CN108713746A - 一种药食同源组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药食同源组合物及其制备方法和应用,所述组合物主要由以下原料制成:杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草。所述组合物的制备方法包括以下步骤:将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草以半仿生提取技术提取、过滤、合并滤液、浓缩,然后制成液体制剂或者固体制剂,即得所述药食同源组合物。本发明还公开了所述组合物在制备增强免疫力、强肝、益肾或抗衰老药物、保健品或食品中的应用。
Description
技术领域
本发明属于保健品领域,具体涉及一种药食同源组合物及其制备方法和应用。
背景技术
中国药材部门将杜仲、七叶一支花、灵芝、熊胆列入四大紧缺专控药材。杜仲被《神农本草经》列为上品,是四大紧缺专控药材之一。市场上药品数量较少,经过查询,国产药品仅有60种;进口药品也只有72种,主要集中在香港、日本等。其原料为杜仲叶或杜仲皮,而杜仲雄花等被弃之不用,浪费珍惜的杜仲资源。科学研究发现:“杜仲雄花”特含60多种有效植物成分,如木质素类,环烯醚萜类、苯丙素类活性物质、松脂醇双糖甙、黄酮、生物碱、氨基酸、多糖以及矿质元素等,其中氨基酸含量达21.47%,钙的含量达0.92%,锌含量达51mg/100g,分别是杜仲叶的1.8倍和5.2倍。杜仲雄花有效成分最为全面,而且含量更高,具备植物杜仲所有的保健功效,而且对于“强肝、补肾、通便、安眠、降三高”的效果尤为显著。关于杜仲和杜仲雄花的的临床数据、动物实验等研究资料已经成熟,为产品的开发提供了坚实的理论基础。
国家卫生计生委公告(2014年第6号)批准杜仲雄花为新食品原料,杜仲雄花在功能性食品上的开发利用提供了依据。调研发现,用到杜仲雄花的商品还处于初级阶段,主要是销售原料和杜仲雄花的代用茶,为市场低端产品,服用后吸收利用度低。
发明内容
本发明的第一个目的是为了解决现有技术中存在的上述问题,提供一种药食同源组合物。
本发明的第二个目的是提供所述药食同源组合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述药食同源组合物制成的制剂。
本发明的第四个目的是提供所述制剂的制备方法。
本发明的最后一个目的是提供所述的药食同源组合物,以及其制成的制剂的应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种药食同源组合物,其主要由以下原料制成:杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草。
所述的药食同源组合物,其主要由以下重量份的原料制成:
杜仲雄花20~50份、茯苓20~40份、人参15~25份、玉竹5~10份、桑叶5~10份、枸杞子5~10份、山药5~10份、薏苡仁5~10份、乌梅5~10份、甘草5~10份。
优选地,所述的药食同源组合物,其主要由以下重量份的原料制成:
杜仲雄花25~50份、茯苓20~30份、人参20~25份、玉竹6~8份、桑叶6~8份、枸杞子8~10份、山药8~10份、薏苡仁8~10份、乌梅8~10份、甘草8~10份。
本发明所述药食同源组合物的制备方法,包括以下步骤:
药食同源组合物将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草以半仿生提取技术提取、过滤、合并滤液、浓缩,然后制成液体制剂或者固体制剂,即得所述药食同源组合物。
优选地,所述药食同源组合物的制备方法,包括以下步骤:
将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草粉碎成粗粉,混合均匀,得到粗粉混合物,加入6~10倍水浸润,加入纤维素酶,保温37±5℃1~1.5小时:
第一次回流提取:调节粗粉混合液pH为3.0,加热回流提取1~2小时,得到第一提取液,过滤,得到第一滤液和第一滤渣;
第二次回流提取时,往第一滤渣中加入6~10倍于第一滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第二提取液,过滤,得到第二滤液和第二滤渣;
第三次回流提取时,往第二滤渣中加入8~12倍于第二滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第三提取液,过滤,得到第三滤液和第三滤渣;
合并第一滤液、第二滤液和第三滤液,调节pH至中性,得到混合物提取液;
将混合物提取液加热浓缩,然后制成液体制剂或者固体制剂,即得所述药食同源组合物。
本发明所述药食同源组合物制成的制剂,所述制剂包括膏剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂,优选为膏剂。
