CN107156830A

CN107156830A - 一种增强免疫力的组合物、其制备方法和应用

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Publication number: CN107156830A
Application number: CN201710284636.7A
Authority: CN
Inventors: 龙祥; 刘菲; 杨文兵
Original assignee: Lijiang Long Kang Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Lijiang Long Kang Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2037-04-26
Also published as: CN107156830B

Abstract

本发明提供一种增强免疫力的组合物，所述组合物由铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物、以及药学上可接受的辅料制成。本发明采用铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物，按特定比例配伍，保留了全营养及功能成分，使生物利用度得以提高，保健功能协同，从而达到提高免疫力的技术效果。本发明的组合物安全、无毒，可长期服用。经动物功能试验证明，本发明的组合物具有增强免疫力的保健功能；经卫生学、稳定性、功效成分试验证实，本发明的组合物质量稳定、可控，剂型合理。

Description

一种增强免疫力的组合物、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医疗保健领域，具体地涉及一种增强免疫力的组合物、其制备方法和应用。

背景技术

从生物学上来讲，免疫力是指抵御疾病发生、发展的能力。免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。我们时常说，如果免疫力低下，就容易罹患疾病，中医则认为“正气存内，邪不可干”，所谓“正气”即为免疫能力。其实，中医更注重平衡，现代免疫学研究中经常引用“阴阳”的概念，以说明免疫分子之间相互制约平衡关系；某一方或一种免疫因子表达过多或不足，则打乱免疫平衡，造成机体损害与疾病发生。而中医认为健康的状态为“阴平阳秘”，而一方过于亢进，机体内部各系统之间紊乱，则导致疾病，所谓“亢则害，承乃制”。因此，免疫重在调节，中医重在调理，一个“调”字，均是强调使紊乱状态归于平衡。

免疫力低下的主要影响因素：1)年龄因素：人生有两个免疫能力低下的阶段，即儿童阶段和老年阶段。儿童的免疫系统尚未成熟，功能不健全，免疫力低下；而老年机体器官功能衰退、获得营养能力下降，再加之免疫器官逐渐萎缩衰退，导致免疫力下降，与此相对应，儿童和老人也是疾病高发的两个阶段。2)不良的生活方式和习惯：精神紧张、营养不良、缺乏运动或睡眠不足，滥用酒精和吸烟等，都可能抑制免疫系统，降低机体免疫力。3)其他因素：环境中的有毒物质、某些药物、放射治疗以及过量的抗生素也会抑制免疫系统。通过对导致免疫力低下的主要原因的分析，不难看出老年人及受社会因素和不良的生活方式影响而处于亚健康状态的人群是免疫力低下的主要易感人群。

免疫力低下是现代人普遍存在的一种亚健康状态，是多数感染类疾病的诱因，严重影响着人们的身体健康。截至2004年底，中国60岁以上老人有1.4亿，占全国总人口的近11％；65岁以上的老人为9680万，占全国总人口的7.6％。中国老年人口的数量比很多国家的总人口还要多得多。而且，从人口发展趋势来看，中国老龄化最高峰还没到来，大约在2030至2040年之间，那时老年人口将有可能占到全国总人口的25～28％。2012年国家人口计生委称，到2050年我国65岁以上老人将达到3.6亿，人口老龄化速度快、规模大，问题严重。据统计，美国每年有600万人被怀疑处于亚健康状态，年龄多在20～45岁之间，有14％的成年男性和20％的妇女表现有明显的疲劳，其中1/8发展为CFS(慢性疲劳综合征)。日本国立公共卫生院做的一次调查研究显示，在全国5000余名15～65岁人士中，表示真正感到“非常疲劳”的竟高达60％，其中因工作量大、家务重、精神紧张的占44％，还有36％说不出原因。据2002年4月8日“21世纪中国亚健康市场学术成果研讨会”提供的有关统计资料显示，我国约有15％的人是健康的，15％的人非健康，70％的人呈亚健康状态，亚健康人数超过9亿。

