CN101744802A

CN101744802A - 羟基红花黄色素a在制备抗肿瘤药物的新用途

Info

Publication number: CN101744802A
Application number: CN200810226990A
Authority: CN
Inventors: 张前; 解华; 刘朝阳; 牛欣; 龚曼曼; 臧宝霞; 王济; 奚胜艳; 刘林涛
Original assignee: 张前
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2010-06-23

Abstract

本发明公开了羟基红花黄色素A在制备抗肿瘤药物的新用途，本发明还公开了一种肿瘤治疗、辅助治疗或预防的药物组合物，该组合物由日用剂量为1.0-20mg的羟基红花黄色素A和药学上可接受的载体制成。该组合物对胃癌、结肠癌、肝癌具有十分明显的抑制作用。

Description

羟基红花黄色素A在制备抗肿瘤药物的新用途

技术领域

本发明涉及羟基红花黄色素A在制备抗肿瘤药物中的应用，属于化药领域。

背景技术

肿瘤的生长需要血管为之提供营养和排除代谢产物，如果没有新生血管的生成，肿瘤可长期只处于1～2mm的微小状态。一旦新生毛细血管长进肿瘤组织，肿瘤则迅速增长并且其侵润和转移能力也大大加强。因此，如何阻断肿瘤血管生成已成为世界上治疗癌症的热点。

在新血管的发生过程中，血管内皮细胞活化并增殖是最基本和最重要的环节。通过抑制血管内皮细胞增殖就可以抑制新生血管生成。由于肿瘤细胞和血管内皮细胞互相依赖介导了肿瘤血管新生，因此，研究体外肿瘤血管新生的过程，要求模拟体内与肿瘤细胞共生的过程，即：血管内皮细胞与肿瘤细胞在共培养的条件下生长。

研究表明，至少有30种生长因子与肿瘤的血管生成有关，其中最直接的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。肿瘤的血管内皮细胞除了高表达VEGF和bFGF外，还大量表达VEGF及bFGF的受体，通过作用于血管内皮细胞表面的这些受体而诱导血管新生。

中医理论认为“气滞血瘀”是肿瘤形成的主要原因之一，“血瘀证”为肿瘤的基本证型，因此，活血化瘀法在抗肿瘤的研究中具有重要地位，为临床常用方法，效果显著。现代研究也证实肿瘤患者的血液流变学表现为高凝、高粘状态，并有外周微循环障碍。许多活血化瘀药可使血液流变学参数趋向于正常，抑制血小板聚集，促进纤维蛋白溶解，改善微循环，进而有利于抑制肿瘤细胞的转移。

红花是传统的活血化瘀中药，临床可用于防治心脑血管病以及食管癌、胃癌、肝癌等多种疾病。红花黄色素为红花的主要水溶性组分，羟基红花黄色素A(Hydroxy Saffloryellow A，HSYA)(结构式见下图)是红花黄色素的主要单体成分。近年来人们对红花黄色素和HSYA的研究主要集中在对心肌的保护作用、降血压作用、抗凝血、抑制血栓形成、减轻心脑缺血损伤的作用等，对它在抗肿瘤方面的尚未公开。

羟基红花黄色素A结构式

发明内容

本发明目的在于提供羟基红花黄色素A在制备肿瘤治疗、辅助治疗或预防方面的药物中的应用。

本发明目的在于提供一种肿瘤治疗、辅助治疗或预防的药物组合物。

本发明目的在于提供一种肿瘤治疗、辅助治疗或预防的药剂盒。

本发明提供一种肿瘤治疗、辅助治疗或预防的药物组合物，该组合物由日用剂量为1-20mg的羟基红花黄色素A和药学上可接受的载体制成。

所述一种肿瘤治疗、辅助治疗或预防的药物组合物，该组合物优选由日用剂量为1.3-16mg的羟基红花黄色素A和药学上可接受的载体制成。

所述一种肿瘤治疗、辅助治疗或预防的药物组合物，该组合物优选由日用剂量为1.5-12mg的羟基红花黄色素A和药学上可接受的载体制成。

本发明目的在于提供一种肿瘤治疗、辅助治疗或预防的药剂盒，该药剂盒由羟基红花黄色素A的制剂和环磷酰胺制剂组成，其中活性成分的重量比为(20-30)∶(0.5-2)；羟基红花黄色素A和环磷酰胺重量比优选为0.7∶25。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备肿瘤治疗、辅助治疗或预防方面的药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备治疗、辅助治疗或预防胃癌的药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备治疗、辅助治疗或预防结肠癌的药物中的应用