所述膏剂(可称之为“药食同源膏方”)主要由以下重量份的原料制成:杜仲雄花20~50份、茯苓20~40份、人参15~25份、玉竹5~10份、桑叶5~10份、枸杞子5~10份、山药5~10份、薏苡仁5~10份、乌梅5~10份、甘草5~10份、低聚异麦芽糖150~200份、低聚木糖5~10份。
优选地,所述的膏剂主要由以下重量份的原料制成:
杜仲雄花25~50份、茯苓20~30份、人参20~25份、玉竹6~8份、桑叶6~8份、枸杞子8~10份、山药8~10份、薏苡仁8~10份、乌梅8~10份、甘草8~10份、低聚异麦芽糖190~200份、低聚木糖5~6份。
所述的膏剂是以杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草为原料,添加低聚异麦芽糖、低聚木糖,经称量、提取、过滤、浓缩、配料、罐装、包装等工艺制成。
优选地,所述膏剂的制备方法包括以下步骤:
将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草粉碎成粗粉,混合均匀,得到粗粉混合物,加入6~10倍水浸润,加入纤维素酶,保温37±5℃1~1.5小时:
第一次回流提取:调节粗粉混合液pH为3.0,加热回流提取1~2小时,得到第一提取液,过滤,得到第一滤液和第一滤渣;
第二次回流提取时,往第一滤渣中加入6~10倍于第一滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第二提取液,过滤,得到第二滤液和第二滤渣;
第三次回流提取时,往第二滤渣中加入8~12倍于第二滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第三提取液,过滤,得到第三滤液和第三滤渣;
合并第一滤液、第二滤液和第三滤液,调节pH至中性,得到混合物提取液;
将混合物提取液加热浓缩至稠厚状,即得“清膏”,将所述重量份数低聚异麦芽糖和低聚木糖加入清膏中,充分搅匀,继续加热,当药膏浓缩至“挂丝”或“滴水成珠”时,即可。
本发明所述药食同源组合物在制备增强免疫力、强肝、益肾或抗衰老药物、保健品或食品中的应用。
本发明所述的制剂在制备增强免疫力、强肝、益肾或抗衰老药物、保健品或食品中的应用。
杜仲雄花:《本草纲目》记载:杜仲色紫而润,味甘微辛,其气温平,甘温能补,微辛能润,故能入肝而补肾。《神农本草经》谓其“主治腰膝痛,补中,益精气,坚筋骨,除阴下痒湿,小便余沥。久服,轻身耐老。”近年来研究发现,杜仲雄花与叶、皮含有类似的有效成分,均富含总黄酮、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、氨基酸等;具有相似的药理作用。杜仲在提高机体免疫功效上可能是多种功效成分协同作用的效果。而杜仲雄花功效成分比杜仲皮、杜仲叶都高,所以在抗疲劳功效上更突出。
茯苓:为药食同源。《中国药典》:利水渗湿,健脾,宁心。用于水肿尿少,痰饮眩悸,脾虚食少,便溏泄泻,心神不安,惊悸失眠。茯苓多糖具有抗肿瘤、保肝、利尿、抗衰老、抗炎、降血脂、增强免疫、催眠等作用,茯苓三萜具有抗肿瘤、保肝、抗衰老、抗炎、增强免疫等作用。
人参:为新资源食品。《中国药典》记载“人参大补元气,复脉固脱,补脾益肺,生津养血,安神益智”。有研究发现人参主要活性成分为人参皂苷和人参多糖。发现人参的抗肿瘤作用及机制较为广泛:可影响和调节免疫功能,增强机体对疾病的抵抗能力,从而抑制肿瘤的生长。
玉竹:为药食同源。功能主治:养阴润燥,生津止渴。用于肺胃阴伤,燥热咳嗽,咽干口渴,内热消渴。现代研究表明玉竹具有清除自由基、提高免疫力、增强记忆力等作用。
桑叶:为药食同源。功能主治:疏散风热,清肺润燥,清肝明目。用于风热感冒,肺热燥咳,头晕头痛,目赤昏花。桑叶含有黄酮类、生物碱类、多糖类、植物甾醇类、挥发油类、氨基酸、维生素及微量元素等多种活性化学成分,以及桑叶具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗丝虫、抗溃疡等多方面药理作用。
枸杞:为药食同源。《本草纲目》记载“枸杞子甘平而润,性滋而补,能补肾、润肺、生精、益气,此乃平补之药”,枸杞子的主要功能成分为枸杞多糖,研究表明枸杞多糖具有促进造血、降血脂、保肝、抗癌等作用。
山药:为药食同源,补脾养胃,生津益肺,补肾涩精。用于脾虚食少,久泻不止,肺虚喘咳,肾虚遗精,带下,尿频,虚热消渴。山药富含多糖、皂甙、尿囊素等生物活性成分,具有抗氧化、抗衰老、抗突变、抑肿瘤、免疫调节等功效,对脾虚久泻、肺虚咳喘、糖尿病、心脑血管疾病等具有独特的疗效。
薏苡仁:为药食同源。功能主治:利水渗湿,健脾止泻,除痹,排脓,解毒散结。用于水肿,脚气,小便不利,脾虚泄泻,湿痹拘挛,肺痈,肠痈,赘疣,癌肿。薏苡仁其抗肿瘤作用是多方面的综合作用,包括直接的抑瘤作用,抑制肿瘤血管生成,以及免疫调节作用等。薏苡仁中含有较多的多糖,其多糖已被证实具有降血糖、提高免疫力等作用。
乌梅:为药食同源。具有敛肺,涩肠,生津,安蛔作用。用于肺虚久咳,久泻久痢,虚热消渴,蛔厥呕吐腹痛。研究表明乌梅、乌梅炭、乌梅肉等对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌有不同程度的抑菌作用;乌梅可治疗过氧化损伤,保护肝功能。