综上所述，免疫力低下人群的数量是相当庞大的，因此开发具有增强免疫力保健功能的产品是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强免疫力的组合物，其中所述组合物由铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物、以及任选的药学上可接受的辅料组成。

在本发明的组合物中，铁皮石斛冻干粉与黄芪提取物的重量份数之比优选为500∶50～100，更优选为500∶60～90，进一步优选为500∶70～80，最优选为500∶75。

根据本发明组合物的一个优选实施方案，所述组合物由重量份数之比为500∶75∶425的铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物、药学上可接受的辅料，再添加适量的润湿剂制成。

在本发明的组合物中，所述药学上可接受的辅料选自固体分散载体、异麦芽酮糖醇、三氯蔗糖、硬脂酸镁、微晶纤维素、预胶化淀粉或羧甲基纤维素钠中的一种或几种。

优选地，本发明的组合物通过将铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物、固体分散载体混合，经固体分散工艺制备而得。更优选地，所述固体分散载体选自PVP K30、PEG-6000、泊洛沙姆-188、右旋糖酐、山梨醇、去氧胆酸或乙基纤维素中的一种或多种。

进一步优选，铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物的总质量与固体分散载体的质量百分比为80～99％∶1～20％，优选为85～95％∶5～15％，进一步优选为90％∶10％。

可以在本发明的组合物中添加药学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、微丸剂等固体口服制剂。

在本发明所述的药学上可接受的辅料中，为了改善口感，可以选择异麦芽糖醇和三氯蔗糖作为甜味剂。异麦芽酮糖醇为无气味、白色、结晶状糖醇，不吸湿，甜味纯正，甜度为蔗糖的50～60％，有遮蔽苦味的作用，低热卡，热值仅为蔗糖的50％，热稳定性好，对酸、碱稳定，各种微生物很难利用，不致龋齿。异麦芽酮糖醇又称帕拉金糖醇，国外称益寿糖，是近年来国际上新兴的功能性食用糖醇，是一种理想的代糖品。三氯蔗糖是我国批准使用的甜味剂。其甜度约为蔗糖的600倍，甜味纯正，甜味特性与甜味质量和蔗糖十分相似。在一般食品加工和储存过程中都非常稳定，水溶性很好。GB2760规定三氯蔗糖的最大使用剂量为1.5g/kg。因此，选择异麦芽酮糖醇和三氯蔗糖为甜味剂。

本发明还提供一种如上所述的组合物在制备增强免疫力的产品例如具有提高免疫力功能的保健食品、功能性普通食品或特殊医学食品或特殊膳食食品中的用途。

本发明还提供一种增强免疫力的产品，其特征在于，所述产品包括如本发明所述的组合物。

铁皮石斛、黄芪均为传统提高免疫力的药食同源物质，本发明采用铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物，按特定比例配伍，保留了全营养及功能成分，使生物利用度得以提高，保健功能协同，从而达到提高免疫力技术效果。

本发明还提供一种制备本发明所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将干净新鲜的铁皮石斛切成小段，然后在-80℃～-70℃的温度下冷冻干燥至水分含量≤10％，得到冻干品；将冻干品超微粉碎至800～1000目，即得铁皮石斛冻干粉；

(2)将干黄芪粉碎，然后将得到的黄芪粉用体积百分比浓度为70～80％的乙醇水溶液渗漉，得到乙醇提取液；药渣用80℃～95℃的水提取，得到水提取液；将乙醇提取液和水提取液合并，浓缩、干燥得到黄芪提取物；

(3)将铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物以及任选的药学上可接受的辅料混合，得到所述组合物。

