CN100544736C - 一种增强免疫力的药物组合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强免疫力的药物组合物及其制备方法。该药物组合物由灵芝、蜂胶、精氨酸、蛋氨酸、β-胡萝卜素、富硒酵母组成。本发明药物组合物能有效提高小鼠的非特异性和特异性细胞免疫功能，抗突变，在免疫调节方面有重要作用，可用于辅助抑制肿瘤。

Description

一种增强免疫力的药物组合物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种增强免疫力的药物组合物及其制备方法。

背景技术

众所周知，肿瘤对人体的危害极大，目前西医尚无十分有效的治疗方法。祖国医学对“肿瘤”的治疗有丰富的经验，积累了许多行之有效的验方，本发明药物组合物对人体具备较好的保健功能，有抗突变、免疫调节的作用。是通过提高免疫巩固正气来抵制邪气以达到治疗的目的，从而达到抑制肿瘤的效果。

发明内容

本发明的第一个目的在于公开一种药物组合物；本发明的第二个目的在于公开一种增强免疫力的药物组合物；本发明的第三个目的在于公开该药物组合物的制备方法。

本药物组合物的原料组成为：

灵芝20-50重量份、蜂胶10-40重量份、精氨酸10-40重量份、蛋氨酸5-25重量份、β-胡萝卜素0.1-0.3重量份、富硒酵母1×10^-6～10×10^-6重量份。

本药物组合物的原料组成优选为：

灵芝36重量份、蜂胶24重量份、精氨酸24重量份、蛋氨酸15.8重量份、β-胡萝卜素0.2重量份、富硒酵母4×10^-6重量份。

本药物组合物的原料组成优选为：

灵芝25重量份、蜂胶35重量份、精氨酸15重量份、蛋氨酸20重量份、β-胡萝卜素0.1重量份、富硒酵母2×10^-6重量份。

本药物组合物的原料组成优选为：

灵芝45重量份、蜂胶15重量份、精氨酸35重量份、蛋氨酸10重量份、β-胡萝卜素0.3重量份、富硒酵母8×10^-6重量份。

本发明所述的β-胡萝卜素为β-胡萝卜素粉10％，可通过市售取得，例如可购自但不限于北京嘉康源化工有限公司；富硒酵母中含硒量为1000PPM，可通过市售取得，例如可购自但不限于北京嘉康源化工有限公司。取上述组合物原料，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床可接受的剂型，包括但不仅限于浓缩丸剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、片剂、软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。

本发明所述的药物组合物，贯彻了中医学中扶正与驱邪双重调节的思想：在扶正方面，各组成成分都具有调节免疫的作用。从细胞水平、基因水平而言，灵芝、蜂胶、精氨酸等组成成分，都能有效的激活T淋巴细胞，巨噬细胞和NK细胞，刺激细胞免疫和体液免疫的应答，从而达到固护正气的目的；驱邪方面：则表现为多靶向、全方位、各阶段的每一种成分所具有的抗肿瘤功效。灵芝的提高免疫力，使免疫细胞在早期就能够将肿瘤杀死、吞噬；提高血小板纤维蛋白的形成能力，将肿瘤肿块紧紧包裹，切断其营养来源；蜂胶抗癌则体现在控制癌细胞增殖，防止正常细胞癌变和强化机体免疫；β-胡萝卜素能消除那些具有高能量、高活性的自由基，减少致癌的危险，并且诱导肿瘤细胞的分化，降低其恶性程度和转移能力；富硒酵母对不同部位都能起到全程、全方位、广谱的预防癌症的效果；精氨酸与蛋氨酸相配，可增加T细胞的有丝分裂，在肿瘤细胞内和外都能积极地杀伤肿瘤细胞。

经临床实验证实：本发明所述的药物组合物能够有效地提高特异性和非特异性细胞免疫；有辅助抑制肿瘤的功效。

(1)动物实验表明，本发明药物组合物胶囊剂喂药2周后，能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力；促进小鼠网状内皮系统的功能；加速碳粒的清除；显著提高自然杀伤细胞的抗瘤活性；增强机体的非特异性细胞免疫功能。本发明药物组合物胶囊剂可显著增强小鼠迟发型超敏反应，表明本发明药物组合物胶囊剂，对机体特异性细胞免疫功能也有显著增强作用。在一定程度上，本发明药物组合物胶囊剂能够有效地提高特异性和非特异性细胞免疫。