本发明提供羟基红花黄色素A在制备治疗、辅助治疗或预防肝癌的药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备使癌瘤细胞凋亡的药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备促进Fas和肿瘤坏死因子TNF-a的表达药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备抑制肿瘤细胞FasL的高表达药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备抑制VEGF的表达和其下游癌基因Ras的表达药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备抑制突变型p53、NF-κB p65基因表达药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备促进IkBα的表达的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备抑制癌基因C-myc、癌基因N-ras、核因子NFκB或碱性成纤维因子bFGF受体bFGFR mRNA表达药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备抑制血管内皮细胞生长因子VEGF及其受体KDR、碱性成纤维生长因子bFGF、缺氧诱导因子HIF、基质金属蛋白酶MMP-9或癌基因C-myc的表达药物中的应用。

本发明提供羟基红花黄色素A在制备抑制了肿瘤标志物CA199和CEA表达药物中的应用。

所述组合物及羟基红花黄色素A优选制备成注射液。所述组合物还可以制备成、胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、缓释、速释制剂中的一种，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。

本发明所述的药剂盒，当HSYA与环磷酰胺联合使用时，不仅可以增强HSYA的显著抑制人胃癌裸鼠移植瘤生长的作用，并有效减轻环磷酰胺的毒性作用。

本发明提供的羟基红花黄色素A，在0.1-1.0mg/kg(一日注射两次)对裸鼠胃癌、结肠癌、肝癌具有十分明显的抑制作用。

本领域普通技术人员根据小鼠的用量可以推算出人的日用量，具体方法是：小鼠日用总量＝人日用总量x(20g小鼠体表面积/70kg人体表面积，即小鼠日用总量＝人日用总量x0.0026。小鼠0.1mg/kg～1.0mg/kg/次，因为一日注射两次，因此小鼠的日用量为0.2mg/kg～2mg/kg，换算成人的是：0.2x20/1000/0.0026＝1.4mg/人/日2.0x20/1000/0.0026＝14mg/人/日，再根据人的不同体重用量为：1.0-20mg。

下述实验用于进一步说明本发明，但是对本发明范围的限制。

实验例1羟基红花黄色素A(HSYA)对人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤生长的作用

1、实验步骤：

取HSYA(纯度大于95％)用生理盐水配制成相应浓度，过滤除菌。西药对照品环磷酰胺(CTX)用灭菌生理盐水配成相应浓度。

取人胃癌BGC-823细胞株传代至足够数量后，用0.25％胰蛋白酶+0.22％EDTA消化液消化，离心。取适量用0.4％台盼蓝染色，于倒置显微镜下计数，细胞活力大于95％。调整浓度，配制成2.15×10¹⁰·L^-1单细胞悬液，接种于裸小鼠酒精消毒后的右前腋部皮下，每只注射悬液0.2ml(约含瘤细胞数4.3×10⁹·L^-1)，建立裸小鼠人胃癌移植瘤模型。

接种瘤株24h后，将裸小鼠随机分为：模型组、CTX组(环磷酰胺)(25mg/kg)、HSYA超剂量组2.8mg/kg、HSYA大剂量组1.4mg/kg、HSYA中剂量组0.7mg/kg、HSYA小剂量组0.35mg/kg和CTX 25mg/kg+HSYA中剂量组0.7mg/kg共七组，每组7只裸鼠。各组于腹腔注射给药，每次0.2ml，除环磷酰胺组外其它各组于接种次日开始给药，每日注射2次，间隔6小时。其中模型组给予0.9％灭菌生理盐水代替HSYA；环磷酰胺对照组于接种第3d开始给药，每2d腹腔注射一次。

待裸鼠腋下肿瘤块生成，观察裸鼠进食量、活动等状态。用卡尺每3d测量一次移植瘤的最长径(a)和最短径(b)，按公式V＝1/2ab²(mm³)计算的近似体积作为肿瘤体积；绘制瘤体积(V)-时间(T)的肿瘤生长变化曲线。第20d，将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤，称取瘤重，并计算各药物组的肿瘤生长抑制率。抑瘤率(IR)＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。

取新鲜瘤组织，于中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色，行中性树胶封片，于倒置显微镜下观察肿瘤病理学特征。

统计方法

所有实验数据用平均值±标准差

表示，采用SPSS13.0软件统计，ANOVA单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P＜0.05时代表有统计学意义。

2、结果：

2.1HSYA对BGC-823裸小鼠移植瘤体积生长的影响

接种BGC-823细胞株后第4d，部分裸鼠肉眼可见右前腋皮下微小突起形成，随天数增加逐渐明显，第7d 49只裸鼠全部出现0.4cm至0.8cm大小的瘤块，成瘤率100％。随着给药的持续，各组移植瘤继续增大，模型组肿瘤体积均大于给药组(见表1)。