甘草:为药食同源。可以补脾益气,淸热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药。用于脾胃虚弱,倦怠乏力,心悸气短,咳嗽痰多,脘腹、四肢挛急疼痛,痈肿疮毒,缓解药物毒性、烈性。甘草及其活性成分能提高吞噬细胞的吞噬功能、调节淋巴细胞数量与功能、抑制IgE抗体形成、抗炎症介质及前炎性细胞因子,具有抗炎、抗变态反应的药理活性。甘草黄酮类化合物(异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草查耳酮A、光甘草定、甘草醇等)、甘草多糖和甘草酸是其抗炎、抗变应性炎症的活性成分。
低聚异麦芽糖:为普通食品。可以调整肠内菌群比例、提高益生菌比例,减少粪便中有害发酵产物。有研究表明低聚异麦芽糖显著促进小鼠肠道双歧杆菌的增殖,对大肠杆菌具有明显抑制作用,对肠道菌群代谢产物乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸含量及构成具有显著调节作用
低聚木糖:为新食品原料。《食品原料手册》:调节胃肠功能;不龋齿,不被龋齿菌利用;促进钙的吸收。低聚木糖具有润肠通便的功能,可有效改善大便的水分含量,使之保持在80%左右,并且有双向调节功能,可以使泻痢或便秘状态得到缓解,成为正常便。日本Suntory公司的研究发现29位便秘的怀孕妇女每天给予4g低聚木糖,连续四周,其通便频率增加,且有一半以上妇女肠道可正常蠕动。
本发明中参照中药方剂配伍原则君臣佐使进行处方研究——杜仲雄花具备药材杜仲的所有保健功效,杜仲性甘,温,归肝、肾经,具有补中、益精气的效果;茯苓味甘、淡、性平,归心、肺、脾、肾经,其性上行,可生津液,开腠理,滋水源而下降,利小便;人参味甘,微寒,入脾、胃、肺三经,主五脏气不足,具有补气、安神的效果。综合上述三味药材效果,杜仲雄花主肝肾、人参主心肺脾胃、茯苓协同生津液,同时滋养五脏之气血,增强机体免疫,此为君药、臣药,行温补之效。玉竹、桑叶可养阴润燥、疏散风热,可解人参之燥性;山药可生精益肺、补肾涩精,薏苡仁可利水渗湿,健脾止泻,两者对于脾虚泄泻、解毒抗癌均有很好的功效。此三味为佐药,玉竹、桑叶用以制约君、臣药之燥性,山药、薏苡仁协同增效,同时对于免疫力底下的虚症也具有很好的效果。枸杞、乌梅、甘草为使药,具有一定的滋补效果,同时调节配方中各药材药性,调节产品口感。通过对中医理论的深入研究,合理组合配方后的产品可以有效增强机体免疫力,优于市场上单纯补充单一成分或者多种药材简单组合而成的功能产品,开发成为真正具有中医药理论支持的优秀的药食同源功能产品。
有益效果:本发明具有以下优点:
本发明以新食品原料杜仲雄花作为主要原料,市场上此类产品较少,本发明有助于填补市场空白,对于杜仲稀缺资源也可以起到一定的保护作用。同时,本发明中配方是依据传统方剂理论君臣佐使以及现代药理研究成果进行组合研究,以药食同源的中药材作为原料,在我国具有多年食用历史,其安全性、功能性市场认可度高。同时进行合理组方,优于市场上单纯补充单一成分或者多种药材简单组合而成的功能产品,具有很好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施实例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为膏剂,其原料按重量份数计,包括:
杜仲雄花25份、茯苓20份、人参20份、玉竹8份、桑叶8份、枸杞子8份、山药8份、薏苡仁8份、乌梅8份、甘草8份、低聚异麦芽糖190份、低聚木糖5份。
其制备方法包括:
将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草粉碎成粗粉,混合均匀,得到粗粉混合物,加入8倍纯化水浸润,加入混合纤维素酶,保温37±5℃1.5小时:
第一次回流提取:调节粗粉混合液pH为3.0,加热回流提取1.5小时,得到第一提取液,过滤,得到第一滤液和第一滤渣;
第二次回流提取时,往第一滤渣中加入8倍于第一滤渣重量的纯化水,调节pH为7.2,加热回流提取2小时,得到第二提取液,过滤,得到第二滤液和第二滤渣;
第三次回流提取时,往第二滤渣中加入10倍于第二滤渣重量的纯化水,调节pH为7.2,加热回流提取2小时,得到第三提取液,过滤,得到第三滤液和第三滤渣;
合并第一滤液、第二滤液和第三滤液,调节pH至中性,得到混合物提取液;
将混合物提取液放入清洁的锅内,加热浓缩至稠厚状,即得“清膏”。将所述重量份数低聚异麦芽糖和低聚木糖加入清膏中,充分搅匀。继续加热,当药膏浓缩至“挂丝”或“滴水成珠”时,即得。
将膏滋用玻璃瓶罐装,封口严密,包装牢固。
实施例2
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为膏剂,其原料按重量份数计,包括:杜仲雄花50份、茯苓30份、人参20份、玉竹6份、桑叶6份、枸杞子8份、山药10份、薏苡仁10份、乌梅10份、甘草10份、低聚异麦芽糖200份、低聚木糖6份。
