CN103550398B - 一种缓解疲劳的组合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种组合物，原料包括如下重量份的药材：马鹿茸120～240重量份，淫羊藿300～600重量份，龟板400～800重量份，人参120～240重量份，枸杞子240～480重量份，覆盆子240～480重量份。本发明还提供所述组合物的制备方法及在制备缓解疲劳的药物、保健食品中的应用。本发明所述组合物标本兼顾，针对疲劳、亚健康的病因病机，全面调理，改善代谢环境，纠正代谢紊乱，综合调整人体的机能状态，使于疲劳状态的亚健康人群迅速改善身体不适症状。

Description

一种缓解疲劳的组合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药学领域，具体涉及一种缓解疲劳的组合物及其制备方法和医药用途。

背景技术

随着社会的发展、竞争的日趋激烈以及生活节奏的加快，人们所承受的工作、生活压力也越来越大，由此而引发的一种“亚健康状态”——疲劳在人群中的发生率也呈现出不断上升的趋势。据世界卫生组织调查，全球约有35%以上的人处于疲劳状态，中年男性人群疲劳状态者更高达60～75%。现代社会完全符合健康标准者约占人群总数的15%左右，其他85%左右的人群属于亚健康人群。在我国大规模的人口流行病学调查中，发现超过一半的人群报告有疲劳症状。此外，我国的青少年群体也存在着疲劳表现。一项对北京某中学毕业班学生的调查结果表明96.59%的人有下午打瞌睡的现象，81.23%的人有头昏脑胀、记忆力下降等现象。疲劳虽然不像癌症、心脏病那样直接而迅速地造成死亡，但长期的机体疲劳和精神疲劳会引发神经系统、消化系统及循环系统的功能紊乱，从而引起失眠、心律不齐、消化不良、内分泌失调，性能力下降，甚至引发心脑血管疾病。它作为一种危害现代人健康的隐形杀手，已严重影响了人们的工作和生活，成为困扰很多人的健康问题。因此，探索疲劳干预的有效方法和途径就具有深远的意义。

据中国保健协会市场工作委员会数据，截止到2005底，我国共批准“抗疲劳”，“缓解体力疲劳”保健食品1260种，其中国产保健食品1214种，进口保健食品46种。很多产品同时申报了两种以上的保健功能，多集中在提高免疫力、耐缺氧上。上述“抗疲劳”，“缓解体力疲劳”保健食品大致分为以下几类：

第一是补充能量。通过补充运动中所消耗的营养素来达到维持机体正常生理功能，解除疲劳的目的。适应人群较局限。

第二是补充人体必需的维生素和微量元素。服用过量，会引起维生素中毒。

第三是通过提高机体器官的功能，特别是循环系统的功能，加速体内代谢物质的清除、排出，来达到抗疲劳目的。市场上有代表性的，如张大宁牌茸参健酒，具有温肾助阳之功，可改善肾脏功能，促进性腺分泌，提高性机能，但妇女、阴虚火旺者、酒精过敏者，心脑血管患者、肝肾功能不全者不适宜使用。另外，五洲牌洋参含片，原料为单一西洋参，功效成份人参皂苷；还有多种纯天然植物组成的产品，御和坊牌海狗丸，其功效成份为海狗、枸杞子、益智、山药、蚕蛹、肉桂；多宝牌强力胶囊，主要原料：黄芪、山药、党参、杜仲。

但是，疲劳发生往往是综合因素导致的，各个环节也紧密相连，仅仅是针对其中某一个环节来抗疲劳是不全面的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新的用于缓解疲劳的组合物。该组合物具有补肾壮阳，填精补髓之功，能够改善代谢环境，纠正代谢紊乱，综合调整人体的机能状态，从而达到恢复健康体质的目的，使处于疲劳状态的亚健康人群改善身体不适症状。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一种组合物，原料包括如下重量份的药材：

马鹿茸120～240重量份，淫羊藿300～600重量份，龟板400～800重量份，人参120～240重量份，枸杞子240～480重量份，覆盆子240～480重量份。

优选的，所述原料包括如下重量份的药材：

马鹿茸150～210重量份，淫羊藿375～525重量份，龟板500～700重量份，人参150～210重量份，枸杞子300～420重量份，覆盆子300～420重量份。

优选的，马鹿茸与人参的重量份相同。

优选的，枸杞子与覆盆子的重量份相同。

更优选的，马鹿茸与人参的重量份相同，枸杞子与覆盆子的重量份相同，且枸杞子的重量份是马鹿茸的两倍。

作为本发明的一个优选实施方案，所述原料包括如下重量份的药材：

马鹿茸180重量份，淫羊藿450重量份，龟板600重量份，人参180重量份，枸杞子360重量份，覆盆子360重量份。

本发明的另一个目的在于提供所述的组合物的制备方法，包括如下步骤：

I.所述重量份的人参和淫羊藿用乙醇溶液回流提取两次，过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩至60～70℃测定相对密度1.15～1.25的清膏，得到乙醇提取浓缩液；

II.步骤I得到的药渣与所述重量份的其它药材加水煎煮提取三次，过滤，合并滤液，浓缩至60～70℃测定相对密度1.15～1.25的清膏，与步骤I得到的乙醇提取浓缩液合并，减压干燥，干膏粉碎成细粉，加入药学上可以接受的辅料，制备成临床上可以接受的制剂，即得。