在给药第19天后，HSYA各组的瘤体积均比模型组小，且瘤体积与药物浓度成反比。由表1可以看出在给药第19天后，各组与模型组比较，环磷酰胺组、HSYA-0.7mg/kg组、HSYA-0.35mg/kg组和CTX 25mg/kg+HSYA-0.7mg/kg组4个组的瘤体积明显减少，差异有统计学意义。

同时，我们观察到环磷酰胺组裸鼠出现呆卧少动，饮食减少等现象，与环磷酰胺+中药等其它各组比较体重增长缓慢。

表1HSYA对人胃癌BGC-823细胞裸小鼠皮下移植瘤体积生长的影响(mm³)(x±s，n＝7)

注：*与模型组相比P＜0.05 **与模型组相比P＜0.01

2.2HSYA对BGC-823裸小鼠移植瘤重量的影响

各组裸小鼠移植瘤的重量及抑瘤率见表2。由表2可看出，CTX组、HSYA-0.7mg/kg、HSYA-0.35mg/kg和CTX+HSYA-0.7mg/kg组的瘤重明显减轻，与模型组相比差异有统计学意义。HSYA-2.8mg/kg、HSYA-1.4mg/kg组瘤重虽然比模型组有所减少，但差异不明显，没有统计学意义。

与模型组比较CTX组、HSYA-2.8mg/kg、HSYA-1.4mg/kg、HSYA-0.7mg/kg、HSYA-0.35mg/kg和CTX+HSYA-0.7mg/kg组的抑瘤率分别为：67.50％、1.92％、3.84％、29.79％、29.97％和48.35％。

表2HSYA对人胃癌BGC-823细胞裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用(x±s，n＝7)

注：*与模型组相比P＜0.05 **与模型组相比P＜0.01

2.3HSYA对BGC-823裸小鼠移植瘤病理改变的影响

移植瘤呈实性、类圆形，质地坚硬，切开后断面呈灰白色，与皮下组织界限清楚易剥离。模型组多数有分叶，瘤体凸凹不平，形状不规则。HE染色后光镜下观察，模型组由排列不规则瘤细胞构成，可见大量多核、异性核及核分裂相，有大量癌巢形成；HSYA组瘤组织出现较多坏死区，部分细胞固缩、裂解，可见凋亡、坏死细胞(图1)。

3、结论：

HSYA在2.8mg/kg～0.35mg/kg/次浓度范围内，可有效抑制人胃癌细胞BGC-823裸小鼠移植瘤的生长，促进肿瘤细胞坏死。且浓度在0.7mg/kg～0.35mg/kg范围内，作用最强，与模型组相比瘤体积明显减少，呈极显著性差异；瘤体重量明显减轻，抑瘤率接近30％，与模型组相比有显著性差异。

0.7mg/kg～0.35mg/kg/次浓度的HSYA与环磷酰胺联合用药，能显著增强HSYA抑制人胃癌裸鼠移植瘤生长的作用，并有效减轻环磷酰胺的毒性作用。

实验例2羟基红花黄色素A对人结肠癌细胞株HCT-8裸鼠移植瘤生长的作用

1、实验步骤：

取人结肠癌HCT-8细胞株传代至足够数量后，用0.25％胰蛋白酶+0.22％EDTA消化液消化，离心。取适量用0.4％台盼蓝染色，于倒置显微镜下计数，细胞活力大于95％。调整浓度，配制成2.0×10¹⁰·L^-1单细胞悬液，接种于裸小鼠酒精消毒后的右前腋部皮下，每只注射悬液0.3ml(约含瘤细胞数6×10⁹·L^-1)，建立裸小鼠人结肠癌移植瘤模型。

接种瘤株24h后，将裸小鼠随机分为：模型组、HSYA大剂量组1.4mg/kg和HSYA小剂量组0.7mg/kg共3组，每组6只裸鼠。各组于腹腔注射给药，每次0.2ml，除环磷酰胺组外其它各组于接种次日开始给药，每日注射2次，间隔6小时。其中模型组给予0.9％灭菌生理盐水代替HSYA；环磷酰胺对照组于接种第3d开始给药，每2d腹腔注射一次。

统计方法

所有实验数据用平均值±标准差

2、结果：

2.1HSYA对HCT-8裸小鼠移植瘤体积生长的影响

接种HCT-8细胞株后第4d，部分裸鼠肉眼可见右前腋皮下微小突起形成，随天数增加逐渐明显，第7d 18只裸鼠全部出现约0.5cm大小的瘤块，成瘤率100％。随着给药的持续，各组移植瘤继续增大，模型组肿瘤体积均明显大于给药组(见表3)。