(2)辅助抑制肿瘤的实验中，发现本发明药物组合物胶囊剂大剂量组与中剂量组都能显著延长荷瘤小鼠的平均生存时间，两次重复实验中，中剂量组对小鼠生命延长率分别为45.9％和47.1％，均超过30％，且两次重复试验瘤重差异有统计学意义，且抑瘤率均超过30％，符合卫生部1999年公布的《抑制肿瘤作用评价和检验方法的规定》。本发明药物组合物胶囊剂确有辅助抑制肿瘤的功效。

(3)本发明药物组合物胶囊剂不仅可以有效延长小鼠生存时间，改善其生活质量，对于动物体内环境也有一定改变。在对荷瘤小鼠肿瘤表面MHC分子影响的定量检测中，发现H22荷瘤小鼠灌服本发明药物组合物胶囊剂后，大剂量组和中剂量组移植瘤表面的MHCI类抗原即H-2Kk分子的表达，与模型组相比，有显著差异，并且大剂量组与模型组之间有极显著差异；环磷酰胺组同模型组也有极显著差异。这种改变与本发明药物组合物胶囊剂的服用剂量呈正相关。

下述实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1 免疫功能调节作用的实验研究

实验材料：

(1)实验动物：NIH小鼠，6～8周龄。雌性，体重(20±2)g，由中国药品生物制品鉴定所提供。(2)药品试剂：本发明药物组合物胶囊剂。

实验方法：

(1)实验分组：NIH小鼠120只，随机分为4组，即空白对照组，本发明药物组合物胶囊剂大剂量组，中剂量组和小剂量组，每组小鼠30只。(2)给药：各组小鼠等体积灌胃0.2ml/天。根据下列公式给出小鼠给药剂量：dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB为20g小鼠日给药剂量(g/kg)，dA为正常成人日给药剂量(g/kg)，K：折算系数(KA：0.11，KB：1)SBX大剂量为3.0g·kg-1·d，SBX中剂量为1.0g·kg-1·d，SBX小剂量为0.3g·kg-1·d，对照组以生理盐水灌胃，每日1次，连续2周。于实验的第15天，每组分别取20只小鼠进行细胞免疫功能调节作用测试，其余10只动物于第15天起停止给予本发明药物组合物胶囊剂，正常喂养第28天后进行细胞免疫功能测试。

实验指标：

(1)NK细胞活性测定

采用乳酸脱氢酶法。分别取靶细胞和效应细胞各100μl加入U型96孔培养板中。靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl。各项均设复孔。于37度，5％CO₂培养箱中培养4h后，将96孔培养板以1500r/min离心5min，吸取上清100μL置平底96孔培养板中，加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值，计算NK细胞活性。

(2)小鼠迟发型变态反应

称取DNFB50mg，按1∶1加入5ml丙酮麻油溶液，混匀。鼠腹部皮肤脱毛，范围3cmX3cm。用DNFB溶液均匀致敏涂抹。5天后，再用DNFB溶液10μl在小鼠左耳(双面)均匀涂抹进行攻击。24h后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，打孔器取直径8mm的耳片，称重备用。左右耳重量之差表示DTH的程度。

(3)小鼠碳廓清试验

将染料印度墨汁用生理盐水稀释5倍。按每10g体重0.1ml计算，小鼠尾静脉注稀释的印度墨汁。注入墨汁后2、10min分别从内眦静脉丛取血20μl，加到2mlNa2CO3溶液中，用分光光度计在600nm波长处测吸光度值，以Na2CO3溶液作空白对照。处死小鼠，取脏器称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。

(4)小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

配制生理盐水、鸡红细胞悬液。小鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml。间隔30min后，颈椎脱臼处死动物。经腹腔注入生理盐水2ml。吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2片载破片上，保持37℃置30min，以生理盐水漂洗除去末贴片细胞。丙酮甲醇溶液固定。体积比4％磷酸缓冲液染色3min。漂洗晾干。以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。

(5)小鼠脾淋巴细胞转化试验

无菌手术取脾，将脾撕碎，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗涤3次，调整浓度为2×106个/ml。加入培养板中，每孔1ml，一孔加浓度为100μl/ml、50μlConA液，另一孔不加ConA作对照，置5％CO₂，37℃培养72h。结束培养前4h，每孔吸去上清夜0.7ml，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5g/L)50μl/孔，培养4h后，加入1ml异丙醇，完全溶解结晶后，分装到96孔板中。每孔装4孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570hm波长测定光密度值。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。