优选的，所述的制备方法，包括如下步骤：

I.所述重量份的人参和淫羊藿用乙醇体积百分浓度为70%的酒精溶液回流提取两次，每次提取1.5小时，每次所述酒精的体积为提取药材重量的8倍；120目筛网过滤，合并滤液，-0.07Mpa，70℃减压回收乙醇至60～70℃测定相对密度1.18～1.22，得到乙醇提取清膏；

II.步骤I得到的药渣与所述重量份的其它药材加水煎煮提取三次，每次1.0小时，每次水的体积为煎煮药材重量的8倍；120目筛网过滤，合并滤液，-0.07Mpa，70℃浓缩至60～70℃测定相对密度1.18～1.22的清膏，与步骤I得到的乙醇提取清膏合并，70℃，压力-0.08Mpa下减压干燥；相对湿度＜57%的条件下，干膏粉碎成细粉，加入微晶纤维，混合均匀，装胶囊，即得；其中，干浸膏粉与微晶纤维的重量比为98:2。

本发明还提供上述的制备方法制备得到的组合物。

此外，本发明还有一个目的在于提供上述的组合物，和通过所述制备方法制备得到的组合物在制备缓解疲劳的药物、保健食品中的应用。

本发明所述重量份，根据实际生产制备的规模不同，可以是克、公斤等。

本发明所述药学上可以接受的辅料，包括（1）稀释剂，例如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维、无机钙盐（如硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等）、甘露醇等、植物油、聚乙二醇等；（2）粘合剂，例如蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等；（3）崩解剂，例如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等；（4）润滑剂，例如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等。

本发明所述临床上可以接受的制剂，主要是口服制剂，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液等。

本发明人参和淫羊藿的提取溶剂，为安全考虑，优选使用食用酒精。

本发明所述组合物遵循传统中医药理论“审证求因”、“随证立法”的原则，采用君、臣、佐、使药味配伍。方中马鹿茸，甘、咸，温，归肾、肝经，具有壮肾阳，益精血，强筋骨的功能，淫羊藿，味辛、甘，性温，入肝、肾经，可补肾助阳。二者合用以补肾阳、益阴精。龟板，咸、甘，凉。归肝、肾、心经，具有滋阴养血的功能，枸杞子味甘、性平，入肝肾经，具有滋补肝肾、明目、益面色、长肌肉、坚筋骨的功能；二者合用以通任脉而养阴，补阴血。人参，甘、微苦，微温，归脾、肺、心、肾经，大补元气，生津养血，气足则精固。覆盆子甘、酸，性平，益肾固精，综观全方，药味配伍精当，共奏补肾壮阳，填精补髓之作用。

药理学和临床研究结果显示，本发明所述组合物标本兼顾，不是单方面抗疲劳，而是针对其病因病机，全面调理，改善代谢环境，纠正代谢紊乱，综合调整人体的机能状态，使于疲劳状态的亚健康人群迅速改善身体不适症状。

本发明通过下述研究，对所述制备方法进行了优化研究。

（一）人参、淫羊藿等二味醇提取条件的优选：

正交试验法对醇提取工艺的技术条件进行优选确定。通过预实验表明，乙醇浓度、加醇量、回流时间和提取次数这四个因素对该人参、淫羊藿主要成分的提取效果有影响，在此基础上，采用正交实验法，以乙醇浓度、加醇量、回流时间和提取次数作为考察醇提取效果的主要因素，采用L₉（3⁴）正交表进行试验，每个因素各取三个水平，以总皂苷的含量为考察指标。其因素水平表见表1，正交试验安排及结果见表2。

含量测定方法：采用紫外—可见分光光度法测定样品中总皂苷含量，具体方法参照《保健食品检验与评价技术规范》中总皂苷测定法。

试样处理：称取下表正交试验排表各试验号的浸膏粉约1.0g，精密称定，置于100mL容量瓶中，加少量水，超声3min，再用水定容至100mL，摇匀，放置，吸取上清夜1.0mL进行柱层析。

柱层析：用10mL注射器作层析管，内装3cm大孔吸附树脂，上加1cm中性氧化铝。先用25mL70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精密加入1.0mL已处理好的试样溶液，用25mL水洗柱，弃去洗脱液，用25mL70%乙醇洗脱人参皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，以此作显色用。

显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL5%香草醛—冰醋酸溶液，转到蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.8mL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，60℃水浴上加热10min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰醋酸溶液5mL，摇匀后，以1cm比色池于560nm波长处与标准管一起进行比色测定。

标准管：吸取人参皂苷Re标准溶液（2.0mg/mL）100μL于蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），以下操作从“层析柱”起，与试样相同，测定吸光度，计算，即得。

表1 因素水平表

表2 正交试验排表及结果

上述数据进行方差分析，结果见表3。

表3 总皂苷方差分析表

F（2,2）=19

结果分析：总皂苷含量的方差分析结果表明：因素A和C对总皂苷含量有显著性影响，其它因素则影响不显著，影响大小依次为C＞A＞B＞D。根据极差分析结果，其优选工艺为A₃B₂C₂D₃，即8倍量的70%的乙醇，提取2次，每次2小时。由表2极差结果表明，因素D（提取时间）为1.5h和2h时，总皂苷含量差别较小，由表3方差分析结果表明，D因素在四个因素当中影响最小，且无显著性，故结合大生产的效率与成本，最终将最优提取条件确定为：8倍量的70%的乙醇，提取2次，每次1.5小时，经验证实试验表明，确定的工艺参数合理可行。