在给药第19天后，两个HSYA组的瘤体积明显比模型组小。由表1看出在给药第19天后，HSYA-1.4mg/kg组和HSYA-0.7mg/kg组与模型组相比瘤体积明显减少，但差异不具统计学意义。

表3HSYA对人结肠癌HCT-8细胞裸小鼠皮下移植瘤体积生长的影响(mm³)(x±s，n＝6)

2.2HSYA对HCT-8裸小鼠移植瘤重量的影响

各组裸小鼠移植瘤的重量及抑瘤率见表4。由表2可看出，HSYA-1.4mg/kg、HSYA-0.7mg/kg组的瘤重明显减轻，但与模型组相比的差异不具统计学意义。

与模型组比较HSYA-1.4mg/kg、HSYA-0.7mg/kg组的抑瘤率分别为：37.80％、29.25％。

表4HSYA对人结肠癌HCT-8细胞裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用(x±s，n＝6)

3、结论：

HSYA在1.4mg/kg～0.70mg/kg/次浓度范围内，可有效抑制人结肠癌细胞HCT-8裸小鼠移植瘤的生长。抑瘤率达37.80％。

实验例3羟基红花黄色素A对人胃癌裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡实验

1、实验步骤：

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤。取模型组及抑瘤率最高的HSYA-0.7mg/kg组、HSYA-0.35mg/kg组和CTX-25mg/kg+HSYA-0.7mg/kg组共四组(每组6个样品)的新鲜瘤组织，剪取火柴头大小，加入生理盐水于研磨器中研磨，200目筛过滤除去组织团块，收集细胞悬液，1000rpm/min离心5min，沉淀用PBS洗2次，加入结合缓冲液制备单细胞悬液，取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入10ul Annexin V-FITC，5ul PI，混匀，避光4℃反应30分钟，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

统计方法同实验例1

2、结果：

Annexin V/PI双染法检测结果(见图2表5)：

表5流式细胞仪检测HSYA对人胃癌裸鼠肿瘤细胞凋亡的作用(％，x±s，n＝6)

注：**与模型组比较P＜0.01

由表5可看出，裸鼠接种人胃癌细胞BGC-823后，每天腹腔注射两次HSYA可诱导大量的肿瘤细胞凋亡。HSYA-0.7mg/kg组的早、晚期凋亡率、HSYA-0.35mg/kg组的早、晚期凋亡率、和CTX-25mg/kg+HSYA-0.7mg/kg组的早、晚期凋亡率均比模型组的早、晚期凋亡率有明显增加，呈极显著差异，有统计学意义。

3、结论：

0.7mg/kg～0.35mg/kg/次浓度的HSYA和该浓度范围内的HSYA与环磷酰胺联合用药，能诱导大量肿瘤细胞凋亡。提示HSYA诱导肿瘤细胞凋亡，是显著抑制人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤生长的作用机制之一。

实验例4透射电镜观察人胃癌裸鼠移植瘤凋亡小体

1、实验步骤：

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤。取模型组及抑瘤率最高的HSYA-0.7mg/kg组、HSYA-0.35mg/kg组和CTX-25mg/kg+HSYA-0.7mg/kg组共四组的新鲜瘤组织，冰上切成1mm³大小，4℃2.5％戊二醛溶液预固定，1％锇酸固定，常规透射电镜样品制备，半薄切片定位后行超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，H-600型透射电镜观察瘤细胞超微结构变化，并用图像采集系统显微摄像。

统计方法同实验例1

2、结果

透射电镜观察显示，模型组细胞表面微绒毛明显增多，细胞核比例很大且形态不规则，细胞内有多核现象，核仁明显，部分能见到多个核仁，核内异染色质增加，胞浆内有大量空泡。HSYA各组细胞表面微绒毛明显减少，核呈固缩状，核仁萎缩，染色质凝聚，核碎裂，出现凋亡小体(图3)

3、结论：

透射电镜结果显示，0.7mg/kg～0.35mg/kg浓度的HSYA和该浓度范围内的HSYA与环磷酰胺联合用药，能诱导肿瘤细胞出现凋亡小体。提示HSYA诱导肿瘤细胞凋亡，是显著抑制人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤生长的作用机制之一。

实验例5检测肿瘤细胞中凋亡相关因子Fas、TNF-a mRNA表达的情况

Fas是近年来发现的一种调节细胞凋亡的跨膜糖蛋白受体，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)/神经生长因子受体(NGFR)超家族成员。Fas/fasL系统是肿瘤细胞凋亡的重要途径之一，许多化疗药物和中药诱导肿瘤细胞凋亡的机制是通过在不同水平参与fas/fasL凋亡信号级联反应来实现的。在癌组织中Fas表达下调，肿瘤细胞凋亡减少，有利于肿瘤细胞的增殖。

