgBW、0.533g/kgBW、1.600g/kgBW受试品每日1次，经统计学处理，中、高剂量组睡眠时间与空白对照组间比较均存在显著性差异(P<0.05或P<0.01)，即受试物能延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间。
2.4虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量睡眠的影响
采用Fisher—确切概率检验
表38虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对戊巴比妥钠阈下剂量小鼠睡眠发生率的影响
注：各实验组与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
由表38可见，经口给予受试物0.533g/kgBW 30天，统计学处理，对阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠动物数与空白对照组比较无明显差异；经口给予小鼠不同剂量的受试物45天，经统计学处理，中剂量组、高剂量组小鼠入睡动物发生率与空白对照组间比较均存在显著性差异(P<0.05)，即受试物能明显提高阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠入睡动物发生率(P<0.05或P<0.01)。
2.5虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期的影响
表39虫草天麻枣仁珍珠紫芝片对小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期的影响
注：各实验组与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
由表39可见，经口给予受试物30天或31天，统计学处理，各剂量组睡眠潜伏期与空白对照组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)，即受试物能明显缩短小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期。
3小结
3.1无直接睡眠作用；
3.2虫草天麻枣仁珍珠紫芝片0.267g/kgBW、0.533g/kgBW、1.600g/kgBW三个剂量，每天给予小鼠灌胃1次，灌胃容积20ml/kgBW，空白对照组给同容积纯净水，连续给予45天，0.533g/kgBW、1.600g/kgBW两个剂量能明显延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间(实验结果呈阳性)；
3.3按上述剂量连续给予45天，0.533g/kgBW、1.600g/kgBW两个剂量能明显提高戊巴比妥钠阈下剂量入睡小鼠发生率(实验结果呈阳性)；
3.4按上述剂量连续给予30天，虫草天麻枣仁珍珠紫芝片三个剂量均能明显缩短由巴比妥钠导致的小鼠睡眠潜伏期(实验结果呈阳性)；
综上可见，虫草天麻枣仁珍珠紫芝片两个剂量组能明显延长由戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，两个剂量组能明显增加对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率，三个剂量组能明显缩短由巴比妥钠引发的小鼠睡眠的潜伏期。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)改善睡眠动物实验结果标准判定，受试样品具有改善睡眠功能的作用。
实施例5本发明药物组合物的安全性毒理学评价
将本发明药物组合物的片剂进行安全性毒理学评价，包括急性毒性试验、鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、30天喂养试验，结果如下：
小鼠经口给予虫草天麻枣仁珍珠紫芝片最大耐受量大于26.6g/kgBW，为人日用量的502倍，属无毒级；鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验)、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性；虫草天麻枣仁珍珠紫芝片按6.0g/kgBW、3.6g/kgBW、2.2g/kgBW剂量连续饲喂大鼠30天，对大鼠外观行为、体重、进食量、食物利用率、血液学指标、血液生化学指标、主要脏器重量、脏器指数均无明显影响，组织病理学检查未见与受试物有关的明显改变。高剂量组分别为人日摄入量的114倍，表明虫草天麻枣仁珍珠紫芝片大鼠30天喂养未见明显毒副作用。
实施例6本发明药物组合物改善睡眠、增强机体免疫力的临床疗效
为了验证本发明药物组合在改善睡眠，增强机体免疫力方面的临床疗效，并根据配伍，将配方拆分为君药组(灵芝)、臣药组(冬虫夏草+酸枣仁+天麻+珍珠)，与本发明配方进行临床效果的对比观察。选取包括办公室工作白领、家庭主妇、退休人员，年龄在20-50岁，存在免疫力低下、睡眠障碍(睡眠积分14分以上者)、生活/工作压力大等情况的人员共180例，男女不限，随机分为3组。参照“匹兹堡睡眠质量指数量表”以及有关免疫力方面的症状，制订评分量表。具体方法如下：
1、样品制备：按照下表的配方量，分别制备三组片剂：
表40配方表
2、睡眠质量指数量表
表41睡眠质量指数量表
*睡眠效率＝睡眠时间/床上时间×100％
PSQI总分＝成分A+成分B+成分C+成分D+成分E+成分F+成分G
3、自身免疫力的自评量表
表42自身免疫力自评量表
4、试食方案：
将180名受试者随机分为3组，每组60例，分别服用配方A、B、C。均连续服用30天，分别在试食前、试食30天后，对睡眠质量、自身免疫力评价进行分级量化评分记录，统计数据并进行症状和疗效分析。
对睡眠、免疫力积分评定标准：
积分降低率＝(治疗前总积分―治疗后总积分)/治疗前总积分×100％
非常显著：临床症状、体征消失或基本消失，积分减少≥95％