其制备方法包括:
将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草粉碎成粗粉,混合均匀,得到粗粉混合物,加入6倍纯化水浸润,加入混合纤维素酶,保温37±5℃1小时:
第一次回流提取:调节粗粉混合液pH为3.0,加热回流提取2小时,得到第一提取液,过滤,得到第一滤液和第一滤渣;
第二次回流提取时,往第一滤渣中加入10倍于第一滤渣重量的纯化水,调节pH为7.2,加热回流提取2.5小时,得到第二提取液,过滤,得到第二滤液和第二滤渣;
第三次回流提取时,往第二滤渣中加入12倍于第二滤渣重量的纯化水,调节pH为7.2,加热回流提取2.5小时,得到第三提取液,过滤,得到第三滤液和第三滤渣;
合并第一滤液、第二滤液和第三滤液,调节pH至中性,得到混合物提取液;
将混合物提取液放入清洁的锅内,加热浓缩至稠厚状,即得“清膏”。将所述重量份数低聚异麦芽糖和低聚木糖加入清膏中,充分搅匀。继续加热,当药膏浓缩至“挂丝”或“滴水成珠”时,即得。
将膏滋用玻璃瓶罐装,封口严密,包装牢固。
实施例3
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为膏剂,其原料按重量份数计,包括:
杜仲雄花30份、茯苓20份、人参25份、玉竹6份、桑叶8份、枸杞子8份、山药10份、薏苡仁10份、乌梅10份、甘草10份、低聚异麦芽糖190份、低聚木糖6份。
其制备方法包括:
将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草粉碎成粗粉,混合均匀,得到粗粉混合物,加入10倍纯化水浸润,加入混合纤维素酶,保温37±5℃1.2小时:
第一次回流提取:调节粗粉混合液pH为3.0,加热回流提取1小时,得到第一提取液,过滤,得到第一滤液和第一滤渣;
第二次回流提取时,往第一滤渣中加入6倍于第一滤渣重量的纯化水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5小时,得到第二提取液,过滤,得到第二滤液和第二滤渣;
第三次回流提取时,往第二滤渣中加入8倍于第二滤渣重量的纯化水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5小时,得到第三提取液,过滤,得到第三滤液和第三滤渣;
合并第一滤液、第二滤液和第三滤液,调节pH至中性,得到混合物提取液;
将混合物提取液加热浓缩至稠厚状,即得“清膏”,将所述重量份数低聚异麦芽糖和低聚木糖加入清膏中,充分搅匀,继续加热,当药膏浓缩至“挂丝”或“滴水成珠”时,即得。
将膏滋用玻璃瓶罐装,封口严密,包装牢固。实施例4
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为膏剂,其原料按重量份数计,包括:
杜仲雄花40份、茯苓30份、人参25份、玉竹8份、桑叶6份、枸杞子10份、山药8份、薏苡仁8份、乌梅8份、甘草10份、低聚异麦芽糖200份、低聚木糖5份。
制备方法同实施例1。
实施例5
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为片剂,其活性组分按重量份数计,包括:
杜仲雄花20份、茯苓20份、人参15份、玉竹5份、桑叶5、枸杞子5份、山药5份、薏苡仁5份、乌梅5份、甘草5份。
制备方法同实施例1,区别在于:将混合物提取液浓缩后得到的清膏中加入药用辅料,按照常规制备工艺制备得到片剂。
实施例6
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为胶囊剂,其活性组分按重量份数计,包括:
杜仲雄花50份、茯苓40份、人参25份、玉竹10份、桑叶10份、枸杞子10份、山药10份、薏苡仁10份、乌梅10份、甘草10份。
制备方法同实施例2,区别在于:将混合物提取液浓缩后得到的清膏中加入药用辅料,按照常规制备工艺制备得到胶囊剂。
实施例7
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为颗粒剂,其活性组分按重量份数计,包括:
杜仲雄花25份、茯苓20份、人参20份、玉竹6份、桑叶6份、枸杞子8份、山药8份、薏苡仁8份、乌梅8份、甘草8份。
制备方法同实施例3,区别在于:将混合物提取液浓缩后得到的清膏中加入药用辅料,按照常规制备工艺制备得到颗粒剂。
实施例8
本实施例提供了一种药食同源的组合物的制剂,该制剂为口服液,其活性组分按重量份数计,包括:
杜仲雄花50份、茯苓30份、人参25份、玉竹8份、桑叶8份、枸杞子10份、山药10份、薏苡仁10份、乌梅10份、甘草10份。
制备方法同实施例1,区别在于:将混合物提取液中加入药用辅料,按照常规制备工艺制备得到口服液。
实施例9本发明组合增强免疫力的试验研究
1.材料和方法
1.1实验动物及分组