肿瘤坏死因子(TNFα)是细胞凋亡重要的调节因子，可诱导多种细胞凋亡。TNF-α通过与细胞膜受体TNFR结合，激活一系列信号分子，传递凋亡信号，启动细胞凋亡。因此，TNF-α和其受体被称为细胞的“死亡配体和受体”之一。

本实验采用Roche LightCycler荧光定量PCR仪检测Fas、TNF-a mRNA的表达。

1、实验步骤：

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤。取模型组及抑瘤率最高的HSYA-0.35mg/kg组的新鲜瘤组织约100mg(每组6个样品)，立即投入液氮，并于-70℃冰箱中储存待用。

按照TRIzol试剂说明提取RNA，所提总RNA经0.9％的琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，并经紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。取3μg总RNA，在0ligo(dT)和M-MLV逆转录酶的作用下进行逆转录反应。按照试剂盒说明进行实时荧光定量PCR反应。

PCR反应条件：退火时间设为6s，退火温度为57℃，延伸温度72℃的延伸时间(s)依据引物bp数/25而定。循环次数45次，总反应体系20μl。反应结束后，做熔解曲线并通过琼脂糖凝胶电泳确认是否是一个扩增产物，同时读取Ct值，采用β-actin作为内参，根据标准曲线得出Fas、TNF-a mRNA的表达量。

统计方法同实验例1。

2、结果：

结果显示，0.35mg/kg浓度的HSYA能促进凋亡相关因子Fas和肿瘤坏死因子TNF-a的mRNA表达。

3、结论：

0.35mg/kg/次浓度的HSYA诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制之一是促进了凋亡相关因子Fas和肿瘤坏死因子TNF-a的mRNA表达。

实验例6羟基红花黄色素A对肿瘤细胞中FasL蛋白表达的作用

Fas/fasL系统是细胞免疫中T淋巴细胞和NK细胞杀伤肿瘤细胞的途径之一。在很多恶性度很高的如人黑色素瘤、结直肠癌、肝癌等癌细胞表面均有大量的FasL表达，有些同时还伴有Fas表达，FasL与激活的T细胞表面的Fas结合，诱导T细胞发生凋亡，从而反击宿主免疫系统，逃避机体免疫监视，导致肿瘤发生和发展。在癌组织中，Fas表达下调及FasL表达上调，肿瘤细胞凋亡减少，有利于肿瘤细胞的增殖。FasL表达的强弱可以作为某些肿瘤恶性度高低和判断预后的参考指标。

1、实验步骤：

取肿瘤，加入蛋白裂解液研磨，离心，获取含肿瘤组织蛋白的上清液，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤组织蛋白的上清液中Fas蛋白的含量，按试剂盒说明书要求，将各浓度标准品及样品加入相应的反应板孔中100μL/孔。轻轻混匀，37℃温育60min，甩尽板内液体，洗板，每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色。依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度。以A值为纵坐标，标准品浓度为横坐标制作标准曲线，根据公式计算出各样品中Fas、FasL浓度值。

统计方法同实验例1。

2、结果：

结果见表6，由表6可看出0.35mg/kg浓度的HSYA能显著抑制肿瘤细胞FasL的高表达，有统计学意义。而对Fas的蛋白含量影响不大，没有统计学意义。

表6HSYA对人胃癌裸鼠移植瘤Fas、FasL蛋白含量的影响(

n＝6)

注：与模型组比较 **P＜0.01

3、结论：

0.35mg/kg/次浓度的HSYA，能显著抑制肿瘤细胞FasL的高表达。提示HSYA能增强宿主免疫系统，逆转肿瘤细胞的免疫逃逸作用，通过调节结肠癌细胞FasL基因表达，影响肿瘤细胞和淋巴细胞的相互作用，保护淋巴细胞免受肿瘤细胞的攻击，在阻断癌细胞通过Fas/FasL途径免疫逃逸的同时，提高其对免疫效应细胞的杀伤敏感性，致使肿瘤生长缓慢。HSYA具有增强宿主免疫系统，逆转肿瘤细胞的免疫逃逸作用。

实验例7HSYA抑制肿瘤血管内皮细胞增殖的作用

(一)、免疫组织化学检测移植瘤微血管密度(MVD)

