CN104771595B - 一种增强免疫力的中药组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种增强免疫力的中药组合物,按重量份数计,原料组分如下:鲜铁皮石斛8~12份,黄芪1~2份,女贞子1~2份,西洋参1~2份。一种增强免疫力的中药组合物的制备方法,包括如下步骤:原料称取、铁皮石斛鲜条的处理、西洋参的处理、醇提、水提、干燥粉碎以及配方共七个步骤。本发明由四味药食同源的补益类药材组成,拥有滋阴补益、益胃生津之功效,具有抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力等多种生物活性,共起滋阴补益,培元固本之功效,对人体免疫力具有良好的增强作用。
Description
技术领域
本发明涉及食品保健领域,具体而言,涉及一种增强免疫力的中药组合物及其制备方法。
背景技术
现代人由于文化、娱乐生活的不断丰富,看电视到深夜、晚上娱乐过久、晚上电脑使用时间太长等,长期休息不足,可致阴虚;爱吃麻辣、烧烤、口味大,经常大鱼大肉、膏粱厚味、醺酒、长期喝水不及时,忍着不喝水、少喝水等可致阴虚;工作、生活压力大,不能够排解,过于辛劳,长期盗汗、失眠者,可致阴虚;久病不愈,或者发热发烧大病之后,很多阴虚。我国已经进入老年化社会,人到老年之所以衰老,原因是机体出现了气血虚衰,精神耗损,肾阴不足,肝火上亢,毒素积蓄,经络不通等生理状态,是衰老的原因,老年人群里更是多有阴虚……
那些经常感觉潮热、盗汗、五心(心口、手心、脚心)烦热、口舌干燥、脉细数、口渴、烦躁、失眠健忘、心悸盗汗、便秘或尿黄便干、口疮、舌苔黄、苔少、皮肤干燥、两颧骨红、干咳无痰、体温偏高,血压较高、掉发、白带粘稠、月经后期、眼干目眩、视物昏花、腰膝酸软、头晕耳鸣、四肢乏力、脱发,牙齿松动,记忆力减退,性欲减退等,脾气很大,常常心情烦躁易怒等都是阴虚表现形式。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科植物铁皮石斛的干燥茎。在民间素有“救命仙草”之称,具有“滋阴清热,益胃生津”之功效,成书于1000多年前的《道藏》尊其为“中华九大仙草”之首。由于其全面的滋阴补益作用和广泛的保健功效,铁皮石斛一直被视为石斛中的珍品。李时珍《本草纲目》记载:“石斛除痹下气,补五脏虚劳赢瘦,强阴益精,久服,厚肠胃,补内绝不足,平胃气,长肌肉,逐皮肤邪热痱气,脚膝疼冷痹弱,定志除惊,轻身延年,益气除热,治男子腰膝软弱,健阳,逐皮肤风痹、骨中久冷,补肾益力,壮筋骨,暖水脏,益智清气,治发热自汗,痈疽排脓内塞。”现代药理研究表明铁皮石斛具有抗衰老、抗肿瘤、降三高(血脂高血糖高血压高)、提高免疫力等多种生物活性,能够调理人体亚健康状态,治疗免疫力低下,心脑血管疾病,糖尿病,慢性肠胃病,肿瘤及其放化疗体虚症,年老体衰,口腔溃疡和咽喉肿痛等各种阴虚症。
女贞子(Fructus Ligustri Lucidi)为木犀科植物女贞的果实,又名女贞实、冬青子、白蜡树子等。女贞子中主要含有三萜类(齐墩果酸)、醚萜类、氨基酸类、黄酮类和多糖等成分,其中主要起免疫调节作用的是齐墩果酸和多糖类,除此之外,齐墩果酸还具有强心、抗氧化、抗衰老等作用。女贞子补益肝肾、清虚热、明目,主治头晕目眩、腰膝酸软、遗精、耳鸣、须发早白、骨蒸潮热、目暗不明等,是一味临床常用滋补中药。女贞子最早见于《神农本草经》,被列为上品,谓之“女贞实,味苦,平。主补中,安五脏,养精神,除百疾。久服肥健、轻身、不老。”明代李时珍《本草纲目》言其:“苦,平,无毒。”《神农本草经疏》记载:“应是苦寒无毒,气味俱阴,入肝入肾之药也。”《本草纲目易知録》言其:“女贞子,苦,温而平,少阴之精,隆冬不凋,故能益肾强阴,补中明目。”据现代药理作用表明:女贞子具有免疫调节、强心、抗动脉粥样硬化、减缓和防治血栓的形成、降血糖、保肝、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、激素双向调节、促毛囊生长等作用,此外,女贞子对化疗或放疗所致的白细胞减少有升高白细胞的作用。
黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge)为豆科植物黄芪或膜荚黄芪的干燥根,黄芪中主要含有黄芪多糖、皂苷类、黄酮类和氨基酸等,黄芪多糖作为一类生物大分子成分,发挥着极其重要的生物功能,其具有免疫调节、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血糖、抗病毒、治疗代谢性紊乱、迟发性神经退行性疾病及抗衰老等作用。
作为传统中药,《神农本草经》中把黄芪列为上品:“黄耆,味甘微温。主痈疽久败创,排脓止痛,大风,痢疾,五痔,鼠瘘,补虚,小儿百病。一名戴糁。生山谷。《名医》曰:一名戴椹,一名独椹,一名芰草,一名蜀脂,一名百本,生蜀郡白水汉中,二月十月采,阴干。”本草纲目中记载:“黄芪,亦名戴糁、戴椹、草、百本、王孙。(“芪”原作为“耆”)。气味(根)甘、微温、无毒。主治小便不通、酒疸黄疾、白浊、萎黄焦渴、老人便秘、血淋、少淋、吐血、咳脓咳血、肺痈、甲疽、胎动不安、阴汗湿痒。”现代药理学研究表明,黄芪对心血管系统、血液系统、肾功能、物质代谢及肿瘤等均有良好的作用,黄芪还具有增强机体非特异性免疫和增强机体抵抗力的功能。
西洋参(Panax quinquefolius L)为五加科植物西洋参的干燥根,又名美国参、花旗参、洋参、广东参等,其主要生理活性物质为西洋参皂苷、多糖、黄酮类、挥发油、微量元素等,其中西洋参皂苷具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、抗心律失常、抗心肌缺血等作用。西洋参药性苦寒微甘,为气血双补清凉之品。我国古代本草最早记载西洋参的药物书籍为《本草纲目拾遗》:“洋参似辽参之白皮泡丁,味类人参,惟性寒,宜糯米饭上蒸用,甘苦,补阴退热,姜制,益元扶正气。”《本草从新》中记载:“西洋人参,补肺降火、苦寒微甘、味浓气薄、补肺降火、生津液、除烦倦,虚而有火者相宜,出大西洋佛兰西。(形似辽东糙人参、煎之不香、其气甚薄、禁忌与珠参同.)”现代药理研究表明,西洋参的药理作用表现在许多方面:增强机体免疫功能、镇静镇惊、安神促智、抗心律失常、抗休克、保护心肌、防血管硬塞、降血、降血脂、抗应激、抗肿瘤、保肝等。
本发明由以上四味药食同源的补益类药材组方而成,方中铁皮石斛滋阴生津益力,补五脏虚劳羸瘦;黄芪益气健脾,活血生血,利水退肿,补诸虚不足,为本方之主药。女贞子益肝肾,养五脏,强腰膝,明耳目,西洋参补虚损、益精气,温肾阳,滋肺阴为辅药。全方共呈气阴双补,阴阳并调,培元固本之功,对所主治病证起促进康复之作用。专利(CN201410290901.9)处方中包括铁皮石斛、西洋参、黄芪三味药材,涉及一种保养身体的铁皮石斛枫斗晶及其制备方法,其具体工艺步骤为:铁皮石斛、西洋参和黄芪的粗粉分别水提,提取物干燥、粉碎、混合、制粒等;其工艺缺点是:1.铁皮石斛粗粉水提只能提取部分水溶性多糖,对于石斛这样的全草入药的药材来说,浪费比较严重。2.黄芪水提可以提取部分黄芪多糖,但是黄芪甲苷无法提取得到。专利(CN201310148738.8)涉及一种鲜铁皮石斛西洋参颗粒及其制备方法,该专利包括如下工艺步骤:1.铁皮石斛鲜品切断,与水一起超微研磨,再对研磨液进行粗滤和精滤,滤渣备用。2.西洋参先醇提,再与铁皮石斛滤渣混在一起水提。最后一起喷雾干燥,制粒;其工艺缺点是:1.铁皮石斛多糖含量高,鲜品粘性较大,对铁皮石斛鲜品直接进行研磨,浪费比较大,而且研磨液粘性较大,很难过滤。2.喷雾干燥能耗较大,而且会造成滤液的损失。专利(CN201410203602.7)涉及一种用于增强免疫功能的保健食品及其制备方法。该用于增强免疫功能的保健食品,按照重量计,其原料组分包括:黄芪50-100份、女贞子50-100份、西洋参5-50份、甘草5-50份。该保健品的制剂工艺包括:将黄芪、女贞子、西洋参和甘草混合后粉碎,水提,滤液浓缩收膏。此专利中不包含作为本专利主药的铁皮石斛。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种增强免疫力的中药组合物及其制备方法,此中药组合物中含有四味补益类的上等药材,起到气阴双补,阴阳并调,培元固本之功,能够全面提高人体的免疫力。
为实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
一种增强免疫力的中药组合物,按重量份数计,原料组分如下:鲜铁皮石斛8~12份,黄芪1~2份,女贞子1~2份,西洋参1~2份。
一种增强免疫力的中药组合物,按重量份数计,原料组分如下:鲜铁皮石斛10份,黄芪2份,女贞子1.6份,西洋参1份。
一种增强免疫力的中药组合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)原料称取:按重量份数计,分别称取如下原料组分,鲜铁皮石斛8~12份,黄芪1~2份,女贞子1~2份,西洋参1~2份;