选用北京维通利华实验动物技术有限公司提供的SPF级ICR健康雌性小鼠200只,体重为18.0~21.9g。小鼠按体重随机分为I,II,III,IV,V五个大组,每大组40只小鼠,分成4个剂量组,每个剂量组10只,其中I组小鼠进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化,NK细胞活性试验;II组小鼠进行耳廓肿胀试验;III组小鼠进行抗体生成细胞检测和半数溶血值HC50的测定;IV组小鼠进行小鼠碳廓清试验;V组小鼠进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。
1.2剂量
以实施例1所制得制剂为受试样品,设计低、中、高三个剂量组,分别相当于受试样品人体摄入量的5倍、10倍、30倍,即208.3mg/kg·bw/d、416.7mg/kg·bw/d、1250mg/kg·bw/d,另设对照组(0mg/kg·bw/d,以无菌水代替)。受试样品以无菌水配制,低、中、高剂量组配制浓度分别为20.83mg/ml、41.67mg/ml、125.0mg/ml,经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物,小鼠灌胃量为0.1ml/10g·bw。连续灌胃30d后测定各项增强免疫力功能指标。
1.3试验方法
1.3.1 ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验—MTT法:
各剂量组连续灌胃30d后,颈椎脱臼法处死小鼠,无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中,研磨脾脏,制成单个细胞悬液,经200目筛网过滤,用Hank’s液洗2次,每次以1000r/min离心10min,然后将细胞悬浮于1mlRPMI1640完全培养液中,台盼蓝染色计数活细胞数(均在95%以上),用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3×106个/ml。将细胞悬液加入24孔培养板中,每样2孔,每孔1ml,一孔加75μl ConA液(100μg/ml),另一不加ConA液,置5%CO2,37℃CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h,每孔吸去上清0.7ml,加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT溶液(5mg/ml)50μl/孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1ml酸性异丙酮,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔分装3孔(200μl/孔)作为平行样,用酶标仪以570nm波长测定光密度值。
细胞增殖能力=加ConA的光密度值-不加ConA的光密度值-
用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。
1.3.2二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应(DTH)—耳肿胀法
各剂量组连续灌胃30d后,用剃毛机将小鼠腹部毛剃去,范围约3cm×3cm,取1%二硝基氟苯(DNFB)丙酮麻油溶液50μl涂抹致敏。5d后,小鼠右耳(两面)均匀涂抹1%DNFB丙酮麻油溶液20μl进行攻击,攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右耳壳,于同一部位取直径8mm的耳片称重,左右耳片重量之差作为肿胀度。
耳重差(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg)
1.3.3抗体生成细胞检测—Jerne改良玻片法
各剂量组连续灌胃30d后,每只小鼠腹腔注射2%(v/v)的SRBC悬液0.2ml进行免疫。免疫4d后,将小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏,放在盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中,研磨脾脏,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,离心1000r/min 10min,用Hank’s液洗2次,然后将细胞悬浮于5mlRPMI1640培养液中,计数细胞数,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/ml。将表层培养基加热溶解后,放45℃水浴保温,与等量Ph7.2~7.4两倍浓度的Hank’s液混合,分装小试管,每管0.5ml,再向管内加10%SRBC(v/v,用SA缓冲液配制)50μl,20μl脾细胞悬液(5×106个/ml),迅速混匀,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,做二个平行片,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h,然后将制备好的补体1:8稀释后加入到玻片架凹槽内,继续孵育1.5h后,计数溶血空斑数。结果用空斑数/106脾细胞数来表示。