优选地，在本发明方法的步骤(2)中，所述水提取的条件为：料液比为按质量体积(kg/L)计1∶10，共提取三次，每次提取1.5～2小时。

优选地，在本发明方法的步骤(3)中，所述药学上可接受的辅料选自固体分散载体、异麦芽酮糖醇、三氯蔗糖、硬脂酸镁、微晶纤维素、预胶化淀粉或羧甲基纤维素钠中的一种或几种；更优选地，所述固体分散载体选自PVP K30、PEG-6000、泊洛沙姆-188、右旋糖酐、山梨醇、去氧胆酸、乙基纤维素中的一种或多种。

根据本发明的方法，步骤(3)的操作过程如下：用体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液溶解固体分散载体，然后加入铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物，充分研磨后蒸去溶剂，干燥即得。

根据本发明的方法，所述方法还包括将所述组合物制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或微丸剂的步骤。

本发明采用了冷冻干燥技术，确保铁皮石斛的营养、功能成分的最大限度地保留，采用超微破壁粉碎至800～1200目，可以改善营养及功能成分溶解性能，提高溶出速率，确保营养及功能成分充分暴露，从而达到提高生物利用度的目的。黄芪采用不同溶剂分层提取，可以针对黄芪中的氨基酸、皂苷、黄酮、多糖等成分的理化性质，确保全营养及功能成分的全面转移、保留；黄芪提取物可以发挥多组分、多靶点的协同作用，达到全面提高人体免疫力的目的。本发明通过将特定的铁皮石斛冻干粉与黄芪提取物按特定的比例制备成相应的组合物，可以显著增强人体免疫力。

本发明还使用了固体分散技术，与现有技术相比具有如下优势：(1)混合均匀、计量准确；(2)显著提高石斛、黄芪营养及功能成分稳定性和生物利用度；(3)掩盖黄芪提取物不良口感；(4)利于制剂成型。

本发明的保健食品以铁皮石斛和黄芪提取物为主要原料，这两种原料不在“十八反”、“十九畏”之列，无配伍禁忌。铁皮石斛自古以来就有“药中黄金”之美誉，民间称其为“救命仙草”。其味甘，性微寒。归胃、肾经。具有益胃生津，滋阴清热的功效。黄芪古代写作黄耆，李时珍在《本草纲目》中释其名曰：“耆，长也。黄耆色黄，为补药之长，故名。”其味甘，性微温。归肺、脾经。具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，形滞痛痹，托毒排脓，敛疮生肌的功效。两者配伍，相辅相成，达到扶正祛邪、增强免疫力之功效。

经保健食品安全性毒理学评价试验证实，本发明的组合物安全、无毒，可长期服用。经动物功能试验证明，本发明的组合物具有增强免疫力的保健功能；经卫生学、稳定性、功效成分试验证实，本发明的组合物质量稳定、可控，剂型合理。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。

实施例1

铁皮石斛冻干粉的制备

(1)选取新鲜铁皮石斛，除杂，切成小段，然后在冷冻器中、-80℃～-70℃的温度下冷冻干燥8～15小时，水分含量降至≦10％，得到冻干品；将冻干品超微粉碎，过800目筛，即得铁皮石斛冻干粉，备用。

实施例2

黄芪提取物的制备

将干黄芪粉碎，然后将黄芪粉用体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液渗漉，得到乙醇提取液；药渣用80℃的水提取，料液比(质量体积比，kg/L)为1∶10，共提取三次，每次提取1.5～2小时，得水提取液；将乙醇提取液和水提取液混合，在85℃～95℃的温度下减压浓缩、干燥得到黄芪提取物。

实施例3

铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物组合物的制备

(1)配料：按质量份数比500∶75分别称取铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物；按铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物总重量的10％称取固体分散载体PVP K30。