统计方法：

采用SPSS12.0统计软件，实验指标计量资料组间比较应用成组T检验，以P＜0.05为显著性差异。

实验结果：

(1)NK细胞活性测定

实验结果如表1所示，本发明药物组合物胶囊剂喂饲小鼠2周后，大、中剂量组小鼠NK活性显著高于空白对照组，P＜0.05；喂药4周后，该实验结果与空白对照组比较无显著性差异，P＞0.05。

表1本发明药物组合物胶囊剂对小鼠脾脏自然杀伤细胞活性的影响

注：*与对照组比较有显著差异，P＜0.05

(2)小鼠迟发型变态反应

实验结果如表2所示，本发明药物组合物胶囊剂喂饲小鼠2周后，中、小剂量组迟发型变态反应显著高于空白对照组，P＜0.05；喂药4周后，该实验结果与空白对照组比较无显著性差异，P＞0.05。

表2本发明药物组合物胶囊剂对小鼠迟发型变态反应的影响(mg，x±s)

注：*与对照组比较有显著差异，P＜0.05

**与对照组比较有极显著差异，P＜0.01

(3)小鼠碳廓清能力的影响

实验绳索果如表3所示，本发明药物组合物胶囊剂喂饲小鼠2周后，小剂量组碳廓清能力反应显著高于空白对照组，P＜0.05；喂药4周后，该实验结果与空白对照组比较无显著性差异，P＞0.05。

表3本发明药物组合物胶囊剂对小鼠碳廓清能力的影响(x±s)

注：*与对照组比较有显著差异，P＜0.05

(4)小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

实验结果如表4所示，本发明药物组合物胶囊剂喂饲小鼠2周后，大、中、小三个剂量组巨噬细胞吞噬能力显著高于空白对照组，P＜0.05；喂药4周后，该实验结果与空白对照组比较无显著性差异，P＞0.05。

表4本发明药物组合物胶囊剂对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响(x±s)

注：*与对照组比较有显著差异，P＜0.05

(5)小鼠脾淋巴细胞转化试验

实验结果如表5所示，本发明药物组合物胶囊剂喂饲小鼠2周后，大、中、小三个剂量组脾淋巴细胞转化能力显著高于空白对照组，P＜0.05；喂药4周后，该试验结果与空白对照组比较无显著性差异，P＞0.05。

表5本发明药物组合物胶囊剂对小鼠脾淋巴细胞转化实验能力的影响(x±s)

注：*与对照组比较有显著差异，P＜0.05

本实验例1研究发现本发明药物组合物胶囊剂喂药2周后，能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力.促进小鼠网状内皮系统的功能；加速碳粒的清除；显著提高自然杀伤细胞的抗瘤活性：增强机体的非特异性细胞免疫功能。本发明药物组合物胶囊剂可显著增强小鼠迟发型超敏反应，表明本发明药物组合物胶囊剂对机体特异性细胞免疫功能也有显著增强作用。

实验例2本发明药物组合物胶囊剂对移植性S180肉瘤小鼠生命延长的实验研究

实验材料：

(1)动物及瘤株

健康昆明种小鼠，雌性，体重(16±2)g，二级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

小鼠S180肉瘤，经小鼠腹腔传代保种，由广安门中医院肿瘤研究中心实验室提供。

(2)药品试剂

本发明药物组合物胶囊剂(简写为SBX)主要由灵芝、蜂胶、精氨酸、蛋氨酸、β-胡萝卜素、富硒酵母等组成，由上海高能生物技术有限公司和太原市晋康源生物王程有限公司提供。阳性对照药选用上海华联制药有限公司提供的的环磷酰胺(CTX)，200mg/支，生产批号040607。

(3)仪器

离心机LD25-2北京医用离心机

实验方法

(1)动物分组

健康昆明种小鼠50只，雌性，体重(16±2)g，适应性饲养三天后，称重，随机分为五组：SBX胶囊大剂量组、SBX胶囊中剂量组、SBX胶囊小剂量组、阳性对照环磷酰胺组、模型对照组，每组10只。分笼饲养，自由摄食与饮水，室温24-26℃。

(2)造模前给药

各组小鼠等体积灌胃0.2ml/天。根据下列公式给出小鼠给药剂量：dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB为20g小鼠日给药剂量(g/kg)，dA为正常成人日给药剂量(g/kg)，K：折算