溶血空斑数=溶血空斑计数×10
1.3.4血清溶血素测定—半数溶血值(HC50)测定法
各剂量组连续灌胃30d后,每鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC悬液0.2ml进行免疫。免疫4d后,小鼠摘眼球采血于离心管内,室温放置1h,2000r/min离心10min,分离并收集血清,将血清200倍稀释后,按检验方法测定样品管及SRBC半数管溶血时的光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示。
1.3.5小鼠碳廓清试验
各剂量组连续灌胃30d后,小鼠每10g体重尾静脉注射稀释3倍的印度墨汁0.1ml,注入后立即计时,并分别于2、10min从内眦静脉丛取血20μl,加到2ml 0.1%碳酸钠中,测OD600nm。处死小鼠,并取胸腺、肝脏、脾脏称重,根据光密度值、肝重和脾重计算吞噬指数a。另计算胸腺/体比、脾/体比。以吞噬指数表示小鼠碳廓请的能力。
1.3.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验—半体内法
各剂量组连续灌胃30d后,每只小鼠腹腔注射1ml20%(v/v)的鸡红细胞悬液,30min后,颈椎脱臼处死小鼠,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2ml,转动鼠板1min,然后吸出腹腔洗液1ml,平均分滴于2片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,移至37℃恒温培养箱孵育30min后,于生理盐水中漂洗,晾干,并以1:1丙酮甲醇溶液固定,4%(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min,再用蒸馏水漂洗晾干,封片,光镜下观察并计数。
1.3.7NK细胞活性测定—乳酸脱氢酶(LDH)测定法
各剂量组连续灌胃30d后,颈椎脱臼处死小鼠,无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中,研磨脾脏,制成单细胞悬液,经200目筛网过滤,用Hank’s液洗2次,每次以1000r/min离心10min,弃上清将细胞浆弹起,加入0.5ml无菌水20秒,裂解红细胞后再加入0.5ml2倍Hank’s液及8ml Hank’s液,1000r/min离心10min,用含10%小牛血清RPMI1640完全培养液重悬,1%冰乙酸稀释后计数,台盼蓝染色计数活细胞数(均在95%以上),用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/ml。
试验前24h将靶细胞(YAC-1细胞)传代培养,使用前以Hank’s液洗3次,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。取YAC-1细胞和脾细胞各100μl加入U型96孔培养板中,YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100μl,YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和2.5%Triton各100μl,上述各项均设三个平行孔,于37℃、5%CO2培养箱中培养4h,然后将96孔培养板以1500r/min离心5min,每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液100μl,反应10min,每孔加入1mol/L的HCl 30μl,在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。按下式计算NK细胞活性:
2.实验结果
2.1结果判定
在细胞免疫功能(ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化,DNFB诱导小鼠DTH)、体液免疫功能(抗体生成细胞检测,血清溶血素测定)、单核-巨噬细胞功能(小鼠碳廓请、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞)、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性,可判定该受试样品具有增强免疫力的作用。
2.2样品对试验前后动物体重的影响
低、中、高剂量组小鼠的初始体重与对照组比较,差异无统计学意义,表明小鼠的初始体重在各组间较为均衡。