由于肿瘤的生长需要血管为之提供营养和排除代谢产物，一旦新生毛细血管长进肿瘤组织，肿瘤会迅速增长。因此，阻断肿瘤血管生成就能抑制肿瘤的生长。

检测肿瘤内微血管密度的抗体，应用较广泛的有VIII因子、CD34和CD31三个抗体，目前认为CD34抗体在微血管中表达最强，为最敏感的内皮细胞标记物，专门标记微血管。本实验采用CD34对肿瘤新生血管进行染色，应用SABC法对各实验组裸鼠移植瘤内微血管密度进行免疫组织化学染色。

1、实验步骤：

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤。取模型组、阳性药物环磷酰胺组(25mg/kg)组及抑瘤率最高的HSYA-0.35mg/kg组的新鲜瘤组织(每组6个样品)，于中性甲醛中固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，常规处理，暴露组织抗原。加入CD34一抗、生物素化二抗和SABC液，滴加新鲜DAB显色液避光显色后终止反应并封片，光镜下行微血管密度计数。

切片先在100倍低倍镜下扫查一个样本的整个切片，凡是被抗体染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个微血管计数，寻找3个高血管密度的区域，再转到高倍镜下(400倍)分别计数每个区域微血管数，取平均值作为微血管数。

统计方法同实验例1。

2、结果：

光镜下可以观察到，CD34染色部位在血管内皮细胞表面和小血管壁，为弥漫阳性，表现为杂乱无章的不规则的微血管网，癌组织内微血管不仅形态异常，差异显著，而且密度分布不均，癌组织边缘的微血管多呈簇状和发芽状生长，血管数量远高于中央区域，最高微血管染色区域几乎总是在肿瘤与周围组织交界的浸润缘(见图4。三组移植瘤组织的MVD值见表7，由表中可看出，HSYA-0.35mg/kg组经及环磷酰胺组的微血管密度比不给药的模型组减少许多，经t检验有统计学意义(P＜0.05)。

表7HSYA对人胃癌裸鼠移植瘤微血管密度MVD的影响(n＝6)

注：与模型组比较 *P＜0.05

3、结论：

0.35mg/kg/次浓度的HSYA，能显著抑制人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤生长的作用机制之一是其抑制了肿瘤组织内新血管的生成。

(二)、实时荧光定量PCR检测移植瘤VEGF及其受体KDR的mRNA的表达

研究表明，至少有30种生长因子与肿瘤的血管生成有关，其中最直接、最强烈的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)，VEGF是血管内皮细胞特异的分裂原和血管发生的关键因子。VEGF发挥其生物学作用是通过作用于血管内皮细胞上的特异性受体而实现的，内皮细胞的表面有VEGF的高亲和力受体KDR，VEGF可通过活化KDR诱导内皮祖细胞的分化，促进血管内皮细胞增殖。

1、实验步骤：

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤。取模型组和抑瘤率最高的HSYA-0.35mg/kg组的新鲜瘤组织约100mg(每组6个样品)，立即投入液氮，并于-70℃冰箱中储存待用。

采用实时荧光定量PCR检测瘤组织中VEGF及其受体KDR mRNA表达的情况。取瘤组织按照TRIzol试剂说明提取RNA，所提总RNA经0.9％的琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，并经紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。取3μg总RNA，在0ligo(dT)和M-MLV逆转录酶的作用下进行逆转录反应。最后按照试剂盒说明进行实时荧光定量PCR反应。

引物设计：VEGF：上游5’CGA GAC CCT GGT GGA CAT CT 3’下游5’ACA AAT GCTTTC TCC GCT CTG 3’，扩增片段296bp；KDR：上游5’CGG TAG CAC AGC CCA GAT TC 3’下游5’GGT CAC AAG CCT CTT CCA GGA 3’，扩增片段244bp。

PCR反应条件：退火时间设为10s，退火温度：57℃、延伸温度72℃的延伸时间(s)依据引物bp数/25而定。循环次数45次，总反应体系20μl。反应结束后，做熔解曲线并通过琼脂糖凝胶电泳确认是否是该扩增产物，同时读取Ct值，采用β-actin作为内参，根据标准曲线得出VEGF、KDR mRNA的表达量。

统计方法同实验例1。

2、结果：

表8HSYA对移植瘤VEGF、KDR mRNA表达的影响(

n＝6)

注：与模型组比较 *P＜0.05

结果见表8，由表8中可看出HSYA能显著抑制血管内皮细胞生长因子VEGF及其受体KDR的mRNA表达，有统计学意义。

3、结论：

0.35mg/kg/次浓度的HSYA，能显著抑制人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤生长的作用机制之一是其抑制了肿瘤细胞VEGF及其受体KDR的mRNA表达。