(2)铁皮石斛鲜条的处理:取步骤(1)称取的铁皮石斛鲜条洗净、沥干后,投入中药粉碎机中粉碎成1-2cm长的铁皮石斛小段;将铁皮石斛小段进行真空冷冻干燥,再进行超微粉碎,得到铁皮石斛细粉;
(3)西洋参的处理:取步骤(1)称取的西洋参置于温度小于60℃的热风循环干燥箱中进行干燥,再进行超微粉碎,得到西洋参细粉;
(4)醇提:
取步骤(1)称取的黄芪,加入黄芪重量8~10倍的78~82%乙醇,搅拌回流提取2~3次,每次1.2~1.8小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到黄芪醇提清液,将黄芪醇提清液减压真空浓缩至黄芪醇提清膏备用;黄芪醇提药渣另保存;
取步骤(1)称取的女贞子,加入女贞子重量7~9倍的68~72%乙醇,搅拌回流提取2~3次,每次1.8~2.2小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到女贞子醇提清液,将女贞子醇提清液减压浓缩成女贞子醇提清膏备用;女贞子醇提药渣另保存;
(5)水提:
取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量8~10倍的水煎煮2~3次,每次1.2~1.8小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压真空浓缩成黄芪水提清膏;
取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量8~10倍的水煎煮2~3次,每次1.8~2.2小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压浓缩成女贞子水提清膏;
(6)干燥粉碎:
将黄芪醇提清膏和黄芪水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成黄芪干膏,再粉碎成黄芪细粉;
将女贞子醇提清膏和女贞子水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成女贞子干膏,再粉碎成女贞子细粉;
(7)配方:
取铁皮石斛细粉1~2份、西洋参细粉1~2份、黄芪细粉1~2份以及女贞子细粉1~2份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
所述黄芪醇提清膏、女贞子醇提清膏、黄芪水提清膏以及女贞子水提清膏在60℃时的相对密度为1.15~1.25。
步骤(4)所述醇提黄芪的工艺条件如下:加入黄芪重量10倍的80%乙醇,搅拌回流提取二次,每次1.5小时。
步骤(4)所述醇提女贞子的工艺条件如下:加入女贞子重量8倍的70%乙醇,搅拌回流提取二次,每次2小时。
步骤(5)所述水提的工艺条件为:取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量10倍的水煎煮二次,每次1.5小时。
步骤(5)所述水提的工艺条件为:取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量10倍的水煎煮二次,每次2小时。
步骤(7)所述配方的工艺条件如下:取铁皮石斛细粉1份、西洋参细粉1份、黄芪细粉1份以及女贞子细粉1份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
步骤(6)所述黄芪细粉和女贞子细粉为过80~140目筛得到的细粉。
所述的中药组合物按照常规制备技术制备成片剂、颗粒剂、硬胶囊或软胶囊。
所述中药组合物在制备增强免疫力类药物中的应用。
本发明本文中所述的72%乙醇是指体积分数为72%的乙醇,其他乙醇的百分数均与此相同。
本发明所述增强免疫力的保健食品能够制成各种剂型,所述剂型包括内服的硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂或者颗粒剂。优选的是硬胶囊剂,主要表现为:掩盖药物不良气味,起效快,吸收好。
本发明中药组合物功能:益气养阴,培元固本,增强人体免疫力。
主治:免疫功能低下,肿瘤术后患者,肿瘤病人接受放化疗者,病后体虚未复和体弱多病者。
症见:面色晄白,少气懒言,神疲乏力,食欲不振,体虚力减,舌质红,苔薄少津,脉细。
制备:按处方药物比例配制成超细粉,密封备用。
用法:早晚分服,每次4粒,每日二次。
方解:本方主治病症常表现有面色晄白,少气懒言,神疲乏力,食欲不振,体虚力减,舌质红,苔薄少津,脉细等症状体征。此类病人多因禀赋不足,先天遗传,或已屈暮年,功能日损;或摄生不慎,真元暗耗;或暴病久病,由实转虚,或过用攻伐,损伤脏腑,治宜选用调治脏腑功能衰退,气血津精亏损之方药。方中铁皮石斛滋阴生津益力,补五脏虚劳羸瘦;黄芪益气健脾,活血生血,利水退肿,补诸虚不足,为本方之主药。女贞子益肝肾,养五脏,强腰膝,明耳目;西洋参补虚损、益精气,温肾阳,滋肺阴为辅药。全方共呈气阴双补,阴阳并调,培元固本之功,对所主治病证起促进康复之作用。
一、本发明的技术原理及工艺研究:
1、采用正交试验设计筛选黄芪提取条件
(1)采用正交试验设计筛选黄芪醇提条件
黄芪药材采用醇提的方法,药渣再水提。现考察溶媒倍量、提取时间、乙醇浓度、提取次数四个因素对提取的影响。称取黄芪40g按下述因素水平表提取,因素、水平表见表1。
表1醇提条件的正交因素水平表
我们选用黄芪甲苷含量(mg/g)和干膏得率为考察指标,对正交试验进行了数据分析,正交安排表见表2。
表2以黄芪甲苷含量和干膏得率为指标的正交安排表
(表中提供了9个试验方案。如第6号试验是A2B3C1D2,即8倍量70%乙醇回流提取二次,每次2小时,依此类推。)
以黄芪甲苷含量为指标,极差分析结果A>B>D>C,即影响含量的因素排序为:乙醇浓度>提取时间>提取次数>溶媒倍量。分析上述结果,A3B3C2D3为本正交表的最佳因素水平组合,以C项为误差项,对结果进一步进行方差分析,结果见表3。
表3以黄芪甲苷含量为指标的方差分析表
“*”为有显著性意义,F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00
以干膏得率为指标,极差分析结果A>B>D>C,即影响含量的因素排序为:乙醇浓度>提取时间>提取次数>溶媒倍量。分析上述结果,A3B2C2D2为本正交表的最佳因素水平组合,以C项为误差项,对结果进一步进行方差分析,结果见表4。
表4以干膏得率为指标方差分析表(F0.05(2,2)=19.00)
从以上结果可看出以黄芪甲苷含量和干膏得率为指标极差分析:乙醇浓度、提取时间互为主要因素,提取次数、溶媒倍量则依次小于其他因素;方差分析结果:以黄芪甲苷含量和干膏得率为指标F检验临界值结果,只有乙醇浓度这一因素具有显著性。
为了更加客观地评价,用综合评分方法寻找最佳工艺,计算方法如下:在醇提工艺研究的2个指标中,分别选取结果最好的作为100分,然后对2个指标赋与不同的权重,考虑到制剂的服用量、生产成本等因素,将黄芪甲苷含量的权重定为0.5,干膏得率的权重定为0.5。按计算公式:综合得分为Y=权重×(100+最高值-yi),结果表明:极差分析结果A>B>D>C,即影响因素排列顺序为:乙醇浓度>提取时间>提取次数>溶媒倍量。各因素与水平之间的最佳组合为A3B2C2D2。以C项作为误差项,进一步进行方差分析,结果见表5。
表5以综合评分为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,各因素对实验结果的影响均不显著。醇提最佳因素组合为10倍量的80%乙醇提取二次,每次1.5小时。
(2)醇提追加验证试验
为了验证上述结果,称取三份黄芪药材,每份100g,选用A3B2C2D2条件进行醇提试验,看看选定条件优于是否与原来的试验结果一致,进行追加验证试验,结果见表6。
表6.醇提验证试验结果
结论:以A1B3C2D2即70%乙醇8倍量,提取3次,每次2小时,确定为最佳醇提工艺条件。
(3)考察工艺实验的指标:
1.黄芪甲苷的含量测定:
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定。
仪器条件:
检测器:ELSD Alltech 500型温度:82℃载气流量:1.95SLPM
色谱柱:Lichrospher 5-C18 200×4.6mm
柱温:30℃
流动相:甲醇:水=80:20
流速:1.0ml/min
泵:Water 515单泵系统
对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量,分别加甲醇制成每1ml含0.4mg和每1ml含0.2mg的两种对照品溶液。