（二）醇提后料渣与其余马鹿茸等四味原料水提实验研究：

为了使提取工艺更趋合理，采用正交试验法对人参、淫羊藿经醇提后的料渣与其余四味加水煎煮提取工艺的技术条件进行优选，方法与结果如下：

影响水提取工艺的主要因素有浸泡时间、加水量、煎煮时间和提取次数等四个因素，在预试验的基础上，采用L₉（3⁴）正交表进行试验，每个因素各取三个水平进行实验。其因素水平表见表4，正交试验安排及结果见表6。

表4 因素水平表

考察指标的确定：枸杞子、覆盆子等所含化学成分中主要为多糖类物质，而多糖类物质大都易溶于水。故以总多糖的含量为主要考察指标来确定水提取最优工艺条件。

总多糖含量的测定：

标准曲线的制备：精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品约25mg，加蒸馏水溶解并定容至250mL，即得10μg/mg的葡糖糖标准溶液。

标准曲线：精密吸取标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，分别加蒸馏水至2.0mL，精密加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5.0mL，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出后迅速冷却至室温，于波长490nm测定吸收值，求回归方程，绘制标准曲线，数据见表5。

回归方程：A=0.0609C+0.0302，回归系数r=0.9962。

表5 标准曲线测定值

供试品溶液的制备：精密称取各试验号的浸膏粉约3～3.5g，置于烧杯中，加入约30mL蒸馏水，摇匀后，超声提取20min，放置，冷却，定容至50mL。过滤，精密量取滤液5mL，加入95%乙醇27mL（含醇量80%），放置15min，析出沉淀。过滤，沉淀用80%乙醇洗涤两次，每次10mL。过滤，滤液及洗液弃去，滤渣及滤纸用适量蒸馏水溶解（可适当加热），趁热过滤，用蒸馏水洗涤滤器合并滤液及洗液，定容至250mL，即得样品溶液。

供试品溶液的测定：精密吸取1.0mL样品溶液置于试管中，精密加入蒸馏水1.0mL、5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5.0mL，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出后迅速冷却至室温，于波长480nm测定吸收值，计算总多糖含量。

表6 正交试验排表及结果

以上数据进行方差分析，结果见表7。

结果分析

总多糖含量的方差分析结果表明：因素C对总多糖含量有显著性影响，其它因素则影响不显著，影响大小依次为C＞B＞D＞A。根据极差分析结果，优选的最佳工艺为A₂B₂C₃D₁，其中A因素在四因素中影响最小，且无显著性，故可不考虑浸泡，调整后的最优水提取工艺参数为：醇提后药渣与其余马鹿茸等四味药加8倍量水，提取3次，每次1小时。经验证试验表明所确定的工艺参数合理可行。

表7 总多糖方差分析结果

F（2,2）=19

（三）精制、浓缩与干燥工艺的优选

精制工艺研究：上述醇提取液和水煎液内含成分大多为小分子物质，中试研究其提取部分出膏率平均约为20.8%，故为了尽可能保存功效成分，同时结合大生产实际，我们选择了直接过滤的方法进行精制。在生产中其提取液经120目筛网滤过，即可。

浓缩：浓缩常用方法有常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发等，但若采用常压蒸发不仅费时，而且有可能对方中某些热不稳定的成分有破坏作用，故在工业化生产中，宜采用省时、省电，且不易引起有效成分破坏的浓缩方法，这样减压浓缩、薄膜浓缩以及多效蒸发为首选方法，在实际中试生产中，我们采用了减压浓缩法，浓缩条件为：-0.07Mpa，70℃。

干燥：本品提取物中含有皂苷，黄酮，多糖等成分，这些成分大多比较稳定，故为了便于操作，本产品采用了真空减压干燥法。并对干燥时物料的相对密度进行了考察，通过实验室小试及中试验证表明进入干燥工序时浓缩液的相对密度控制在约1.20（65℃），此时干燥所需时间较短，而且干燥物膨松易粉碎。其干燥条件为：-0.08Mpa，温度70℃。

（四）胶囊剂成型性研究：通过上述提取工艺得到物品的干浸提物，其出膏率平均约为20.8%。

剂型的优选过程及依据：本发明所述组合物的提取物味苦、酸涩，为了使成品的功效稳定，又便于适宜人群服用、携带及贮存，优选胶囊剂这一剂型。胶囊剂具有一定的密闭性，又可避光，通过质量检测及稳定性考察，囊材并不影响内容物的功效发挥，而且成品的稳定性良好。

制剂配方设计及成型工艺研究：胶囊剂原料为全物品的干浸提物，有醇提物又有水提物，减压干燥后，其物料较易吸潮，故为了便于分装，保证胶囊装量，防止吸潮结块影响功能，需添加适量辅料以改善料粉的流动性及吸湿性。分别选取淀粉、糊精、微晶纤维素与原粉进行不同比例的配比，以各配方的吸湿百分率和流动性为指标，确定辅料品种及用量。