系数(KA：0.11，KB：1)

SBX大剂量为3.0g·kg-1·d，SBX中剂量为1.0g·kg-1·d，SBX小剂量为0.3g·kg-1·d，环磷酰胺组和模型对照组灌胃生理盐水。灌胃10天。

(3)造模

肿瘤细胞悬液的制备：S180腹水癌细胞在小鼠体内连续传代后，抽取腹水，呈乳白色，无菌生理盐水1000rm×5min，洗涤离心3次后，调细胞浓度2.0×106/ml，全程无菌操作，冰浴上进行。

肿瘤动物造模：将细胞悬液注射至各组昆明种小鼠右腋皮下，制作肿瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤块长出，造模成功。

造模后给药：接种后第二天，环磷酰胺组小鼠灌胃CTX为30mg/kg·d。其余各组继续灌胃给药，剂量如前。灌胃7天后，停药观察动物存活天数，以平均存活时间计算生命延长率。该实验重复2次。

实验指标：

一般观察：观察动物体重、进食量、饮水量、活动度、皮毛光泽度、始出现肿瘤时间、肿瘤生长速度和动物存活时间。

生命延长率计算方法为：生命延长率(％)：(治疗组平均存活时间一阴性对照组平均存活时间)/阴性对照组平均存活时间×100％。

统计方法：

采用SPSS12.0统计软件，实验指标计量资料组间比较应用成组T检验，以P＜0.05为显著性差异。

实验结果：

(1)一般观察

模型对照组小鼠肿瘤出现早，生长迅速，局部肿胀，淋巴回流障碍，压迫症状明显，右前肢功能废退。与对照组比较，本发明药物组合物胶囊剂中剂量组小鼠饮食、毛发等正常，较活跃，肿瘤生长缓慢，局部压迫症状不明显。环磷酰胺组形体较中剂量组瘦小，有被毛脱落等现象，肿瘤生长也较缓慢。本发明药物组合物胶囊剂大剂量组体重与肿瘤生长速度均较快，动物解剖时发现动物腹壁脂肪层较厚，小剂量组体重生长速度较均匀，肿瘤组织生长也较慢。

(2)生命延长率(Increase life Span，ILS)

实验结果如表6和7，SBX中剂量治疗组的平均存活时间较对照组显著延长，P＜0.01；生命延长率为45.9％，与阳性对照药环磷酰胺治疗组平均存活时间相比较，差异不显著。

表6本发明药物组合物胶囊剂对小鼠(S180)肉瘤ILS的影响(x±s)

注：*与对照组比较有显著差异，(P＜0.05)

**与对照组比较有极显著差异，(P＜0.01)

表7本发明药物组合物胶囊剂对小鼠(S180)肉瘤ILS的影响(x±s)

注：*与对照组比较有非常显著差异，(P＜0.05)

**与对照组比较有极显著差异，(P＜0.01)

本实验通过预防和治疗给药，观察本发明药物组合物胶囊剂对S180荷瘤小鼠生存率的影响，发现本发明药物组合物胶囊剂大剂量组与中剂量组都能显著延长荷瘤小鼠的平均生存时间，且两次重复实验中，中剂量组对小鼠生命延长率分别为45.9％和47.1％，均超过30％，符合卫生部1999年公布的《抑制肿瘤作用评价和检验方法的规定》。

实验例3对H22肝癌小鼠移植瘤辅助抑制作用的实验研究

实验材料

(1)动物及瘤株

健康ICR小鼠，雌性，体重(16±2)g，二级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

小鼠H22肝腹水瘤，经小鼠腹腔传代保种，由北京医科大学提供。

(2)药品试剂

“本发明药物组合物胶囊剂”(简写为SBX)主要由灵芝、蜂胶、精氨酸、蛋氨酸、β-胡萝卜素、富硒酵母等组成，由上海高能生物技术有限公司和太原市晋康源生物工程有限公司提供。

阳性对照药选用上海华联制药有限公司提供的的环磷酰胺(CTX)，200mg/支，生产批号040607

实验方法

(1)动物分组

健康ICR小鼠60只，雌性，体重(16±2)g，适应性饲养三天后，称重，随机分为六组：SBX胶囊大剂量组、SBX胶囊中剂量组、SBX胶囊小剂量组、阳性对照环磷酰胺组、模型对照组、空白组每组10只。分笼饲养，自由摄食与饮水，室温24-26℃。