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d后,将个剂量组终末体重及体重增长值进行方差齐性检验,满足方差齐要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。结果显示低、中、高剂量组终末体重及体重增长值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
表1对小鼠体重的影响(均值±标准差)
2.3样品对小鼠胸腺、脾脏器官的影响
经口给予小鼠不同计量的受试样品30d后,取小鼠的胸腺和脾脏称重,计算脏体比,并对脏体比进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表可见,低、中、高计量组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
表2样品对小鼠胸腺、脾脏器官的影响(均值±标准差)
2.4样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d后,用MTT法进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验,计算加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值,并对其进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表结果可见,低、中、高剂量组加加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)
表3样品对小鼠脾淋巴细胞转化的影响(均值±标准差)
2.5样品对DNFB诱导小鼠DTH的影响
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d,用耳肿胀法进行DNFB诱导小鼠DTH实验,计算耳壳增重,并对其进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表结果可见中、高剂量组耳壳增重与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
表3样品对DNFB诱导小鼠DTH的影响(均值±标准差)
2.6样品对小鼠抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d,用Jeme改良玻片法进行小鼠抗体生成细胞实验,计算溶血空斑数,并对其进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表结果可见低、中、高剂量组溶血空斑数与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
表5样品对小鼠溶血空斑数的影响(均值±标准差)
2.7样品对小鼠血清半数溶血值(HC50)的影响
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d,用半数溶血值法测定小鼠的血清半数溶血值(HC50),并对其进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表结果可见低、中、高剂量组小鼠血清半数溶血值(HC50)与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
表6样品对小鼠的HC50影响(均值±标准差)
2.8样品对小鼠碳廓清能力的影响
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d,进行小鼠碳廓清实验,计算吞噬指数a,并对其进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表结果可见低、中、高剂量组小鼠吞噬指数a与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
表7样品对小鼠碳廓清能力的影响(均值±标准差)
2.9样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数的影响
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d,用半体内法进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验,计算吞噬指数及吞噬百分率,并将吞噬百分率sin-1P1/2(P为吞噬百分率,用小数表示)转化后进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表结果可见低、中、高剂量组吞噬百分率及吞噬指数与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
表8样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数
的影响(均值±标准差)
2.10样品对小鼠NK细胞活性的影响