供试品溶液的制备取干膏约1.5g,精密称定,置索氏提取器中,加甲醇40ml,冷浸过夜,再加甲醇适量,回流4小时,提取液回收甲醇并浓缩至干,残渣加水10ml,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水3~5ml使溶解,放冷,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm,长12cm),以水50ml洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30ml洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇50ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至2ml量瓶内,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取两种对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,以峰面积的自然对数值为纵坐标,以进样量的自然对数值为横坐标,外标两点法计算含量。
2.干膏得率的计算:按正交因素水平表进行实验所得的提取液,浓缩至相对密度为1.20(60℃)的清膏,60℃、-0.08MPa条件下真空干燥,所得干膏称重。
2、水提条件的优选实验
(1)取黄芪醇提药渣按下述因素水平表提取,以黄芪多糖和得膏率为考察指标。因素水平表见表7。
表7水提条件的正交因素水平表
我们选用得膏率(%)为参考指标,对正交试验进行了数据分析,正交安排表见表8。
表8水提条件的正交安排表(D为空列)
(表中提供了9个试验方案。如第6号试验是A2B3C1D2,即10倍量水提取一次,每次2小时,依此类推。)
以得膏率为指标分析正交安排表,极差分析结果C>A>B,即影响得膏率的因素排序为:提取次数>溶媒倍量>提取时间。分析上述结果,A3B1C3为本正交表的最佳因素水平组合,方差分析说明提取次数对实验结果有显著性影响,各因素间并无交互作用。方差分析表见表9。
表9以得膏率为指标的方差分析表
F0.01(2,2)=99.00,F0.005(2,2)=199.00
以黄芪多糖含量为指标,极差分析结果C>B>A,即影响含量的因素排序为:提取次数>提取时间>溶媒倍量。分析上述结果,A2B2C2为本正交表的最佳因素水平组合,方差分析说明三因素对实验结果都没有显著影响,各因素间并无交互作用。方差分析表见表10。
表10以黄芪多糖含量为指标的方差分析表
从以上结果可看出以黄芪多糖含量和干膏得率为指标极差分析:、提取次数为主要因素;方差分析结果:以黄芪多糖含量和干膏得率为指标F检验临界值结果,只有提取次数这一因素具有显著性。
为了更加客观地评价,用综合评分方法寻找最佳工艺,计算方法如下:在水水提工艺研究的2个指标中,分别选取结果最好的作为100分,然后对2个指标赋与不同的权重,考虑到制剂的服用量、生产成本等因素,将黄芪多糖含量的权重定为0.5,干膏得率的权重定为0.5。按计算公式:综合得分为Y=权重×(100+最高值-yi),结果表明:极差分析结果C>B>A,即影响因素排列顺序为:提取次数>提取时间>溶媒倍量。各因素与水平之间的最佳组合为A2B2C2。对结果进一步进行方差分析,结果见表11。
表11以综合评分为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,A、B、C三个因素对实验结果的影响均没有显著性影响。水提工艺最后的方案确定为A2B2C2,即10倍量水煎煮二次,每次1.5小时。
(2)水提验证试验
为了验证上述试验结果,称取3份黄芪醇提药渣,每份100g,按A2B2C2条件进行水提试验,看看选定条件与原来的试验结果的进行验证试验,结果见表12。
表12水提验证试验结果
结论:
水提验证实验结果与原实验结果一致,因此水提工艺最后的方案确定为A2B2C2,即10倍量水煎煮二次,每次1.5小时。
1.得膏率的计算:按正交因素水平表进行实验所得的提取液,浓缩至相对密度为1.20(60℃)的清膏,60℃、-0.08MPa条件下真空干燥,所得干膏称重。
2.总多糖含量测定:供试品溶液的制备:精密称取约100mg样品,置100ml量瓶中,加入约80ml水振摇溶解后,用水稀释至刻度,精密量取10ml,置100ml量瓶中,用水稀释至刻度,作为供试品溶液。对照品溶液的制备:精密称取约100mg葡萄糖干燥品,置100ml量瓶中,加水使葡萄糖溶解并稀释至刻度。
含量测定:精密量取2.0ml,置50ml量瓶中,用水稀释至刻度作为对照品溶液(浓度为0.04013mg/ml)。精密量取上述溶液各2.0ml置10ml离心管中,精密加入1.0ml苯酚(5%),5.0ml硫酸,立刻摇匀。放置25min后照分光光度法在490nm处测定吸收度。同时进行空白试验校正。
二、采用正交试验设计筛选女贞子醇提条件
1、女贞子采用醇提的方法提取脂溶性成分,药渣再水提。现考察乙醇浓度、提取时间、溶媒倍量、提取次数四个因素对提取的影响。各称取女贞子100g按下述因素水平表提取,因素、水平表见表13。
表13醇提条件的正交因素水平表
我们选用齐墩果酸量(mg/g)和干膏得率(%)为考察指标,对正交试验进行了数据分析,正交安排表见表14。
表14以齐墩果酸量和干膏得率为指标的正交表
表中提供了9个试验方案。如第6号试验是A2B3C1D2,即80%乙醇,6倍量回流提取2次,每次1小时,依此类推。
以齐墩果酸量为指标,极差分析结果A>D>C>B,即影因素排列顺序为:乙醇浓度>提取次数>溶媒倍量>提取时间。各因素与水平之间的最佳组合为A1B3C2D2。以B项作为误差项,进一步进行方差分析,结果见表15。
表15.以齐墩果酸量为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,各因素对实验结果的影响均不显著。
以干膏得率为指标,极差分析结果C>A>D>B,即影响因素排列顺序为:溶媒倍量>乙醇浓度>提取次数>提取时间。各因素与水平之间的最佳组合为A1B3C2D3。以B项作为误差项,进一步进行方差分析,结果见表16。
表16以干膏得率为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,溶媒倍量对实验结果的影响有显著性。
从以上结果可看出以齐墩果酸量和浸膏量为指标极差分析:乙醇浓度、溶媒倍量互为主要因素,提取次数、提取时间则依次小于其他因素;方差分析结果:以干膏得率为指标F检验临界值结果,溶媒倍量对实验结果的影响有显著性。
为了更加客观地评价,用综合评分方法寻找最佳工艺,计算方法如下:在醇提工艺研究的2个指标中,分别选取结果最好的作为100分,然后对2个指标赋与不同的权重,考虑到制剂的服用量、生产成本等因素,将齐墩果酸量的权重定为0.5,干膏得率的权重定为0.5。
按计算公式:综合得分为Y=权重×(100+最高值-yi),结果表明:极差分析结果A>D>C>B,即影响因素排列顺序为:乙醇浓度>提取次数>溶媒倍量>提取时间。各因素与水平之间的最佳组合为A1B3C2D2。以D项作为误差项,进一步进行方差分析,结果见表17。
表17以综合评分为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,各因素对实验结果的影响均不显著。醇提最佳因素组合为70%乙醇8倍量,提取2次,每次2小时。
(2)醇提追加验证试验
为了验证上述结果,称取3份女贞子药材,每份100g,选用A1B3C2D2条件进行醇提试验,看看选定条件优于是否与原来的试验结果一致,进行追加验证试验,结果见表18。
表18.醇提验证试验结果
结论:以A1B3C2D2即70%乙醇8倍量,提取2次,每次2小时,确定为最佳醇提工艺条件。
(3)考察工艺实验指标的方法:
①得膏量的计算:按正交因素水平表进行实验所得的提取液,浓缩至清膏,60℃、-0.08MPa条件下真空干燥,所得干膏称重。
②齐墩果酸量测定:
照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录ⅥD)测定。
仪器条件:
检测器:SPD-M10AVP
色谱柱:Pre-Packed Column(5μm,250mm×4.6m m)
柱温:30℃
流动相:乙腈-甲醇-水-乙酸铵(70:16:14:0.5)
流速:1.0ml/min
泵:LC-10ADVP
对照品溶液的制备精密称取对照品适量,分别加甲醇制成每1ml含40μg对照品溶液。
供试品溶液的制备取干膏约0.25g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理15分钟,放冷,补足减失的重量,滤过;吸取续滤液2ml,置10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
测定法分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
2、水提条件的优选实验
(1)取女贞子的醇提药渣按下述因素水平表提取,以总多糖量及得膏率为考察指标。因素水平表见表19。
表19水提条件的正交因素水平表
我们选用总多糖量(%)和干膏得率膏量(%)为考察指标,进行水提正交试验,结果见表20。