(2)造模前给药

各组小鼠等体积灌胃0.2ml/天。根据下列公式给出小鼠给药剂量：dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB为20g小鼠日给药剂量(g/kg)，dA为正常成人日给药剂量(g/kg)，K：折算系数(KA：0.11，KB：1)

SBX大剂量为3.0g.kg-1·d，SBX中剂量为1.0g·kg-1·d，SBX小剂量为0.3g。kg-1·d，环磷酰胺组、模型对照组以及空白组灌胃生理盐水。灌胃10天。

(3)造模

肿瘤细胞悬液的制备：H一22腹水细胞在小鼠体内连续传代后，抽取腹水，呈乳白色，无菌生理盐水1000rm×5min，洗涤离心3次后，调细胞浓度2.0×106/ml，全程无菌操作，冰浴上进行。

肿瘤动物造模：将细胞悬液注射至各组昆明种小鼠右腋皮下，制作肿瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤块长出，造模成功。

造模后给药：接种后第二天起，环磷酰胺组小鼠开始灌胃CTX为30mg/kg。d。其余各组继续灌胃给药，剂量如前。灌胃7天后，停药观察动物。12天时处死动物，剥离肿瘤、肝、睥及胸腺并称重。

实验指标

(1)一般情况观察：主要观察荷瘤小鼠进食量、活动、皮毛光泽。

(2)记录小鼠体重的变化曲线：每日记录小鼠体重

(3)抑瘤率计算方法：抑瘤率＝1-治疗组肿瘤重量/对照组肿瘤重量

(4)脏器/体重比值测定：取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。

(5)光镜下观察肿瘤细胞形态结构的变化

石蜡切片准备：取各组小鼠肿瘤组织，10％甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度为6μm，置于56度温箱中烤片24小时，室温下保存备用。

组织切片的HE染色：主要步骤为：1)、切片脱蜡至水，2)、入苏木精染色液中3分钟，蒸馏水冲洗，3)、加入1％盐酸水溶液分色，蒸馏水冲洗，4)、1％氨水反蓝，蒸馏水冲洗，5)、加入1％伊红染液中3分钟，蒸馏水冲洗，4)、逐级脱水，透明，光学树脂封片。

统计方法：

采用SPSS12.0统计软件，实验指标计量资料组间比较应用成组T检验，以P＜0.05为显著性差异。

实验结果：

(1)一般生理情况观察

SBX大剂量组：小鼠体重较其他各组增长均快，被毛有些疏松，行动较迟缓。小鼠腋下第三天出现蓬隆，体重与瘤重均增长较快。

SBX中剂量组：小鼠体重增长速度适中，饮食运动均良好，被毛顺滑，有光泽。接种后SBX第三天开始出现轻微蓬隆，且瘤块生长较大剂量组慢。

SBX小剂量组：小鼠体重增长较空白对照组不显，饮食行动尚可，被毛较顺滑。接种后第四天开始出现轻微蓬隆。

阳性对照药小鼠服用CTX后，呆卧少动，被毛疏松，精神差，饮食减少，与对照组比较体重增加缓慢，腋下荷瘤目测体积明显小于对照组。

模型对照组小鼠接种后第3天开始出现黄豆样隆起。小鼠饮食、饮水量减少，被毛疏松，精神较差，呆卧少动。

(2)本发明药物组合物胶囊剂对各组小鼠体重生长曲线的影响

如下图所示，造模前给药7天后本发明药物组合物胶囊剂三个剂量组小鼠体重都高于环磷酰胺组、正常组和模型对照组，给药后第十二天，各组小鼠体重从高到低依次是模型组，大剂量组，小剂量组，中剂量组，环磷酰胺组，正常组.

(3)本发明药物组合物胶囊剂对小鼠H22肿瘤抑瘤的作用

两次重复实验中，本发明药物组合物胶囊剂中剂量组的平均瘤重分别为0.96g和0.91g，与模型组相比较有显著差异，P＜0.05，中剂量组抑瘤率为43.2％和48.3％，显示出明显的抑瘤活性.