经口给予小鼠不同剂量的受试样品30d,用乳酸脱氢酶测定法进行小鼠NK细胞活性测定,将NK细胞活性经sin-1P1/2(P为NK细胞活性,用小数表示)转化后进行方差齐性检验,不满足方差齐性要求,用非参数检验分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由下表结果可见低、中、高剂量组NK细胞活性与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
表9样品对小鼠NK细胞活性的影响(均值±标准差)
3、小结:
经口给予小鼠不同剂量的组合物30d,对小鼠体重增长、胸腺/体比值、脾/体比值均无影响。细胞免疫功能实验中ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验为阳性;DNFB诱导小鼠DTH实验为阳性。体液免疫功能实验中抗体生成细胞检测实验为阴性;血清溶血素测定实验为阳性。单核-巨噬细胞吞噬功能实验中小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验为阴性,小鼠碳粒廓清实验为阴性。NK细胞活性测定实验为阳性。
综上所述,根据保健食品增强免疫力功能评价标准,本发明制备的组合物膏剂具有增强免疫力的功能。
Claims (9)
1.一种药食同源组合物,其特征在于,其主要由以下原料制成:
杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草。
2.根据权利要求1所述的药食同源组合物,其特征在于,其主要由以下重量份的原料制成:
杜仲雄花20~50份、茯苓20~40份、人参15~25份、玉竹5~10份、桑叶5~10份、枸杞子5~10份、山药5~10份、薏苡仁5~10份、乌梅5~10份、甘草5~10份。
3.权利要求1或2所述药食同源组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草以半仿生提取技术提取、过滤、合并滤液、浓缩,然后制成液体制剂或者固体制剂,即得所述药食同源组合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草粉碎成粗粉,混合均匀,得到粗粉混合物,加入6~10倍水浸润,加入纤维素酶,保温37±5℃1~1.5小时:
第一次回流提取:调节粗粉混合液pH为3.0,加热回流提取1~2小时,得到第一提取液,过滤,得到第一滤液和第一滤渣;
第二次回流提取时,往第一滤渣中加入6~10倍于第一滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第二提取液,过滤,得到第二滤液和第二滤渣;
第三次回流提取时,往第二滤渣中加入8~12倍于第二滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第三提取液,过滤,得到第三滤液和第三滤渣;
合并第一滤液、第二滤液和第三滤液,调节pH至中性,得到混合物提取液;
将混合物提取液加热浓缩,然后制成液体制剂或者固体制剂,即得所述药食同源组合物药食同源组合物。
5.权利要求1或2所述药食同源组合物制成的制剂,其特征在于,所述制剂包括膏剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂。
6.根据权利要求5所述的制剂,其特征在于,所述膏剂主要由以下重量份的原料制成:杜仲雄花20~50份、茯苓20~40份、人参15~25份、玉竹5~10份、桑叶5~10份、枸杞子5~10份、山药5~10份、薏苡仁5~10份、乌梅5~10份、甘草5~10份、低聚异麦芽糖150~200份、低聚木糖5~10份。
7.权利要求6所述制剂的制备方法,其特征在于,所述膏剂的制备方法包括以下步骤:将杜仲雄花、茯苓、人参、玉竹、桑叶、枸杞子、山药、薏苡仁、乌梅、甘草粉碎成粗粉,混合均匀,得到粗粉混合物,加入6~10倍水浸润,加入纤维素酶,保温37±5℃1~1.5小时:
第一次回流提取:调节粗粉混合液pH为3.0,加热回流提取1~2小时,得到第一提取液,过滤,得到第一滤液和第一滤渣;
第二次回流提取时,往第一滤渣中加入6~10倍于第一滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第二提取液,过滤,得到第二滤液和第二滤渣;
第三次回流提取时,往第二滤渣中加入8~12倍于第二滤渣重量的水,调节pH为7.2,加热回流提取1.5~2.5小时,得到第三提取液,过滤,得到第三滤液和第三滤渣;
合并第一滤液、第二滤液和第三滤液,调节pH至中性,得到混合物提取液;
将混合物提取液加热浓缩,浓缩,浓缩至稠厚状时添加低聚异麦芽糖和低聚木糖,继续浓缩,当浓缩至“挂丝”或“滴水成珠”时,即得。
8.权利要求1或2所述药食同源组合物在制备增强免疫力、强肝、益肾或抗衰老药物、保健品或食品中的应用。
9.权利要求6所述的制剂在制备增强免疫力、强肝、益肾或抗衰老药物、保健品或食品中的应用。
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