表20以女贞子多糖含量和浸膏得率为指标的正交表
表中提供了9个试验方案。如第6号试验是A2B3C1,即8倍量水,提取1次,每次2小时,依此类推。
以多糖含量为指标,极差分析结果C>A>B即影响因素排列顺序为:提取次数>溶剂倍量>提取时间。各因素与水平之间的最佳组合为A1B2C2。以D项作为误差项,进一步进行方差分析,结果见表21。
表21.以总多糖量为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,A、B、C三因素对实验结果的影响均不显著。
以干膏得率为含量为指标,极差分析结果B>A>C即影响因素排列顺序为:提取时间>溶剂倍量>提取次数。各因素与水平之间的最佳组合为A3B3C3。以D项作为误差项,进一步进行方差分析,结果见表22。
表22.以干膏得率为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,C因素对实验结果的影响不显著,而A、B因素对实验结果均有显著影响。
从以上结果可看出以总多糖量和浸膏量为指标极差分析:不同的考察指标,三种因素影响不同;方差分析结果:以干膏得率为指标F检验临界值结果:A、B因素显著,C因素不显著。
为了更加客观地评价,用综合评分寻找最佳工艺,计算方法如下:在水提工艺研究的2个指标中,分别选取结果最好的作为100分,然后对2个指标赋与不同的权重,考虑到制剂的服用量、生产成本等因素,将总多糖量的权重定为0.5,浸膏量的权重定为0.5。按计算公式:综合得分为Y=权重×(100+最高值-yi),结果表明:极差分析结果B>C>A,即影响因素排列顺序为:提取时间>提取次数>溶剂倍量。各因素与水平之间的最佳组合为A3B3C2。以D项作为误差项,进一步进行方差分析,结果见表23。
表23以综合评分为指标的方差分析表
查F检验临界值结果F0.05(2,2)=19.00,A、B、C三因素对实验结果的影响均不显著。(2)水提验证试验
为了验证上述试验结果,称取三份女贞子醇提药渣,每份100g,按A3B3C2条件进行水提试验,看看选定条件与原来的试验结果是否一致,结果见表24。
表24水提验证试验结果
结论:选定条件与原来的试验结果一致,因此乃以A3B3C2,即10倍量水,提取2次,每次2小时为最佳工艺。
(3)考察工艺实验指标的方法:
①得膏量的计算:按正交因素水平表进行实验所得的提取液,浓缩至清膏,60℃、-0.08MPa条件下真空干燥,所得干膏称重。
②总多糖含量测定:
供试品溶液的制备:精密称取约100mg样品,置100ml量瓶中,加入约80ml水振摇溶解后,用水稀释至刻度,精密量取10ml,置100ml量瓶中,用水稀释至刻度,作为供试品溶液。
对照品溶液的制备:精密称取约100mg葡萄糖干燥品,置100ml量瓶中,加水使葡萄糖溶解并稀释至刻度,精密量取2.0ml,置50ml量瓶中,用水稀释至刻度作为对照品溶液(浓度为0.04013mg/ml)。
精密量取上述溶液各2.0ml置10ml离心管中,精密加入1.0ml苯酚(5%),5.0ml硫酸,立刻摇匀。放置25min后照分光光度法在490nm处测定吸收度。同时进行空白试验校正。
二、功效研究
选用上海西普尔-必凯实验动物有限公司繁殖的SPF级昆明种健康雄性小鼠240只。分为Ⅴ大组,每组48只。分别进行二硝基氟苯诱导小鼠DTH试验,小鼠碳廓清试验,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验,小鼠抗体生成细胞及半数溶血值(HC50)试验和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化、NK细胞活性实验。每组再随机分为4小组,每小组12只。
本发明组方制备的胶囊服用方法为例,一般人一天服用8粒胶囊(0.45g/粒),所以设0.3g/kg*bw,0.6g/kg*bw,1.2g/kg*bw三个剂量组(分别相当于人体(60kg计)推荐摄入量的5倍、10倍和20倍)和空白对照组。受试样品用生理盐水配制成低、中、高剂量浓度分别为30mg/mL、60mg/mL、120mg/mL,每日灌胃给予相应浓度的受试样品5ml/kg*bw。空白对照组灌胃相应量生理盐水,连续灌胃1月后测定各项增强免疫力功能指标。
1、按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)之增强免疫力功能检验方法进行实验。
1.1二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应(DTH)-耳肿胀法:
各剂量组小鼠连续灌胃1月后,每鼠用剃毛机将腹部毛剃去,范围约3cm×3cm,用10mg/mL二硝基氟苯溶液50μL均匀涂抹致敏。5日后用10mg/mL二硝基氟苯溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击,攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右两耳,用打孔器取下直径8mm耳片,称重。
用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于对照组的重量差值,可判定该项实验结果阳性。
1.2小鼠碳廓清试验:
各剂量组小鼠连续灌胃1月后,每鼠尾静脉注入4倍稀释的印度墨汁(0.1mL/10gbw),待墨汁注入立即计时。注入墨汁后2min及10min分别从眼内眦静脉丛取血20μL,并将其加到2mL0.1%Na2CO3溶液中,用722分光光度计在600nm波长处测光密度值,并取胸腺、肝、脾,利用光密度值、肝重和脾重计算吞噬指数a。另计算胸腺/体重比、脾/体重比。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数,可判定该项实验结果阳性。
1.3小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验-半体内法
各剂量组小鼠连续灌胃1月后,制备20%(v/v)的鸡红细胞悬液,每只腹腔注射1mL,间隔30min,颈椎脱臼处死小鼠,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2mL,转动鼠板1min,然后吸出腹腔洗液1mL,平均分滴于2片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,移置37℃恒温培养箱孵育30min,然后于生理盐水中漂洗,晾干,以1:1丙酮甲醇溶液固定,4%(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min,再用蒸馏水漂洗晾干,封片,光镜下观察。
受试样品组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较,差异均有显著性,方可判定该项实验结果阳性。
1.4小鼠抗体生成细胞检测-Jerne改良玻片法
各剂量组小鼠连续灌胃1月后,每只鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC悬液0.2mL进行免疫,4d后小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏,放在盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中,研磨脾脏,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,离心(1000r/min)10min,用Hank’s液洗2遍,最后将细胞悬浮于5mLRPMI1640培养液中,计数细胞数,用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。将表层培养基加热溶解后,放45℃水浴保温,与等量pH7.2-7.4两倍浓度的Hank’s液混合,分装小试管,每管0.5mL,再向管内加10%SRBC(v/v,用SA缓冲液配制)50μL,20μL脾细胞悬液(5×106个/mL),迅速混匀,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h,然后将制备好的补体1:8稀释后加入到玻片架凹槽内,继续孵育1.5h后,计数溶血空斑数。
用空斑数/106脾细胞来表示,受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数,可判定该项实验结果阳性。
1.5血清溶血素测定-半数溶血值(HC50)
各剂量组小鼠连续灌胃1月后,制备2%(v/v)SRBC悬液,每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫,4d后摘眼球取血于离心管内,放置1h,2000r/min离心10min,分离并收集血清。血清200倍稀释后,按检验方法测定样品管及SRBC半数溶血时的光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示。