(2)混合：将铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物和固体分散载体混合均匀。

(3)固体分散：向步骤(2)所得的混合物中加入适量的润湿剂，使其分散完全，即得组合物。

实施例4

铁皮石斛咀嚼片的制备

片剂选择湿法制粒的工艺路线，主要工序包括粉碎、过筛、称量、混合、制软材、制粒、干燥、整粒、压片、内包装、外包装、检验入库等。

辅料种类及用量筛选

由于是咀嚼片，口感是筛选辅料时的一个重要因素。在本实施例中，选择异麦芽酮糖醇和三氯蔗糖为甜味剂。

在原料种类及用量已确定的基础上，铁皮石斛日服用2g，黄芪提取物日服用0.3g，通过对原料口感的判断及工艺的要求，设计片的规格的为1.0g/片，每天服用4片，则活性原料占配方总质量的比例为57.5％(其中铁皮石斛占50％，黄芪占7.5％)，辅料占42.5％(其中异麦芽酮糖醇：38.44％，三氯蔗糖：0.06％，聚维酮K30：3.0％，硬脂酸镁：1.0％)。本实施例以体积百分比浓度为50％的乙醇水溶液为润湿剂进行制粒，考察颗粒的成型性等指标，结果如下表1所示。

表1

结果显示，颗粒成型性较好，口感适宜，休止角符合要求，因此辅料用量定为异麦芽酮糖醇38.44％、三氯蔗糖0.06％，聚维酮K30 3.0％，硬脂酸镁1.0％，并以体积百分比浓度为50％的乙醇水溶液为润湿剂，制粒时将聚维酮K30、三氯蔗糖溶解于乙醇中，每100g混合粉加入体积百分比浓度为50％乙醇水溶液30ml。

三批中试数据见下表2。

表2

由中试数据可以看出，工艺切实可行；从成品率来看，工艺重现性较好。证明了工艺的稳定性，适合工业化大生产。

实施例5

铁皮石斛咀嚼片的免疫学实验

1.材料与方法

1.1样品

本实验设以实例1至4制备得到的铁皮石斛冻干粉，黄芪提取物，铁皮石斛黄芪组合物及铁皮石斛咀嚼片分设以下试验样品。

试验样品1：铁皮石斛、黄芪组合物

试验样品2：铁皮石斛咀嚼片

对照样品1：铁皮石斛冻干粉

对照样品2：黄芪提取物

本试验样品依据受试样品的人体推荐剂量为4.0g/人/日(以60kg体重计)，按人体推荐剂量的10倍每天给予小鼠0.67g/kg·bw/d的上述四个试验样品持续一个月，进行小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性测定。

1.2实验动物

选用SPF级CI/F1代健康雌性小鼠200只，体重为18.0～21.9g。

小鼠按体重随机分为I、II、III、IV、V五个大组，每大组40只小鼠，分成4个样品组，每个样品组10只。其中I组小鼠进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化、NK细胞活性试验；II组小鼠进行耳廓肿胀试验；III组小鼠进行抗体生成细胞检测和半数溶血值HC₅₀的测定；IV组小鼠进行小鼠碳廓清试验；V组小鼠进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。

试验动物在温度为20～25℃、相对湿度为40％～70％的屏障系统中饲养。

1.3受试物给予方式

受试样品用无菌水配制，每组样品的配制浓度都为67mg/mL，经口每日一次给予小鼠相应受试物，小鼠灌胃量为0.1mL/10g·bw。连续灌胃一个月后测定各项增强免疫力功能指标。

2.试验方法

2.1ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验——MTT法

各剂量组动物连续灌胃一个月后，颈推脱臼法处死动物，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，研磨脾脏，制成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1mLRPMI1640完全培养液中，台酚兰染色计数活细胞数(均在95％以上)，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3×l0⁶个/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(100μg/mL)，另一孔作为对照，置37℃、5％CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入96孔培养板中，每孔做三个平行孔，用酶标仪在波长570nm下测定各孔吸光度值。

淋巴细胞增殖能力＝加ConA的光密度值－不加ConA的光密度值

用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，如受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，则可判定该项试验结果为阳性。反之则反。