表8重复SBX胶囊对荷瘤小鼠(H22)的抑瘤作用(x±s)

注：*与模型组比较有显著差异，(P＜0.05)

**与模型比较有极显著差异，(P＜0.01)

(4)本发明药物组合物胶囊剂对小鼠H22肿瘤免疫器官的影响

本发明药物组合物胶囊剂各剂量组脾脏指数均较正常组高，但差异不显著；本发明药物组合物胶囊剂各组胸腺指数较模型组有显著差异(P＜0.05)，模型组小鼠胸腺指数较正常组为低，差异不显著.

表9本发明药物组合物胶囊剂对荷瘤小鼠胸腺指数的比较(x±s)

注：*与模型组比较有显著差异，(P＜0.05)

**与模型比较有极显著差异，(P＜0.01)

实验例4对荷瘤小鼠肿瘤表面MHC I类分子影响的实验研究

实验材料

(1)实验动物

健康ICR小鼠，雌性，体重(16±2)g，二级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

(2)瘤株

小鼠H-22肝腹水瘤，经小鼠腹腔传代保种，由北京医科大学实验室提供。

(3)药品试剂

本发明药物组合物胶囊剂(简写为SBX)主要由灵芝、蜂胶、精氨酸、蛋氨酸、β-胡萝卜素、富硒酵母等组成，由上海高能生物技术有限公司和太原市晋康源生物工程有限公司提供。

阳性对照药选用上海华联制药有限公司提供的的环磷酰胺(CTX)，200mg/支，生产批号040607

异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗小鼠一H2KK，购自美国BD Pharmingen公司，阴性对照PBS液。

(4)仪器

离心机LD25-2，北京医用离心机厂。

电子匀浆器DY89-II型电动剥离匀浆器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

流式细胞仪(BECTOM TACSCalibur DICKINSON)系美国BD公司产品，北京东直门医院重点实验室提供。

实验方法

(1)动物分组

健康ICR小鼠50只，雌性，体重(16±2)g，适应性饲养三天后，称重，随机分为六组：SBX胶囊大剂量组、SBX胶囊中剂量组、SBX胶囊小剂量组、阳性对照环磷酰胺组、空白模型组10只。分笼饲养，自由摄食与饮水，室温24-26℃。

(2)造模前给药

各组小鼠等体积灌胃0.2ml/天。根据下列公式给出小鼠给药剂量：dB：dA×(KB/KA)其中，dB为20g小鼠日给药剂量(g/kg)，dA为正常成人日给药剂量(g/kg)，K：折算系数(KA：0.11，KB：1)

SBX大剂量为3.0g.kg-1·d，SBX中剂量为1.0g.kg-1·d，SBX小剂量为0.3g.kg-1·d，环磷酰胺组、模型对照组以及空白组灌胃生理盐水。灌胃10天。

(3)造模

肿瘤细胞悬液的制备：H22肝腹水癌细胞在小鼠体内连续传代后，抽取腹水，呈乳白色，无菌生理盐水1000rmX 5min，洗涤离心3次后，调细胞浓度2.0×106/ml，全程无菌操作，冰浴上进行。

肿瘤动物造模：将细胞悬液注射至各组昆明种小鼠右腋皮下，制作肿瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤块长出，造模成功。

(4)造模后给药：接种后第二天，环磷酰胺组小鼠灌胃CTX为30mg/kg·d。其余各组继续灌胃给药，剂量如前。灌胃7天后，停药观察动物。

(5)制取单细胞悬液：造模后第12天，小鼠脱颈处死，剥离肿瘤。取肿瘤组织约0.2～1.0g，置于电子匀浆器，加入PBS液研磨成单细胞悬液。将该悬液经200目尼龙网过滤冲洗至小试管中，1500转离心5min，弃上液，加适量PBS液，继续离心，1000转5min，弃上液，加PBS液，光学显微镜下调浓度为106/ml，备用。

(6)结合抗体：将细胞悬液分两管，每管100μl，其中1管加相应FITC标记抗小鼠H一2KK单抗20μl，室温避光反应30min，2000转离心5min，弃上清液，以除去未结合荧光抗体，另一管做阴性对照，加20μlPBS液，与细胞反应，步骤如上。

(7)FCM检测：光源488nm的氩离子激光，FITC受激发后发出绿色荧光。以标准球调整仪器，使变异系数在2％以内。备用样本以300目尼龙网过滤，上机检测。上机后计数10000个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后用Cell Quest软件分析数据。