显著：临床症状、体征明显改善，积分减少≥70％
有效：临床症状、体征有好转，积分减少≥30％
无效：临床症状、体征无明显改善，积分减少≤30％
另外，对主要症状和体征均做单项评价。
5、结果：
5.1睡眠质量疗效统计
表43睡眠质量疗效统计结果
疗效/配方 配方A 配方B 配方C
非常显著例数 8 3 4
显著例数 14 9 6
有效例数 5 10 11
无效例数 3 8 9
总有效率 90.0％ 73.3％ 70.0％
5.2自身免疫力疗效统计
表44自身免疫力疗效统计结果
疗效/配方 配方A 配方B 配方C
非常显著例数 6 3 2
显著例数 12 8 6
有效例数 8 11 8
无效例数 4 8 14
总有效率 86.7％ 73.3％ 53.3％
5.3试服前后有明显改善的主要单项评价(试服后评分小于试服前)
表45试服前后有明显改善的主要单项评价
以上试验结果可以看出：服用本发明组合物30天后，能明显改善睡眠质量，总有效率达到90.0％，显著高于拆方后的君药组和臣药组；在提高自身免疫力方面，总有效率为86.7％，也明显优于君药组和臣药组；单项评价结果表明，本发明组合物相较于拆方后的君药、臣药，在提高睡眠质量、缩短入睡时间、延长睡眠时间、提高睡眠效率、减轻日间功能障碍、减少胃肠不适和改善皮肤状况方面疗效显著。

Claims (10)

1.用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物，其特征在于：原料药重量配比如下：冬虫夏草0.5-10份、天麻5-40份、酸枣仁20-90份、灵芝40-150份、珍珠粉0.5-6份。
2.根据权利要求1所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物，其特征在于：
原料药重量配比如下：冬虫夏草1-8份、天麻10-30份、酸枣仁30-80份、灵芝50-120份、珍珠粉1-4份；
进一步优选原料药重量配比如下：冬虫夏草2-6份、天麻15-25份、酸枣仁40-70份、灵芝70-110份、珍珠粉1.5-3份；
最优选的原料药重量配比如下：冬虫夏草2.5份、天麻20份、酸枣仁60份、灵芝90份、珍珠粉2份。
3.根据权利要求1或2所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物，其特征在于：取各原料药，按照常规方法制成口服制剂；或加入药学上可接受的辅料制成常用口服制剂。
4.根据权利要求3所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物，其特征在于：所述常用口服制剂为散剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或口服液。
5.权利要求1-4任一项所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：取各重量配比的原料药，打粉，或加入水或有机溶剂提取，再加入药学上或保健品中可接受的辅料或者辅助性成分，即得。
6.权利要求1-4任一项所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物的制备方法，其特征在于：包括：
方法一：将各原料药粉碎成细粉，混合即成散剂；
方法二：将各原料药粉碎成细粉，装胶囊即成胶囊剂；
方法三：将各原料药粉碎成细粉，压片即成片剂；
方法四：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，即成颗粒剂；
方法五：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，装胶囊即成胶囊剂；
方法六：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，压片即成片剂；
方法七：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，制成口服液。
7.权利要求1-4任一项所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物的制备方法，其特征在于：取各原料药制备为片剂，包括如下步骤：
A、取天麻、酸枣仁、灵芝加水提取，过滤得滤液，浓缩得浸膏；
B、步骤A所得浸膏干燥，粉碎过筛，得浸膏粉备用；
C、混合浸膏粉、冬虫夏草粉、珍珠粉、辅料；
D、制粒、干燥、整粒；
E、总混：混合润滑剂；
F、压片即得。
8.根据权利要求7所述的用于改善睡眠，增强机体免疫力的药物组合物的制备方法，其特征在于：至少满足以下任一项：
步骤A加水提取条件为：10-14倍量水，提取1-3次，每次1.0-2.0小时；优选加水提取条件为12倍量水，提取2次，每次2小时；
步骤A所述浓缩得浸膏为减压浓缩至密度1.05～1.20的稠膏，于60℃测定；
步骤A酸枣仁宜破碎后加水提取；
步骤B所述干燥为减压干燥，条件为：40-75℃，-0.1～-0.04Mpa；优选条件为65℃，-0.08～-0.06Mpa；
步骤B粉碎过筛为粉碎过65-100目筛；优选粉碎过80目筛；
步骤C所述辅料包括微晶纤维素、淀粉；
步骤C冬虫夏草粉的粒度为过65-100目筛；优选粉碎过80目筛；珍珠粉的粒度为过65-100目筛；优选粉碎过80目筛；辅料的粒度为过65-100目筛；优选粉碎过80目筛；步骤D制粒采用乙醇作为粘合剂；优选的，粘合剂采用50-70％乙醇溶液；优选采用60％乙醇溶液；
步骤D制粒采用10-30目制粒；优选18目制粒；
步骤D干燥温度为40-80℃；优选60℃；
步骤D整粒为10-20目整粒；优选16目整粒；
上述技术方案中，步骤E总混，所述润滑剂为硬脂酸镁。
9.权利要求1-4任一项所述的药物组合物在制备用于改善亚健康人群的睡眠，增强亚健康人群的机体免疫力的药物或保健品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述亚健康人群的表现为睡眠紊乱、焦躁易怒。
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