拟设计如下四个配方进行试验：

配方1：浸膏粉98g，可溶性淀粉2g。

配方2：浸膏粉98g，糊精2g。

配方3：浸膏粉98g，微晶纤维素2g。

配方4：浸膏粉96g，微晶纤维素4g。

将上述配方分别混合均匀后，作为内容物，进行吸湿性及流动性考察，并与原浸膏粉进行比较，结果如下：

吸湿百分率的测定：将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器放入于25℃恒温培养箱内恒温24h，此时干燥器内的相对湿度为75%。在已恒重的称量瓶底部放入厚约2mm的料粉，准确称量后置于氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器内（称量瓶盖打开），于25℃恒温培养箱中保存，定时称量，按下式计算吸湿百分率。结果见表8。

表8 不同配方料粉的吸湿百分率

上述表8显示，以吸湿率为指标，以配方3和4为佳。根据配方3在不同时间的吸湿率绘制吸湿曲线，见图1。图1显示，配方3能在48小时内保持较低的吸湿率。

下面就配方3、4和浸膏粉在粉末流动性方面以休止角为指标进行比较。

休止角测定：测定休止角的方法有多种，本实验采用固定漏斗法，将3只漏斗上下串联并固定于水平放置的坐标纸上1cm的高度处，小心将不同配方的料粉沿漏斗壁倒入最上的漏斗中直到最下面漏斗形成的料粉圆锥体尖端接触到漏斗口为止，由坐标纸测出圆锥底部的直径（反复3次），计算休止角：tg=H/R，结果见表9。

表9 不同处方药粉的休止角（n=3）

由表9可知，通过对不同配方料粉的休止角测定，结果表明配方3和4的搅动性均优于原粉，而二者无明显差异，结合吸湿率的测定结果，优选胶囊剂配方组成为：

浸膏粉98g，微晶纤维素2g。

该配方在用辅料量较少的情况下，即可起到助流及防吸潮的作用。

成型工艺：取浸膏粉441g，加入9g微晶纤维素，混匀，装0号胶囊1000粒，即得。

胶囊型号的选择：本品有效剂量为成人每日服用2.7g，若按0.45g装，可装6粒。取0号及1号胶囊进行手工装胶囊试验，结果见表10。

表10 不同型号囊壳的装量试验

由此，为了保证有效剂量，同时服用胶囊粒数又不至于太多，本品宜选择0号胶囊。

为了进一步优化制剂生产条件，保证成品质量，测定了胶囊剂内容物的临界相对湿度（CRH）

CRH测定方法：将按重量比为98:2的干浸膏粉与微晶纤维混合均匀，干燥至恒重后，在已恒重的称量瓶底部放入厚约2mm的料粉，准确称量后置于分别盛有7种不同浓度硫酸或不同盐的过饱和溶液的干燥器内（称量瓶盖打开），于25℃恒温培养箱中保持84小时后称量，计算吸湿百分率。结果见表11。以相对湿度数据为横坐标，粉末吸湿率为纵坐标，相对湿度-吸湿率关系曲线，见图2。

表11 临界相对湿度（CRH）测定结果（n=3）

作相对湿度-吸湿率关系曲线前段与后段的切线，两直线的交点所对应的相对湿度即为该料粉的临界相对湿度。按照上述方法，得到本发明所述胶囊剂内容物的临界相对湿度约为57%。在生产本制剂时，尤其在后续干燥粉碎及成型过程中，车间环境的相对湿度应控制在57%以下，可采用除湿机来除去空气中所含水分，降低空气湿度。

中试生产研究：中试研究是对实验室工艺合理性研究的验证与完善，是保证制剂（制法）达到生产可操作性的必经环节。所以进行了如下三批样品的中试研究，结果表明本发明所述胶囊剂的制备方法适合工业化生产，可操作性强，所得产品按胶囊制剂通则项下检查，结果符合要求。三批中试生产验证数据见表12。

表12 三批中试生产验证数据

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了3号配方的时间-吸湿率曲线。

图2显示了胶囊剂内容物的相对湿度-吸湿率关系曲线。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1 一种缓解疲劳的组合物

原料组成（单位：克）：

马鹿茸180，淫羊藿450，龟板600，人参180，枸杞子360，覆盆子360。

通过如下方法制备：

I.人参180g和淫羊藿450g用乙醇体积百分浓度为70%的食用酒精溶液回流提取两次，每次提取1.5小时，每次用5.04L所述食用酒精；120目筛网过滤，合并滤液，70℃，压力-0.07Mpa下，减压回收乙醇至65℃时测定相对密度约1.20，得到乙醇提取清膏；

II.步骤I得到的药渣与马鹿茸180g，龟板600g，枸杞子360g，覆盆子360g加水煎煮提取三次，每次1.0小时，每次用17.04L水；120目筛网过滤，合并滤液，70℃，压力-0.07Mpa下，减压浓缩至65℃相对密度约1.20的清膏，与步骤I得到的乙醇提取清膏合并，70℃，压力-0.08Mpa下，减压干燥，得到干膏442g，粉碎成细粉，过100目筛，加入过100目筛的微晶纤维9g，混合均匀，装胶囊，0.45g/粒，共制得1000粒。

推荐用量：2粒/次，3次/日。

实施例2 一种缓解疲劳的组合物

原料组成（单位：克）：

马鹿茸150，淫羊藿375，龟板500，人参150，枸杞子300，覆盆子300。

通过如下方法制备：

I.人参150g和淫羊藿375g用乙醇体积百分浓度为70%的食用酒精溶液回流提取两次，每次提取1.5小时，每次用4.20L所述食用酒精；120目筛网过滤，合并滤液，70℃，压力-0.07Mpa下，减压回收乙醇至65℃时测定相对密度约1.15，得到乙醇提取清膏；