受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50,可判定该项实验结果阳性。
1.6ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法
各剂量组小鼠连续灌胃1月后,颈椎脱臼法处死动物,无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中,研磨脾脏,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,离心(1000r/min)10min,用Hank’s液洗2遍,然后将细胞悬浮于1mLRPMI1640完全培养液中,台酚蓝染色计数活细胞数(均在95%以上),用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1mL,一孔加75μLConA液,另一孔作为对照,置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1mL酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。将溶液移入96孔培养板中,用酶标仪在波长570nm下测定各样品管光密度值。
用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值,可判定该项实验结果阳性。
1.7NK细胞活性测定-乳酸脱氢酶测定法
各剂量组小鼠连续灌胃1月后,颈椎脱臼法处死动物,无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中,研磨脾脏,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,用Hank’s液洗2次,每次离心(1000r/min)10min,弃上清将细胞浆弹起,加入0.5mL灭菌水20秒裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液,离心10min(1000r/min),用1.0mL含10%小牛血清RPMI1640完全培养液重悬,用1%冰乙酸稀释后计数,台酚蓝染色计数活细胞数(均在95%以上),用RPMI1640培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
实验前24h将靶细胞(YAC-1细胞)传代培养,应用前以Hank’s液洗3次,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL.取YAC-1细胞和脾细胞各100μL(效靶比50:1)加入U型96孔培养板中,YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100μL,YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和1%NP40各100μL,上述各项均设三个平行孔,于37℃、5%CO2培养箱中培养4h,然后将96孔培养板以1500r/min离心15min,每孔吸取上清液100μL置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液100μL,反应10min,每孔加入1mol/L的HCl30μL,在酶标仪490nm处测定光密度值。
受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,可判定该项实验结果阳性。
1.8数据分析
用spss10.0软件对各实验原始数据进行方差齐性检验,满足方差齐性要求的数据资料,用单因素方差分析方法中多个实验组于一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理;对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换所得的数据进行统计处理。
1.9结果判定方法
在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性,可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
2、结果
实验过程中动物饮水摄食正常,外观无异常。
2.1本发明组合物对小鼠体重的影响
由表25可见,小鼠的初始体重0.3g/kg*bw,0.6g/kg*bw,1.2g/kg*bw与空白组比较,差异均无显著性。表明小鼠的初始体重在各组间较为均衡。
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,各剂量组体重增长值经正态分布、方差齐性检验,满足正态分布、方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。0.3g/kg*bw,0.6g/kg*bw,1.2g/kg*bw与空白组比较,差异均无显著性。
表25本发明组合物对小鼠体重的影响
续表25
续表25
续表25
续表25
2.2本发明组合物对小鼠胸腺、脾脏器官的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,各剂量组胸腺/体重、脾/体重经方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。0.3g/kg*bw、0.6g/kg*bw、1.2g/kg*bw与空白组比较,差异均无显著性。见表26:
表26本发明组合物对小鼠胸腺、脾脏器官的影响
2.3本发明组合物对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值经方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。1.2g/kg*bw组与空白组比较,差异有显著性。见表27:
表27本发明组合物对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响
2.4本发明组合物对小鼠对DNFB诱导小鼠DTH的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,耳壳增重经方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。1.2g/kg*bw与空白组比较,差异有显著性。见表28:
表28本发明组合物对小鼠对DNFB诱导小鼠DTH的影响
剂量(g/kg*bw) | 动物数(只) | 耳壳增重(mg) | P值 |
0 | 12 | 12.7±3.8 | |
0.3 | 12 | 15.2±4.8 | 0.438 |
0.6 | 12 | 15.6±5.1 | 0.293 |
1.2 | 12 | 17.9±3.5 | 0.017 |
2.5本发明组合物对小鼠抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,溶血空斑数经正态分布、方差齐性检验,满足正态分布、方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。1.2g/kg*bw与空白组比较,差异有显著性。见表29:
表29本发明组合物对小鼠抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响
2.6本发明组合物对小鼠血清半数溶血值(HC50)的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,HC50经正态分布、方差齐性检验,满足正态分布、方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。1.2g/kg*bw与空白组比较,差异有显著性。见表30:
表30本发明组合物对小鼠血清半数溶血值(HC50)的影响
剂量(g/kg*bw) | 动物数(只) | HC50 | P值 |
0 | 12 | 46±27 | |
0.3 | 12 | 60±29 | 0.419 |
0.6 | 12 | 73±31 | 0.270 |
1.2 | 12 | 82±23 | 0.006 |
2.7本发明组合物对小鼠碳廓清能力的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,吞噬指数a经方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。0.3g/kg*bw、0.6g/kg*bw、1.2g/kg*bw与空白组比较,差异均无显著性。见表31:
表31本发明组合物对小鼠碳廓清能力的影响
剂量(g/kg*bw) | 动物数(只) | 吞噬指数a | P值 |
0 | 12 | 5.09±0.68 | |
0.3 | 12 | 5.18±0.76 | 0.993 |
0.6 | 12 | 5.23±0.79 | 0.937 |
1.2 | 12 | 5.52±0.92 | 0.738 |
2.8本发明组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,吞噬指数、吞噬百分率经sin-1P1/2(P为吞噬百分率,用小数表示)转化后进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。1.2g/kg*bw组与空白组比较,差异有显著性。见表32:
表32本发明组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数的影响
剂量(g/kg*bw) | 动物数(只) | 吞噬百分率(%) | P值 | 吞噬指数 | P值 |
0 | 12 | 15.2±5.4 | 0.6±0.04 | ||
0.3 | 12 | 16.3±6.3 | 0.823 | 0.21±0.07 | 0.367 |
0.6 | 12 | 16.7±5.5 | 0.847 | 0.19±0.04 | 0.932 |
1.2 | 12 | 21.4±6.8 | 0.041 | 0.27±0.09 | 0.031 |
2.9本发明组合物对小鼠NK细胞活性的影响
灌胃给予小鼠不同剂量的本发明组合物1月后,NK细胞活性经sin-1P1/2(P为NK细胞活性,用小数表示)转化后进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。0.3g/kg*bw、0.6g/kg*bw、1.2g/kg*bw与空白组比较,差异均无显著性。见表33:
表33本发明组合物对小鼠NK细胞活性的影响
剂量(g/kg*bw) | 动物数(只) | NK细胞活性(%) | P值 |
0 | 12 | 28.3±13.9 | |
0.3 | 12 | 42.9±18.7 | 0.39 |
0.6 | 12 | 44.7±20.3 | 0.053 |
1.2 | 12 | 45.3±15.7 | 0.057 |
3、结论
本发明组合物以0.3g/kg*bw、0.6g/kg*bw、1.2g/kg*bw连续给药1月,结果表明:
(1)细胞免疫功能:ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验1.2g/kg*bw组加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值显著高于空白组;二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应实验中1.2g/kg*bw组耳壳增重显著高于空白组。
(2)体液免疫功能:抗体生成细胞检测实验中1.2g/kg*bw组溶血空斑数显著高于空白组;血清溶血素的测定实验中1.2g/kg*bw组半数溶血值(HC50)显著高于空白组。
(3)单核-巨噬细胞功能:小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验中1.2g/kg*bw组吞噬百分率及吞噬指数显著高于空白组。
三、拆方功效研究
将本发明涉及到的药味设立不同的组合,进行功效对比研究。
A组:铁皮石斛+西洋参
B组:西洋参+黄芪+女贞子
C组:铁皮石斛+西洋参+黄芪
D组:铁皮石斛+西洋参+黄芪+女贞子
E组:铁皮石斛+女贞子
F组:西洋参+女贞子
G组:黄芪+女贞子
以上四组处方比例和工艺均与本专利的本发明组合物相同。
功效实验研究过程如下:
选用上海西普尔-必凯实验动物有限公司繁殖的SPF级昆明种健康雄性小鼠192只。分为II大组,每组96只。分别进行小鼠抗体生成细胞及半数溶血值(HC50)试验。每组再随机分为8小组,每小组12只。三种实验过程和数据分析手段均与上面相同,小鼠服用剂量均为最大剂量:1.2g/kg*bw即浓度为120mg/mL,A、B、C、D、E、F、G七组每日灌胃给予相应浓度的受试样品5ml/kg*bw。空白对照组灌胃相应量生理盐水,连续灌胃1月后测定此2项体液免疫功能指标。
1.A~G组所述的组合物对小鼠抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响
灌胃给予小鼠相同剂量的A~G组所述的组合物1月后,溶血空斑数经正态分布、方差齐性检验,满足正态分布、方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。B、D、E、F、G组与空白组比较,差异均有显著性。见表34:
表34对小鼠抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响
2.A~G组所述的组合物对小鼠血清半数溶血值(HC50)的影响
灌胃给予小鼠相同剂量的A~G组所述的组合物1月后,HC50经正态分布、方差齐性检验,满足正态分布、方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。D组与空白组比较,差异有显著性。见表35:
表35对小鼠血清半数溶血值(HC50)的影响
组别 | 动物数(只) | HC50 | P值 |
对照组 | 12 | 47±26 | |
A组 | 12 | 62±27 | 0.421 |
B组 | 12 | 70±28 | 0.265 |
C组 | 12 | 75±32 | 0.286 |
D组 | 12 | 81±22 | 0.007 |
E组 | 12 | 67±24 | 0.256 |
F组 | 12 | 64±28 | 0.395 |
G组 | 12 | 72±30 | 0.273 |
结果分析:
从表35的结果看出,A、B、C、D、E、F、G七组组合物中,B、D、E、F、G组与空白组比较,差异均有显著性,进一步分析得知,此五组组合物有一个共同点,即组方中均含有女贞子,说明女贞子小鼠抗体细胞的生成有明显的影响。综合表17和表18的结果可以看出,A、B、C、D、E、F、G七组组合物中,只有D组具有体液免疫功能,所以D组为最好的组合配方。
综上所述,与现有技术相比较,本发明具备的有益效果:
1、处方
本发明本发明组合物中铁皮石斛被称为“中华九大仙草”“救命仙草”“药界大熊猫”等,拥有滋阴补益、益胃生津之功效,具有抗衰老、抗肿瘤、降三高(血脂高血糖高血压高)、提高免疫力等多种生物活性,能够调理人体亚健康状态,治疗免疫力低下心脑血管疾病糖尿病慢性肠胃病肿瘤及其放化疗体虚症年老体衰口腔溃疡和咽喉肿痛等各种阴虚症。除了铁皮石斛外,其他三味药材也具有增强免疫力的功效。四味补益类药材合用,具有滋阴补益和增强免疫力的作用,共呈培元固本之功效。
2、制备方法
2.1本发明中铁皮石斛采用真空冷冻干燥技术:冷冻干燥技术作为一项重要的中药新技术,其具有其它干燥技术替代的优点:一.冷冻干燥在低温下进行,因此对于许多热敏性的物质特别适用。二.在低温下干燥时,物质中的一些挥发性成分损失很小。三.在冷冻干燥过程中,微生物的生长和酶的作用无法进行,因此能保持原来的性状。四.由于在冻结的状态下进行干燥,因此体积几乎不变,保持了原来的结构,不会发生浓缩现象。五.干燥后的物质,加水后溶解迅速而完全,几乎立即恢复原来的性状。六.由于干燥在真空下进行,氧气极少,因此一些易氧化的物质得到了保护。七.干燥能排除95-99%以上的水份,使干燥后产品能长期保存而不致变质。因为铁皮石斛中最主要的活性成分就是石斛活性多糖,多糖含量的高低直接影响铁皮石斛的保健效果,采用冷冻干燥技术可以避免石斛活性多糖因高温分解而损失掉,更好地保留了铁皮石斛的功能成分。
2.2本发明中采用超微粉碎技术:超微粉碎能把原材料加工成微米甚至纳米级的微粉,药材经超微粉碎后不仅可完整保留营养成分、改善口感,而且可通过细胞破壁提高药材中有效成分的溶出,提高药材使用率,还可方便调剂并提高产品质量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例一:
一种增强免疫力的中药组合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)原料称取:按重量份数计,分别称取如下原料组分:鲜铁皮石斛10份,黄芪2份,女贞子1.6份,西洋参1份;
(2)铁皮石斛鲜条的处理:将铁皮石斛鲜条洗净、沥干后,投入中药粉碎机中粉碎成1-2cm长的铁皮石斛小段;将铁皮石斛小段进行真空冷冻干燥,再进行超微粉碎,得到铁皮石斛细粉;
(3)西洋参的处理:将西洋参置于温度小于60℃的热风循环干燥箱中进行干燥,再进行超微粉碎,得到西洋参细粉;
(4)醇提:
称取黄芪,加入黄芪重量10倍的80%乙醇,搅拌回流提取二次,每次1.5小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到黄芪醇提清液,将黄芪醇提清液减压真空浓缩至黄芪醇提清膏备用;黄芪醇提药渣另用。
称取女贞子,加入女贞子重量8倍的70%乙醇,搅拌回流提取二次,每次2小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到女贞子醇提清液,将女贞子醇提清液减压浓缩成女贞子醇提清膏备用;女贞子醇提药渣另用。
(5)水提:
取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量10倍的水煎煮二次,每次1.5小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压真空浓缩成黄芪水提清膏;
取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量10倍的水煎煮二次,每次2小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压浓缩成女贞子水提清膏;
(6)干燥粉碎:
将黄芪醇提清膏和黄芪水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成黄芪干膏,再粉碎成黄芪细粉;
将女贞子醇提清膏和女贞子水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成女贞子干膏,再粉碎成女贞子细粉;
所述黄芪细粉和女贞子细粉为过80目筛得到的细粉。
(7)配方:
取铁皮石斛细粉1份、西洋参细粉1份、黄芪细粉1份以及女贞子细粉1份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
制成成品时,还可以包括如下步骤:
(8)再加入微晶纤维素0.49份和硬脂酸镁0.01份,混合均匀。
(9)胶囊填充:取0号胶囊,装量为0.45g/粒,进行灌装。
实施例二:
一种增强免疫力的中药组合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)原料称取:按重量份数计,分别称取如下原料组分:鲜铁皮石斛8份,黄芪1份,女贞子1份,西洋参1份;
(2)铁皮石斛鲜条的处理:将铁皮石斛鲜条洗净、沥干后,投入中药粉碎机中粉碎成1-2cm长的铁皮石斛小段;将铁皮石斛小段进行真空冷冻干燥,再进行超微粉碎,得到铁皮石斛细粉;
(3)西洋参的处理:将西洋参置于温度小于60℃的热风循环干燥箱中进行干燥,再进行超微粉碎,得到西洋参细粉;
(4)醇提:
称取黄芪,加入黄芪重量10倍的80%乙醇,搅拌回流提取二次,每次1.5小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到黄芪醇提清液,将黄芪醇提清液减压真空浓缩至黄芪醇提清膏备用;黄芪醇提药渣另用。
称取女贞子,加入女贞子重量8倍的70%乙醇,搅拌回流提取二次,每次2小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到女贞子醇提清液,将女贞子醇提清液减压浓缩成女贞子醇提清膏备用;女贞子醇提药渣另用
(5)水提:
取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量8倍的水煎煮2次,每次1.2小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压真空浓缩成黄芪水提清膏;
取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量8倍的水煎煮2次,每次1.8小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压浓缩成女贞子水提清膏;
(6)干燥粉碎:
将黄芪醇提清膏和黄芪水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成黄芪干膏,再粉碎成黄芪细粉;
将女贞子醇提清膏和女贞子水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成女贞子干膏,再粉碎成女贞子细粉;
所述黄芪细粉和女贞子细粉为过140目筛得到的细粉。
(7)配方:
取铁皮石斛细粉1~2份、西洋参细粉1~2份、黄芪细粉1~2份以及女贞子细粉1~2份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
制成成品时,还可以包括如下步骤:
(8)再加入微晶纤维素0.49份和硬脂酸镁0.01份,混合均匀。
(9)压片:直径10mm冲模,压片,片重0.3g/片;
(10)包衣:欧巴代薄膜包衣即得。
实施例三:
一种增强免疫力的中药组合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)原料称取:按重量份数计,分别称取如下原料组分:鲜铁皮石斛12份,黄芪2份,女贞子2份,西洋参2份;
(2)铁皮石斛鲜条的处理:将铁皮石斛鲜条洗净、沥干后,投入中药粉碎机中粉碎成1-2cm长的铁皮石斛小段;将铁皮石斛小段进行真空冷冻干燥,再进行超微粉碎,得到铁皮石斛细粉;
(3)西洋参的处理:将西洋参置于温度小于60℃的热风循环干燥箱中进行干燥,再进行超微粉碎,得到西洋参细粉;
(4)醇提:
称取黄芪,加入黄芪重量10倍的80%乙醇,搅拌回流提取二次,每次1.5小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到黄芪醇提清液,将黄芪醇提清液减压真空浓缩至黄芪醇提清膏备用;黄芪醇提药渣另用;
称取女贞子,加入女贞子重量8倍的70%乙醇,搅拌回流提取二次,每次2小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到女贞子醇提清液,将女贞子醇提清液减压浓缩成女贞子醇提清膏备用;女贞子醇提药渣另用;
(5)水提:
取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量10倍的水煎煮3次,每次1.8小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压真空浓缩成黄芪水提清膏;
取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量10倍的水煎煮3次,每次2.2小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压浓缩成女贞子水提清膏;
(6)干燥粉碎:
将黄芪醇提清膏和黄芪水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成黄芪干膏,再粉碎成黄芪细粉;
将女贞子醇提清膏和女贞子水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成女贞子干膏,再粉碎成女贞子细粉;
所述黄芪细粉和女贞子细粉为过120目筛得到的细粉。
(7)配方:
取铁皮石斛细粉1~2份、西洋参细粉1~2份、黄芪细粉1~2份以及女贞子细粉1~2份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
制成成品时,还可以包括如下步骤:
(8)糊精3.99份、甜菊素0.01份,80%乙醇制成软材,过10目筛,制成湿颗粒。
(9)干燥、整粒:置≤60℃干燥,用12目筛整粒。
(10)分装:用聚乙烯复合膜分装,装量为6g/袋即得。
实施例四:
一种增强免疫力的中药组合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)原料称取:按重量份数计,分别称取如下原料组分:鲜铁皮石斛10份,黄芪1.5份,女贞子1.5份,西洋参1份;
(2)铁皮石斛鲜条的处理:将铁皮石斛鲜条洗净、沥干后,投入中药粉碎机中粉碎成1-2cm长的铁皮石斛小段;将铁皮石斛小段进行真空冷冻干燥,再进行超微粉碎,得到铁皮石斛细粉;
(3)西洋参的处理:将西洋参置于温度小于60℃的热风循环干燥箱中进行干燥,再进行超微粉碎,得到西洋参细粉;
(4)醇提:
称取黄芪,加入黄芪重量10倍的80%乙醇,搅拌回流提取二次,每次1.5小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到黄芪醇提清液,将黄芪醇提清液减压真空浓缩至黄芪醇提清膏备用;黄芪醇提药渣另用;
称取女贞子,加入女贞子重量8倍的70%乙醇,搅拌回流提取二次,每次2小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到女贞子醇提清液,将女贞子醇提清液减压浓缩成女贞子醇提清膏备用;女贞子醇提药渣另用;
(5)水提:
取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量9倍的水煎煮2次,每次1.5小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压真空浓缩成黄芪水提清膏;
取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量9倍的水煎煮2次,每次2小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压浓缩成女贞子水提清膏;
(6)干燥粉碎:
将黄芪醇提清膏和黄芪水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成黄芪干膏,再粉碎成黄芪细粉;
将女贞子醇提清膏和女贞子水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成女贞子干膏,再粉碎成女贞子细粉;
所述黄芪细粉和女贞子细粉为过100目筛得到的细粉。
(7)配方:
取铁皮石斛细粉1~2份、西洋参细粉1~2份、黄芪细粉1~2份以及女贞子细粉1~2份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
制成成品时,还可以包括如下步骤:
(8)将步骤(7)所述增强免疫力的中药组合物用等量大豆油混合碾磨均匀,再加入醇提水提清膏用胶体磨碾磨20分钟,混合均匀。
(9)胶皮溶液的配制:明胶1000g、蒸馏水1000g、甘油350g、棕氧化铁10g。
(10)分装:装量为0.45g/粒即得。
Claims (10)
1.一种增强免疫力的中药组合物,其特征在于,按重量份数计,原料组分如下:鲜铁皮石斛10份,黄芪2份,女贞子1.6份,西洋参1份;
上述组合物是通过以下方法制备得到的:
(1)原料称取:按上述重量份数计分别称取原料组分;
(2)铁皮石斛鲜条的处理:取步骤(1)称取的铁皮石斛鲜条洗净、沥干后,投入中药粉碎机中粉碎成1-2cm长的铁皮石斛小段;将铁皮石斛小段进行真空冷冻干燥,再进行超微粉碎,得到铁皮石斛细粉;
(3)西洋参的处理:取步骤(1)称取的西洋参置于温度小于60℃的热风循环干燥箱中进行干燥,再进行超微粉碎,得到西洋参细粉;
(4)醇提:
取步骤(1)称取的黄芪,加入黄芪重量8~10倍的78~82%乙醇,搅拌回流提取2~3次,每次1.2~1.8小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到黄芪醇提清液,将黄芪醇提清液减压真空浓缩至黄芪醇提清膏备用;黄芪醇提药渣另保存;
取步骤(1)称取的女贞子,加入女贞子重量7~9倍的68~72%乙醇,搅拌回流提取2~3次,每次1.8~2.2小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到女贞子醇提清液,将女贞子醇提清液减压浓缩成女贞子醇提清膏备用;女贞子醇提药渣另保存;
(5)水提:
取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量8~10倍的水煎煮2~3次,每次1.2~1.8小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压真空浓缩成黄芪水提清膏;
取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量8~10倍的水煎煮2~3次,每次1.8~2.2小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压浓缩成女贞子水提清膏;
(6)干燥粉碎:
将黄芪醇提清膏和黄芪水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成黄芪干膏,再粉碎成黄芪细粉;
将女贞子醇提清膏和女贞子水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成女贞子干膏,再粉碎成女贞子细粉;
(7)配方:
取铁皮石斛细粉1~2份、西洋参细粉1~2份、黄芪细粉1~2份以及女贞子细粉1~2份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
2.一种增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)原料称取:按重量份数计,分别称取如下原料组分,鲜铁皮石斛10份,黄芪2份,女贞子1.6份,西洋参1份;
(2)铁皮石斛鲜条的处理:取步骤(1)称取的铁皮石斛鲜条洗净、沥干后,投入中药粉碎机中粉碎成1-2cm长的铁皮石斛小段;将铁皮石斛小段进行真空冷冻干燥,再进行超微粉碎,得到铁皮石斛细粉;
(3)西洋参的处理:取步骤(1)称取的西洋参置于温度小于60℃的热风循环干燥箱中进行干燥,再进行超微粉碎,得到西洋参细粉;
(4)醇提:
取步骤(1)称取的黄芪,加入黄芪重量8~10倍的78~82%乙醇,搅拌回流提取2~3次,每次1.2~1.8小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到黄芪醇提清液,将黄芪醇提清液减压真空浓缩至黄芪醇提清膏备用;黄芪醇提药渣另保存;
取步骤(1)称取的女贞子,加入女贞子重量7~9倍的68~72%乙醇,搅拌回流提取2~3次,每次1.8~2.2小时,合并二次回流液,回流液静置12小时以上,吸取上清液,得到女贞子醇提清液,将女贞子醇提清液减压浓缩成女贞子醇提清膏备用;女贞子醇提药渣另保存;
(5)水提:
取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量8~10倍的水煎煮2~3次,每次1.2~1.8小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压真空浓缩成黄芪水提清膏;
取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量8~10倍的水煎煮2~3次,每次1.8~2.2小时,合并二次煎煮液,煎煮液静置12小时以上,吸取上清液,再将上清液减压浓缩成女贞子水提清膏;
(6)干燥粉碎:
将黄芪醇提清膏和黄芪水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成黄芪干膏,再粉碎成黄芪细粉;
将女贞子醇提清膏和女贞子水提清膏混合均匀后,置于温度小于60℃下真空干燥成女贞子干膏,再粉碎成女贞子细粉;
(7)配方:
取铁皮石斛细粉1~2份、西洋参细粉1~2份、黄芪细粉1~2份以及女贞子细粉1~2份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
3.如权利要求2所述的增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于,所述黄芪醇提清膏、女贞子醇提清膏、黄芪水提清膏以及女贞子水提清膏在60℃时的相对密度为1.15~1.25。
4.如权利要求2所述的增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述醇提黄芪的工艺条件如下:加入黄芪重量10倍的80%乙醇,搅拌回流提取二次,每次1.5小时。
5.如权利要求2所述的增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述醇提女贞子的工艺条件如下:加入女贞子重量8倍的70%乙醇,搅拌回流提取二次,每次2小时。
6.如权利要求2所述的增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于,步骤(5)所述水提的工艺条件为:取黄芪醇提药渣,加黄芪醇提药渣重量10倍的水煎煮二次,每次1.5小时。
7.如权利要求2所述的增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于,步骤(5)所述水提的工艺条件为:取女贞子醇提药渣,加女贞子醇提药渣重量10倍的水煎煮二次,每次2小时。
8.如权利要求2所述的增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于,步骤(7)所述配方的工艺条件如下:取铁皮石斛细粉1份、西洋参细粉1份、黄芪细粉1份以及女贞子细粉1份,混合均匀,得到所述增强免疫力的中药组合物。
9.如权利要求2所述增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于:步骤(6)所述黄芪细粉和女贞子细粉为过80~140目筛得到的细粉。
10.如权利要求2所述增强免疫力的中药组合物的制备方法,其特征在于:所述的中药组合物按照常规制备技术制备成片剂、颗粒剂、硬胶囊或软胶囊。
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