2.2DNFB诱导小鼠迟发型变态反应(DTH)——耳肿胀法

各剂量组动物连续灌胃一个月后，每鼠用剃毛机将腹部毛剃去，范围约3cm×3cm，用10mg/mL DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。5日后用10mg/mLDNFB溶液l0μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24h颈推脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm耳片，称重。

耳重差(mg)＝右耳重(mg)－左耳重(mg)

用左右耳重量之差表示DTH的程度。若受试样品组的重量差值显著高于对照组的重量差值，则可判定该项试验结果阳性。反之则反。

2.3抗体生成细胞检测——Jerne改良玻片法

各剂量组动物连续灌胃一个月后，每只鼠腹腔注射2％(v/v)的SRBC悬液0.2mL进行免疫，4d后小鼠颈推脱臼处死，取出脾脏，放在盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，研磨脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min，用Hank's液洗2遍，最后将细胞悬浮于5mL RPMI1640培养液中，计数细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×l0⁶个/mL。将表层培养基加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4两倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)50μL，20μL脾细胞悬液(5×l0⁶个/mL)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做两个平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入37℃、5％CO2培养箱中孵育1.5h，然后将制备好的补体1∶8稀释后加入到玻片架凹槽内，继续孵育1.5h后，计数溶血空斑数。

溶血空斑数＝溶血空斑计数×10

用空斑数/10⁶脾细胞来表示，如果受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，则可判定该项试验结果阳性。反之则反。

2.4血清溶血素测定——半数溶血值(HC₅₀)

各剂量组动物连续灌胃一个月后，制备2％(v/v)的SRBC悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫，4d后小鼠眼底静脉丛取血于离心管内，放置lh，2000r/min离心l0min，分离并收集血清。血清200倍稀释后，按检验方法测定样品管及SRBC半数溶血时的光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC₅₀)表示。

溶血素的量以半数溶血值(HC₅₀)表示，如果受试样品组的HC₅₀显著高于对照组的HC₅₀，则可判定该项试验结果阳性。反之则反。

2.5小鼠碳廓清试验

各剂量组动物连续灌胃一个月后，每鼠尾静脉注入4倍稀释的印度墨汁(0.1mL/10g·bw)，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2min及10min分别从眼内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中，用酶标仪在600nm波长处测光密度值，并取胸腺、肝、脾称重，利用光密度值、肝重和脾重计算吞噬指数a。另计算胸腺/体比、脾/体比。

以吞噬指数a表示小鼠碳廓清的能力。如果受试样品组的吞噬指数a显著高于对照组的吞噬指数a，则可判定该项试验结果阳性。反之则反。

2.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验——半体内法

各剂量组动物连续灌胃一个月后，制备20％(v/v)的鸡红细胞悬液，每只鼠腹腔注射1mL，间隔30min，颈推脱臼处死小鼠，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃恒温培养箱孵育30min，然后，于生理盐水中漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，封片，光镜下观察。

如果受试样品组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较，差异均有统计学意义，则可判定该项试验结果阳性。反之则反。

2.7NK细胞活性测定——乳酸脱氢酶测定法

各剂量组动物连续灌胃一个月后，颈推脱白处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank's液及8mL Hank's液，离心10min(1000r/min)，用含10％小牛血清RPMI1640完全培养液重悬，1％冰乙酸稀释后计数，台酚兰染色计数活细胞数(均在95％以上)，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×l0⁷个/mL。

试验前24h将靶细胞(YAC-1细胞)传代培养，应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×l0⁵个/mL。取YAC-1细胞和脾细胞各100μL(效靶比50∶1)加入U型96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100μL，YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和2.5％Triton各100μL，上述各项均设三个平行孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值。

如果受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，则可判定该项试验结果阳性。反之则反。

2.8试验数据统计：用SPSS10.0软件对各试验原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐要求的数据资料，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换所得的数据进行统计处理。

2.9结果判定：在细胞免疫功能(ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化，DNFB诱导小鼠DTH)、体液免疫功能(抗体生成细胞检测，血清溶血素测定)、单核-巨噬细胞功能(小鼠碳廓清，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞)、NK细胞活性四个方面只需任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。