II.步骤I得到的药渣与马鹿茸150g，龟板500g，枸杞子300g，覆盆子300g加水煎煮提取三次，每次1.0小时，每次用水14.20L；120目筛网过滤，合并滤液，浓缩至65℃时测定相对密度约1.25的清膏，与步骤I得到的乙醇提取清膏合并，70℃，压力-0.08Mpa下，减压干燥，得到干膏424g，粉碎成细粉，过100目筛，加入过100目筛的微晶纤维8g，制粒，压片，0.3g/片，共制得1430片。

推荐用量：3片/次，3次/日。

实施例3 一种缓解疲劳的组合物

原料组成（单位：克）：

马鹿茸210，淫羊藿525，龟板700，人参210，枸杞子420，覆盆子420。

通过如下方法制备：

I.人参210g和淫羊藿525g用乙醇体积百分浓度为70%的食用酒精溶液回流提取两次，每次提取1.5小时，每次用5.88L所述食用酒精；120目筛网过滤，合并滤液，70℃，压力-0.07Mpa下，减压回收乙醇至65℃相对密度约1.22，得到乙醇提取清膏；

II.步骤I得到的药渣与马鹿茸210g，龟板700g，枸杞子420g，覆盆子420g加水煎煮提取三次，每次1.0小时，每次用水19.88L；120目筛网过滤，合并滤液，70℃，压力-0.07Mpa下浓缩至65℃相对密度约1.19的清膏，与步骤I得到的乙醇提取清膏合并，70℃，压力-0.08Mpa下，减压干燥，得到干膏446g，粉碎成细粉，过100目筛，加入过100目筛的微晶纤维10g，制粒，分装，每袋0.9g，共制得505袋。

推荐用量：1袋/次，3次/日。

试验例1 小鼠负重游泳试验

1.试验依据：卫生部《保健食品检验与评价技术规范》2003年版。

2.试验用药物

1）受试药物：按照实施例1所述方法制备得到的包括辅料的组合物

2）对照药：蒸馏水

3.试验动物：18-22g雄性昆明种小鼠

4.试验方法：

剂量分组：每个实验，按推荐日摄入量的30倍、20倍、10倍设计，分为三个实验组：1.35g/kgBW、0.90g/kgBW、0.45g/kgBW，另设对照组给予对照药。分别取受试药物6.75g、4.50g、2.25g，加蒸馏水至100mL，样品配制浓度分别为0.068g/mL、0.045g/mL、0.022g/mL。灌胃方式给药，按体重调整样品灌胃容量（灌胃容量按20mL/kgBW计算），每天灌胃1次，连续30天。末次给予样品后分别测定各项缓解体力疲劳功能指标。

实验内容：

1）负重游泳时间测定：末次给予样品30min后，称体重，每只鼠尾根部负荷5%体重铅皮，置于水深30±1cm、水温25±1℃游泳箱中游泳，不时搅动水，使小鼠四肢保持运动。记录自游泳开始至死亡时间（min）。

2）肝糖原测定：末次给予样品30min后处死，取肝脏，清洗吸干，准确称取75mg。加入碱液225μL，沸水浴煮20min，流水冷却。加蒸馏水7.2mL，制备成1%肝糖原检验液。空白管加蒸馏水1.0mL，测定管加蒸馏水0.9mL及1%肝糖原检测液0.1mL，标准管加0.01mg/mL标准液1.0mL，各管分别加显色液2.0mL，混匀后置沸水浴中煮5min，冷却后于波长620nm处比色，1cm光径，用空白管调零，测定各管OD值，计算肝糖原含量，其中标准管含量为0.01mg；稀释倍数为10；测得的葡萄糖含量换算成糖原含量的系数为1.11。

3）血乳酸测定：末次给予样品30min后，置于水深30±1cm、水温30±1℃游泳箱中游泳，不时搅动水，使小鼠四肢保持运动。第10min取出。分别于游泳前、游泳后休息20min从眼内眦准确采血20μL，加入40μL破膜液中，立即充分振荡破碎细胞，用乳酸仪测定血乳酸含量，计算血乳酸曲线下面积。

4）血清尿素测定;末次给予样品30min后，置于水深30±1cm、水温30±1℃游泳箱中游泳，不时搅动水，使小鼠四肢保持运动。第90min取出，休息60min后摘眼球采血。置4℃冰箱3h，血凝固后2000r/min离心15min，取血清备用。用Beckman-Coulter CX5PRO型全自动生化分析仪测定血清尿素含量。

数据处理：在Excel2003平台上的毒理检验数据录入统计报告一体化自动分析程序中，各种统计学检验方法同事自动进行统计分析，并将分析得到的相关数据自动传输至检验报告表格的指定位置中。对计量资料，做多样本方差齐性检验（Bartlett法）和各实验组与溶剂对照组的双样本方差齐性检验。方差齐，多样本比较采用单因素方差分析，各实验组与溶剂对照组比较用最小显著差法、Dunnett法、新复极差法；方差不齐，采用近似F检验和双样本异方差t检验或进行变量转换（百分率资料用反正弦函数转换后进行F检验）或采用铁和检验（Wilcoxon两样本比较法）。

实验结果：

1）小鼠负重游泳试验结果：由表13可见，各实验组体重、体重增重与对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；由表14可见，0.90g/kgBW、0.45g/kgBW实验组游泳时间显著高于对照组（P＜0.05）。