统计学处理：用Student T检验进行统计学处理。

实验结果：

H一2KK抗原在各组荷瘤小鼠肿瘤组织表面表达特点：

由表中可以看出，荷瘤小鼠肿瘤组织表面H-2KK在本发明药物组合物胶囊剂大剂量组、中剂量组以及阳性对照(环磷酰胺)组中的表达均高于模型组，并且差异显著(P＜0.01)。

表10H-2KK抗原在各组荷瘤小鼠肿瘤组织表面表达Tabel Expression ofH-2KK on tumor cells(x±s)

注：*与对照组比较，有显著差异，P＜0.05

**与对照比较，有极显著差异，P＜0.01

通过动物实验发现，H22荷瘤小鼠灌服本发明药物组合物胶囊剂后，大剂量组和中剂量组移植瘤表面的MHCI类抗原即H-2KK分子的表达，与模型组相比有显著差异，并且大剂量组与模型组之间有极显著差异；环磷酰胺组同模型组也有极显著差异。这种改变与本发明药物组合物胶囊剂的服用剂量呈正相关。本发明药物组合物胶囊剂大剂量组H-2KK抗原表达量与环磷酰胺组接近，中剂量组与小剂量组依次递减。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：冻干粉针剂的制备

灵芝36kg、蜂胶24kg、精氨酸24kg、蛋氨酸15.8kg、0.2kgβ-胡萝卜素粉10％、4mg富硒酵母(含硒量1000PPM)

以上药物组合物加入常规辅料，经常规工艺。制成冻干粉针剂。

实施例2：口服液的制备

灵芝25kg、蜂胶35kg、精氨酸15kg、蛋氨酸20kg、0.1kgβ-胡萝卜素粉10％、2mg富硒酵母(含硒量1000PPM)

以上药物组合物加入常规辅料，经常规工艺。制成口服液。

实施例3：合剂的制备

灵芝45kg、蜂胶15kg、精氨酸35kg、蛋氨酸10kg、0.3kgβ-胡萝卜素粉10％、8mg富硒酵母(含硒量1000PPM)

以上药物组合物加入常规辅料，经常规工艺。制成合剂。

实施例4：胶囊剂的制备

灵芝36kg、蜂胶24kg、精氨酸24kg、蛋氨酸15.8kg、0.2kgβ-胡萝卜素粉10％、4mg富硒酵母(含硒量1000PPM)

以上药物组合物加入常规辅料，经常规工艺。制成胶囊剂。

实施例5：颗粒剂的制备

灵芝25kg、蜂胶35kg、精氨酸15kg、蛋氨酸20kg、0.1kgβ-胡萝卜素粉10％、2mg富硒酵母(含硒量1000PPM)

以上药物组合物加入常规辅料，经常规工艺。制成颗粒剂。

实施例6：片剂的制备

灵芝45kg、蜂胶15kg、精氨酸35kg、蛋氨酸10kg、0.3kgβ-胡萝卜素粉10％、8mg富硒酵母(含硒量1000PPM)

以上药物组合物加入常规辅料，经常规工艺。制成片剂。

Claims (9)

1、一种增强免疫力的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料制成：灵芝20-50重量份、蜂胶10-40重量份、精氨酸10-40重量份、蛋氨酸5-25重量份、β-胡萝卜素粉10％0.1-0.3重量份、富硒酵母1×10^-6～10×10^-6重量份。

2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料制成：灵芝36重量份、蜂胶24重量份、精氨酸24重量份、蛋氨酸15.8重量份、β-胡萝卜素粉10％0.2重量份、富硒酵母4×10^-6重量份。

3、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料制成：灵芝25重量份、蜂胶35重量份、精氨酸15重量份、蛋氨酸20重量份、β-胡萝卜素粉10％0.1重量份、富硒酵母2×10^-6重量份。

4、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下原料制成：灵芝45重量份、蜂胶15重量份、精氨酸35重量份、蛋氨酸10重量份、β-胡萝卜素粉10％0.3重量份、富硒酵母8×10^-6重量份。

5、如权利要求1-4任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：取该药物组合物的原料，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的浓缩丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。

6、如权利要求1-4任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：取该药物组合物的原料，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的滴丸剂或软胶囊剂。

7、如权利要求1-4任一所述的药物组合物，其特征在于其中富硒酵母中含硒量为1000PPM。

8、如权利要求1-4任一所述的药物组合物在制备提高特异性和非特异性细胞免疫的药物中的应用。

9、如权利要求1-4任一所述的药物组合物在制备抑制肿瘤的药物中的应用。