(三)、检测与血管内皮细胞生成相关因子蛋白的表达

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤。取模型组和抑瘤率最高的HSYA-0.35mg/kg组的新鲜瘤组织约100mg(每组6个样品)及裸鼠血清(眼球摘除取血)，立即投入液氮，并储存于-70℃冰箱中进行下列三个实验。

1、ELISA法检测缺氧诱导因子HIF-1α、VEGF、癌基因Ras的蛋白表达

VEGF的表达受低氧、活化的癌基因、生长因子等多种因素的调控。其中认为低氧发挥主要的调节作用，研究发现缺氧数小时后的肿瘤坏死组织中VEGF mRNA的表达急剧增加。缺氧诱导因子HIF-1是调节氧稳态平衡的转录因子，HIF-1直接调控VEGF基因的表达，是恶性肿瘤诱导新生血管形成的主要调控因子。

Ras癌基因是早期发现的可以导致正常细胞发生恶性转化的癌基因之一。VEGF能和血管内皮细胞上的受体KDR结合，活化的KDR能激活Ras-Raf-MEK-MAPK信号转导通路，引起内皮细胞的增殖效应。该通路如果受到阻断，内皮细胞的增殖会受到抑制并出现凋亡现象。

实验步骤同实验三，VEGF、Ras取裸鼠血清测的蛋白含量；HIF-1α取裸鼠肿瘤测的蛋白含量。

统计方法同实验例1。

结果：见表9，可看出HSYA能显著抑制血管内皮细胞生长因子缺氧诱导因子HIF-1α、VEGF及癌基因Ras的表达，数据有统计学意义。

表9HSYA对移植瘤VEGF、HIF-1α、Ras蛋白质表达的影响(

n＝6)

注：与模型组比较 *P＜0.05 **P＜0.01

结论：

0.35mg/kg/次浓度的HSYA，能显著抑制人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤生长的作用机制之一是其抑制了肿瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α的表达，进而抑制了VEGF的表达和其下游癌基因Ras的表达，阻止了内皮细胞的增殖并产生凋亡现象。

2、免疫组织化学检测突变型p53、NF-κB p65 IkBα的蛋白表达

p53基因分为两型：野生型p53和突变型p53。在细胞发生DNA损伤时，野生型p53蛋白会修复损伤或诱导细胞凋亡以清除损伤的细胞。突变型p53丧失了野生型p53诱导细胞凋亡的能力，它可以抑制细胞凋亡，使野生型p53的正常活性受到抑制，产生细胞的恶性转化，获得癌基因的功能。

NF-κB属于受调蛋白水解酶依赖的受体信号转导通路，可被多种外来信号如TNFα、生长因子等激活。NF-κB信号通路在大多数肿瘤细胞中都处于持续性激活状态，NF-κB的持续活化可促进肿瘤细胞的增生，抑制肿瘤细胞的凋亡，促进血管新生，提高肿瘤细胞的转移能力。抑制肿瘤细胞的NF-κB通路可以阻断细胞周期，诱导细胞调亡。NF-κB信号通路可调节多种与肿瘤侵袭相关的基因和细胞因子的表达，包括金属基质蛋白酶(MMPs)、尿激酶型纤溶酶原活化因子、白介素等。IκB是NF-κB的抑制蛋白，

实验步骤：

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离裸鼠右前腋皮下肿瘤。取模型组和抑瘤率最高的HSYA-0.35mg/kg组的新鲜瘤组织(每组6个样品)，于中性甲醛中固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，常规处理，暴露组织抗原。加入p53、NF-κB p65 IkBα一抗、生物素化二抗和SABC液，滴加新鲜DAB显色液避光显色后终止反应并封片，图像分析系统进行阳性计数。

结果：0.35mg/kg HSYA组突变型p53和NF-κB p65的蛋白表达有所减少，IkBα的蛋白有所增加。

结论：

0.35mg/kg/次浓度的HSYA通过抑制突变型p53、NF-κB p65的表达，同时通过促进IkBα的表达来抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，达到抑制裸鼠移植瘤的作用。

3、wentern blot检测移植瘤细胞磷酸化KDR的蛋白表达

VEGF能和血管内皮细胞上的受体KDR结合，活化的KDR能激活Ras-Raf-MEK-MAPK信号转导通路，引起内皮细胞的增殖效应。

实验步骤同一般wentern blot，一抗为人总KDR抗体和磷酸化KDR抗体。

结果：HSYA-0.35mg/kg药物组磷酸化KDR表达有所降低

结论：0.35mg/kg/次浓度的HSYA能抑制KDR的磷酸化，从而抑制了其下游Ras-Raf-MEK-MAPK信号转导通路的表达，进而抑制了内皮细胞的增殖效应。