表13 小鼠负重游泳试验体重测量结果（单位：g）

表14 小鼠负重游泳试验游泳时间测定结果

2）小鼠肝糖原测定结果：由表15可见，各实验组体重、体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；由表16可见，1.35g/kgBW、0.90g/kgBW实验组小鼠肝糖原含量显著高于样品溶剂对照组（P＜0.05）。

表15 小鼠肝糖原试验体重测量结果（单位：g）

表16 小鼠肝糖原含量测定结果

3）小鼠血乳酸测定结果：由表17可见，各实验组体重、体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；由表18可见，各实验组小鼠血乳酸曲线下面积与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。

表17 小鼠血乳酸试验体重测量结果（单位：g）

表18 小鼠血乳酸含量测定结果

4）小鼠血清尿素的测定结果：由表19可见，各实验组小鼠体重、体重增重与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；由表20可见，各实验组血清尿素含量显著低于样品溶剂对照组（P＜0.05）。

表19 小鼠血清尿素试验体重测量结果（单位：g）

表20 小鼠血清尿素含量测定结果

5.试验结果

受试药物0.90g/kgBW、0.45g/kgBW能延长负重小鼠的游泳时间，1.35g/kgBW、0.90g/kgBW能增加小鼠肝糖原含量。各实验组能减少小鼠血清尿素含量，各实验组对小鼠血乳酸曲线面积作用不明显；对实验动物的体重和体重增重无明显影响。

6.结论

药效实验结果提示，本发明所述组合物能够有效提高身体耐力，同时对体重、体重增量没有明显影响，且可以减轻肝脏工作负担，增加肝糖原含量，从而有效缓解疲劳。

试验例2 毒性试验

受试药物：按照实施例1所述方法制备得到的包括辅料组合物

试验依据：卫生部《保健食品检验与评价技术规范》2003年版。

1、大、小鼠急性经口毒性试验

动物种系：北京华阜康生物科技股份有限公司繁殖的清洁级昆明种小鼠和SD大鼠。

试验方法：最大耐受剂量法

给药剂量：24.00g/kgBW的剂量（相当于推荐日摄入量的533倍）

试验过程：

小鼠急性毒性试验：选用18～22g健康小鼠20只，雌雄各10只，试验前小鼠隔夜禁食16小时，不限制饮水。以24.00g/kgBW的剂量（相当于推荐日摄入量的533倍）进行试验。称取受试药物60.00g，加蒸馏水至150mL，配制成浓度为0.400g/mL的溶液，灌胃方式给药，灌胃容量为20mL/kgBW，灌胃3次，每次间隔4小时，连续观察14天，如不引起小鼠死亡，确定最大耐受剂量（MTD）。

大鼠急性毒性试验：选用180～220g健康大鼠20只，雌雄各10只，试验前大鼠隔夜禁食16小时，不限制饮水。以24.00g/kgBW的剂量（相当于推荐日摄入量的533倍）进行试验。称取受试药物60.00g，加蒸馏水至150mL，配制成浓度为0.400g/mL的溶液，灌胃方式给药，灌胃容量为20mL/kgBW，灌胃3次，每次间隔4小时，连续观察14天，如不引起大鼠死亡，确定最大耐受剂量（MTD）。

试验结果：

小鼠急性毒性试验结果：由表21-1和表21-2可见，试验期间动物体重变化情况。两种性别小鼠在观察期间进食、饮水、活动正常，无中毒表现，皮毛光亮。无死亡。受试药物对两种性别小鼠的经口最大耐受剂量（MTD）均大于24.00g/kgBW。根据急性毒性分级标准，样品属无毒级。

表21-1 小鼠急性经口毒性试验动物体重、体重增重检查结果

表21-2 小鼠急性毒性试验结果

大鼠急性毒性试验结果：由表22-1和表22-2可见，试验期间动物体重变化情况。两种性别大鼠在观察期间进食、饮水、活动正常，无中毒表现，皮毛光亮。无死亡。受试药物对两种性别大鼠的经口最大耐受剂量（MTD）均大于24.00g/kgBW。根据急性毒性分级标准，样品属无毒级。

表22-1 大鼠急性经口毒性试验动物体重、体重增重检查结果

表22-2 大鼠急性毒性试验结果

2、三项遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）

2.1Ames试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株进行试验。根据毒性测定结果，试验设5个剂量组：5.000mg/皿、1.000mg/皿、0.200mg/皿、0.040mg/皿、0.008mg/皿。分别取受试药物2500mg、500mg、100mg、20mg、4mg，均分别加蒸馏水至50mL，配制成浓度为50.0mg/mL、10.0mg/mL、2.0mg/mL、0.4mg/mL、0.08mg/mL的溶液，作为试验用样品溶液。上述溶液经高压灭菌（100℃、20min）后使用。同时设阳性对照组（2-氨基芴,1.8-二羟蒽醌,敌克松,叠氮钠）、阴性对照组（蒸馏水）和未处理对照组。在顶层培养基中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL试验用样品溶液或蒸馏水和0.5Mls-9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上，每个剂量3个平皿。在37±1℃培养48h，计数每皿回变菌落数。剂量组回变菌落数与样品溶剂对照组相比增加一倍以上，并具有剂量—反应关系者则判定为阳性。整套试验在相同条件下重复做一次。