3.结果

试验过程中动物饮水摄食正常，外观无异常。各试验样品小鼠的初始体重之间无显著差异。经灌胃饲养一月后，各个试验样品组小鼠的终末体重也无明显差异。

3.1受试品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

经口给予小鼠相同剂量的不同受试样品一个月后，用MTT法进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验，计算加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值，并对其进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表3结果可见，试验品与对照品比较，试验品加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值明显高于对照品，差异有统计学意义。试验样品1与试验样品2之间比较，加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值无明显差异。

表3

3.2受试品对DNFB诱导小鼠DTH的影响

经口给予小鼠同剂量的不同受试样品一个月后，用耳肿胀法进行DNFB诱导小鼠DTH实验，计算耳壳增重，并对其进行方差齐性检验，不满足方差齐性要求，用秩和检验进行统计处理。由表4结果可见，试验品耳壳增重高于对照品，差异有统计学意义。试验样品1与试验样品2之间比较，耳壳增重无显著差异。

表4

3.3受试品对小鼠抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响

经口给予小鼠同剂量的不同受试样品一个月后，用Jerne改良玻片法进行小鼠抗体生成细胞实验，计算溶血空斑数，并对其进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表5结果可见，试验品小鼠溶血空斑数高于对照品，差异有统计学意义。试验品1与试验品2比较，小鼠溶血空斑数无显著差异。

表5

3.4受试品对小鼠血清半数溶血值(HC₅₀)的影响

经口给予小鼠同剂量的不同受试样品一个月后，用半数溶血值法测定小鼠的血清半数溶血值(HC₅₀)，并对其进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表6结果可见，试验品小鼠血清半数溶血值(HC₅₀)明显高于对照品，差异有统计学意义(P<0.05)。试验品1与试验品2比较，小鼠血清半数溶血值无显著差异。

表6

3.5受试品对小鼠碳廓清能力的影响

经口给予小鼠同剂量的不同受试样品一个月后，进行小鼠碳廓清实验，计算吞噬指数a，并对其进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表7结果可见，试验品小鼠吞噬指数a与对照品比较，差异均无统计学意义。试验样品1与试验样品2比较，小鼠吞噬指数a无显著差异。

表7

3.6受试品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数的影响

经口给予小鼠同剂量的不同受试样品一个月后，用半体内法进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，计算吞噬指数及吞噬百分率，并将吞噬百分率经sin^-1P^1/2(P为吞噬百分率，用小数表示)转化后进行方差齐性检验，吞噬百分率和吞噬指数满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表8结果可见，试验品吞噬百分率及吞噬指数与对照品比较，差异均无统计学意义。试验品1与试验品2比较吞噬百分率及吞噬指数无显著差异。

表8

3.7受试品对小鼠NK细胞活性的影响

经口给予小鼠同剂量的不同受试品一个月后，用乳酸脱氢酶测定法进行小鼠NK细胞活性测定，将NK细胞活性经sin^-1P^1/2(P为NK细胞活性，用小数表示)转化后进行方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表9结果可见，试验品NK细胞活性高于对照品，差异有统计学意义。试验品1与试验品2比较无显著差异。

表9

通过以上试验研究，结果显示铁皮石斛咀嚼片及铁皮石斛、黄芪组合物具有以下功能优越性：

(1)细胞免疫功能：ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验中，试验品加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值高于对照品，差异有统计学意义(P<0.05)；DNFB诱导小鼠DTH试验中，试验品耳壳增重高于对照品，差异有统计学意义(P<0.05)。此项为阳性。

(2)体液免疫功能：抗体生成细胞检测试验中，试验品小鼠溶血空斑数高于对照品，差异有统计学意义(P<0.05)；小鼠血清半数溶血值试验中，试验品小鼠血清半数溶血值(HC₅₀)高于对照品，差异有统计学意义(P<0.05)。此项为阳性。