试验结果：两次实验结果显示，阴性对照组回变菌落数未超过未处理对照组回变菌落数1倍以上，受试药物各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照组回变菌落数1倍以上，亦无剂量-反应关系，对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，在加与不加肝微粒体酶活化系统时，结果为阴性，而且试验结果可重复。

2.2小鼠骨髓细胞微核试验：采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验。用体重25～30g小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。试验设3个剂量组：4.50g/kgBW（相当于推荐日摄入量的100倍）、2.25g/kgBW、1.12g/kgBW。分别取受试药物22.50g、11.25g、5.60g，分别加蒸馏水至100mL，配制成浓度为0.225g/mL、0.112g/mL、0.056g/mL的样品溶液，使用时新鲜配制。以40mg/kgBW剂量的环磷酰胺（腹腔注射）为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，灌胃容量为20mL/kgBW，末次给样品6h后，颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在油镜下，每只动物观察1000个嗜多染红细胞（PCE），计数含微核PCE数，计算微核细胞率（以千分率计）。每只动物观察200个PCE，计数成熟红细胞数（NCE）,计算PCE/NCE。并进行统计处理。

试验结果：受试药物各剂量组两种性别小鼠骨髓嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值（PCE/NCE）在1.44～1.55之间，未见受试药物对两种性别小鼠的骨髓细胞有明显抑制作用。受试药物各剂量组两种性别小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与样品溶剂对照组比较，有显著性差异（P＜0.01）。未见受试药物对两种性别小鼠骨髓细胞染色体有明显损伤作用。

2.3小鼠精子畸形试验：用体重25～35g的性成熟雄性小鼠25只，随机分为5组。试验设3个剂量组：4.50g/kgBW（相当于推荐日摄入量的100倍）、2.25g/kgBW、1.12g/kgBW。分别取受试药物22.50g、11.25g、5.60g，分别加蒸馏水至100mL，配制成浓度为0.225g/mL、0.112g/mL、0.056g/mL的样品溶液，使用时新鲜配制。以40mg/kgBW剂量的环磷酰胺（腹腔注射）为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，灌胃方式给药，灌胃容量为20mL/kgBW，每日灌胃一次，连续5天，末次灌胃后30天处死动物，取附睾制片，伊红染色，每只动物观察计数1000个结构完整的精子，计数畸形精子数，计算精子畸形率（以百分率计），并进行统计处理。

试验结果：受试药物各剂量组小鼠精子畸形率与样品溶剂对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；而环磷酰胺组小鼠精子畸形率与样品溶剂对照组比较，有显著性差异（P＜0.01）。未见受试药物对雄性小鼠生殖细胞有明显损伤作用。

2.4结论

受试药物的三项遗传毒性试验结果都为阴性，说明受试药物没有遗传毒性。

3、大鼠30天喂养试验

采用体重为75.21±3.94g大鼠80只，雌雄各半。按推荐日摄入量的100倍、50倍、25倍设计，试验设3个剂量组：4.50g/kgBW、2.25g/kgBW、1.12g/kgBW和基础饲料对照组，采用饲料逐级放大混匀法掺入样品，分别取受试药物900g、450g、224g，均匀掺入基础饲料至20kg，样品掺入量分别为4.50%、2.25%、1.12%，单笼饲养，每天观察并记录动物的一般表现，中毒表现和死亡情况。每周记录一次体重和两次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率；在试验末期禁食16h后摘眼球取血，测定血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及分类、血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯等；断头放血后对所有动物进行大体检查，称量肝、肾、脾、睾丸等脏器绝对重量和计算脏体比，并对主要器官固定保存，对各剂量组动物大体检查未发现明显病变时，进行高剂量组和对照组的肝、肾、胃、肠、脾、睾丸、卵巢的组织病理学检查，并进行统计学处理。

（1）体重、体重增重、摄食量、食物利用率检查结果：两种性别大鼠各实验组、各时间段体重、体重增重、摄食量、食物利用率、总体重增重、总摄食量、总食物利用率与对照组比较、无显著性差异（P＞0.05）。试验期间大鼠活动自如、毛发光亮、进食饮水、大小便正常。

（2）脏器重量和脏器系数检查结果：由表23-1和表23-2可见，各实验组两种性别大鼠的肝、肾、脾、睾丸重及其脏器系数与对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。

（3）血液生化学检查结果：由表24-1和表24-2可见，各实验组两种性别大鼠的各项血液生化学检验指标与对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。

（4）血液细胞学检查结果：两种性别大鼠各实验组的各项血液细胞学检验指标与对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。

(5)组织病理学检查结果：

大体检查：共检查实验大鼠80只，雌雄各半。剖检后肉眼观察，心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、睾丸（卵巢）、脑等主要脏器的颜色、性状、大小等均未见明显异常。

镜下检查：共检查高剂量实验组和对照组实验大鼠40只，雄、雌各半。

肝脏：被摸完整，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝细胞未见明显变性、坏死等改变，局部汇管区偶见少量炎性细胞。其中，对照组雄性大鼠有1例局部汇管区见炎性细胞浸润；高剂量实验组雌性大鼠有1例局部汇管区见炎性细胞浸润。

肾脏：肾小球、肾小囊、肾小管结构正常，局部肾间质偶见少量炎性细胞。其中，对照组雄性大鼠有2例、雌性大鼠有1例局部肾间质见炎性细胞浸润；高剂量实验组雄性、雌性大鼠各有1例局部肾间质见炎性细胞浸润。