(3)单核-巨噬细胞功能：碳廓清试验中，试验品小鼠吞噬指数a与对照品比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；鸡红细胞吞噬试验中，试验品吞噬百分率及吞噬指数与对照品比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。此项为阴性。

(4)NK细胞活性：小鼠NK细胞活性测定试验中，试验品NK细胞活性高于对照品，差异有统计学意义(P<0.05)。此项为阳性。

根据《保健食品检验与评价技术规范》之增强免疫力功能试验的结果判定，在本试验条件下铁皮石斛、黄芪组合物及铁皮石斛咀嚼片具有比单纯的铁皮石斛冻干粉或黄芪提取物更好的增强免疫力功能。

(5)通过两个试验样品的数据对比可知，铁皮石斛、黄芪组合物与其制剂铁皮石斛咀嚼片在增强免疫力功能的作用上无明显差异。

Claims

1.一种增强免疫力的组合物，其中所述组合物由铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物，以及任选的药学上可接受的辅料组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述铁皮石斛冻干粉与黄芪提取物的重量份数之比为500∶50～100，优选为500∶60～90，进一步优选为500∶70～80，最优选为500∶75。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物由重量份数比为500∶75∶425的铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物、药学上可接受的辅料以及适量的润湿剂制成；优选地，所述药学上可接受的辅料选自固体分散载体、异麦芽酮糖醇、三氯蔗糖、硬脂酸镁、微晶纤维素或预胶化淀粉或羧甲基纤维素钠中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物通过将铁皮石斛冻干粉、黄芪提取物、固体分散载体混合，经固体分散工艺制备而得；优选地，所述固体分散载体选自PVP K30、PEG-6000、泊洛沙姆-188、右旋糖酐、山梨醇、去氧胆酸或乙基纤维素中的一种或多种；

优选地，铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物的总质量与固体分散载体的质量百分比为80～99％∶1～20％，优选为85～95％∶5～15％，进一步优选为90％∶10％。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为胶囊剂、片剂、颗粒剂或微丸剂。

6.一种制备如权利要求1至5中任一项所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将铁皮石斛切成小段，在-80℃～-70℃的温度下冷冻干燥至水分含量≤10％，得到冻干品；将冻干品超微粉碎至800～1000目，即得铁皮石斛冻干粉；

(2)将干黄芪粉碎，然后将黄芪粉用体积百分比浓度为70～80％的乙醇水溶液渗漉，得到乙醇提取液；药渣用80℃～95℃的水提取，得水提取液；将乙醇提取液和水提取液合并，浓缩，得到黄芪提取物；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述水提取的条件为：料液比为1∶10，共提取三次，每次提取1.5～2小时；

优选地，在步骤(3)中，所述药学上可接受的辅料选自固体分散载体、异麦芽酮糖醇、三氯蔗糖、硬脂酸镁、微晶纤维素、预胶化淀粉或羧甲基纤维素钠中的一种或几种；更优选地，所述固体分散载体选自PVP K30、PEG-6000、泊洛沙姆-188、右旋糖酐、山梨醇、去氧胆酸、乙基纤维素和气相微粉硅胶中的一种或多种。

更优选地，所述步骤(3)操作如下：用体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液溶解固体分散载体，然后加入铁皮石斛冻干粉和黄芪提取物，充分研磨后蒸去溶剂，干燥即得。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述组合物制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或微丸剂的步骤。

9.如权利要求1至5中任一项所述的组合物或如权利要求6至8中任一项所述的方法制备的组合物在制备增强免疫力的产品例如具有提高免疫力功能的保健食品、功能性普通食品、特殊医学食品或特殊膳食食品中的用途。

10.一种增强免疫力的产品，其特征在于，所述增强免疫力的产品包括如权利要求1至5中任一项所述的组合物或如权利要求6至8中任一项所述的方法制备的组合物。