胃肠：对照组和高剂量实验组大鼠的胃、肠各层结构清晰，粘膜上皮完整，未见炎性细胞浸润级钙化灶。

睾丸：生精小管内各级生精细胞发育良好，间质血管未见充血、淤血，间质未见炎性细胞浸润及钙化灶。

卵巢：各级卵泡发育良好，间质血管未见充血、淤血，间质未见炎性细胞浸润。

脾：白髓由多数淋巴细胞构成，红髓由髓索，血窦构成，血窦内可见多数红细胞和少量白细胞，红髓与白髓所占比列未见异常，血窦内的红细胞、白细胞所占比列未见异常。

检查结果表明高剂量组雄、雌性大鼠的肝、肾、脾、胃、肠、睾丸、卵巢均未见与样品有关的病理组织变化。

4、毒性试验结论

受试药物对两种性别的大、小鼠经口最大耐受剂量（MTD）均大于24.00g/kgBW，属无毒性。三项遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）结果均为阴性。大鼠30天喂养试验中临床检查、脏器称量、血液生化学检查、血液细胞学检查表明各检验项目的实验组与对照组比较，差异不显著。组织病理学检查结果表明，高剂量组雌、雄性大鼠肝、肾胃、肠、脾、卵巢及睾丸均未发现明显损伤性病理变化。

上述试验结果说明，受试药物安全、无毒。

试验例3 兴奋剂检测

本试验研究由国家兴奋剂检测研究中心检测。

受试药物：按照实施例1所述方法制备得到的组合物

试验结论：在送检样品中未检出刺激剂、麻醉镇静剂、甾体、利尿剂、β-阻断剂、β-激动剂、功能性药物和糖皮质激素。

总之，本发明提供的组合物，组方新颖合理、成分简单，特色明显，质量稳定可控而且效果显著，它是基于传统中医药基础理论对疲劳不适的病因病机认识，结合多年的临床实践，运用现代科学技术开发研制而成。通过验证，本品能有效缓解疲劳，减轻工作及生活压力，提高生活质量，改善亚健康状态，是广大亚健康人群的一种全新选择。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (11)

1.一种用于缓解疲劳的组合物，药材原料的组成为：

马鹿茸120～240重量份，淫羊藿300～600重量份，龟板400～800重量份，人参120～240重量份，枸杞子240～480重量份，覆盆子240～480重量份。

2.根据权利要求1所述用于缓解疲劳的组合物，其特征在于，所述药材原料的组成为：

马鹿茸150～210重量份，淫羊藿375～525重量份，龟板500～700重量份，人参150～210重量份，枸杞子300～420重量份，覆盆子300～420重量份。

3.根据权利要求1或2所述用于缓解疲劳的组合物，其特征在于，马鹿茸与人参的重量份相同。

4.根据权利要求1或2所述用于缓解疲劳的组合物，其特征在于，枸杞子与覆盆子的重量份相同。

5.根据权利要求3所述用于缓解疲劳的组合物，其特征在于，枸杞子与覆盆子的重量份相同。

6.根据权利要求1或2所述用于缓解疲劳的组合物，其特征在于，马鹿茸与人参的重量份相同，枸杞子与覆盆子的重量份相同，且枸杞子的重量份是马鹿茸的两倍。

7.根据权利要求1所述用于缓解疲劳的组合物，其特征在于，所述药材原料的组成为：

马鹿茸180重量份，淫羊藿450重量份，龟板600重量份，人参180重量份，枸杞子360重量份，覆盆子360重量份。

8.权利要求1至7中任一项所述用于缓解疲劳的组合物的制备方法，包括如下步骤：

I.所述重量份的人参和淫羊藿用乙醇溶液回流提取两次，过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩至60～70℃测定相对密度1.15～1.25的清膏，得到乙醇提取浓缩液；

II.步骤I得到的药渣与所述重量份的其它药材加水煎煮提取三次，过滤，合并滤液，浓缩至60～70℃测定相对密度1.15～1.25的清膏，与步骤I得到的乙醇提取浓缩液合并，减压干燥，粉碎成细粉，加入药学上可以接受的辅料，制备成临床上可以接受的制剂，即得。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

I.所述重量份的人参和淫羊藿用乙醇体积百分浓度为70％的酒精溶液回流提取两次，每次提取1.5小时，每次所述酒精的体积为提取药材重量的8倍；120目筛网过滤，合并滤液，-0.07Mpa，70℃减压回收乙醇至60～70℃测定相对密度1.18～1.22，得到乙醇提取清膏；

II.步骤I得到的药渣与所述重量份的其它药材加水煎煮提取三次，每次1.0小时，每次水的体积为煎煮药材重量的8倍；120目筛网过滤，合并滤液，-0.07Mpa，70℃浓缩至60～70℃测定相对密度1.18～1.22的清膏，与步骤I得到的乙醇提取清膏合并，70℃，压力-0.08Mpa下，减压干燥；相对湿度＜57％的条件下，干膏粉碎成细粉，加入微晶纤维，混合均匀，装胶囊，即得；其中，干浸膏粉与微晶纤维的重量比为98:2。

10.权利要求8或9所述的制备方法制备得到的用于缓解疲劳的组合物。

11.权利要求1至7中任一项所述的组合物或权利要求10所述的组合物在制备缓解疲劳的药物、保健食品中的应用。