实验例8羟基红花黄色素A抑制血管内皮细胞增殖的作用

在新血管的发生过程中，血管内皮细胞活化并增殖是最基本和最重要的环节。通过抑制血管内皮细胞增殖就可以抑制新生血管生成。在研究体外肿瘤血管新生的过程，要求模拟体内与肿瘤细胞共生的过程，即：血管内皮细胞与肿瘤细胞在共培养的条件下生长。

(一)HSYA对肝癌细胞HepG2分泌上清液刺激下异常增殖血管内皮细胞的抑制作用

1、实验步骤：

1.1人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定：

无菌条件下取健康产妇剖腹产分娩的新生儿脐带，注入无菌D-Hank’s液冲洗静脉内腔。注入0.1％的I型胶原酶溶液于37℃消化15～20分钟，收集消化液，加入含20％胎牛血清的M199培养基悬浮细胞后置培养瓶中，37℃，5％CO₂条件下培养，贴壁24小时后换液。待细胞80％融合后传代，经倒置显微镜观察细胞形态并用第VIII因子相关抗原检测法对细胞进行鉴定后，取3-6代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用于实验。

1.2肿瘤细胞培养及肿瘤上清液收集：

取HepG2肿瘤细胞株于DMEM培养液中常规培养并传代、换液，收集换液后2小时的细胞培养上清，离心，取上清，用DMEM培养液配成含5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％十一个浓度的肿瘤上清培养液用于下述实验。

1.3MTT法检测不同浓度HepG2肿瘤培养上清液刺激内皮细胞增殖情况

消化HUVEC，离心，用含20％胎牛血清的M199培养基制成单细胞悬液，调细胞浓度至1×10⁸·L^-1，加入96孔板，100μl/孔，每组设8个复孔。置37℃，5％CO₂孵箱内培养，贴壁后，吸出上清，加入上述配好的不同浓度HepG2肿瘤上清液100μl/孔，对照组加等量的DMEM培养液。37℃，5％CO₂培养24小时，加入MTT，继续培养4小时，加入DMSO，振荡，酶标仪测570nm A值。取8个复孔A值的均数进行统计分析，确定肿瘤细胞培养液促进内皮细胞增殖的最佳浓度。

1.4MTT法检测不同浓度HSYA对HUVEC增殖的影响

取羟基红花黄色素A用M199培养基配成终浓度为0.0073g/L、0.0037g/L、0.0018g/L、0.0009g/L、0.00045g/L五个浓度，进行如下实验：

消化HUVEC，离心，用含20％胎牛血清的M199培养基制成单细胞悬液，调细胞浓度至1×10⁸·L^-1，加入96孔板，100μl/孔，每组设8个复孔。置37℃，5％CO₂孵箱内培养，贴壁后，吸出上清，每孔加入不含血清的M199培养液190μl和上述已配好的不同浓度的HSYA 10μl，对照组只加入相同量的M199培养基。37℃，5％CO₂分别培养24、48小时后，加入MTT，继续培养4小时，加入DMSO，振荡，酶标仪测570nm A值。

1.5MTT法检测不同浓度HSYA在不同时间点对肿瘤上清液刺激后HUVEC异常增殖的抑制作用

消化HUVEC，离心，用含20％胎牛血清的M199培养基制成单细胞悬液，调细胞浓度至1×10⁸·L^-1，加入96孔板，100μl/孔，每组设8个复孔。置37℃，5％CO₂孵箱内培养，贴壁后，吸出上清，加入用M199培养液稀释的50％HepG2肿瘤上清液190μl和上述已配好的不同浓度的HSYA 10μl/孔，对照组只加入相同量的M199培养液，模型组则只加入相同量50％HepG2肿瘤上清液。37℃，5％CO₂分别培养24、48小时后，加入MTT，继续培养4小时，加入DMSO，振荡，酶标仪测570nm A值。

1.5统计分析：

数据处理采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用LSD法。P＜0.05代表有显著性差异，P＜0.01代表有极显著性差异。

2.结果

2.1各浓度HepG2肿瘤培养上清液对HUVEC增殖的促进作用。

结果见图5由图5以看出，各浓度肿瘤上清液对HUVEC增殖均有促进作用。经统计学检验，各浓度A值与对照组比较，均有极显著性差异(P＜0.01)，并且这种促进作用随肿瘤上清液浓度增加而递增，至50％时上升明显减慢，处于较稳定水平。因此，我们选取50％肿瘤上清液进行下一步实验。

2.2不同浓度HSYA对正常HUVEC的影响。

结果见表10，从表10中可看出，五个浓度的HSYA组与对照组相比，培养24小时A值均无明显差异(P＞0.05)，培养48小时后有三组A值低于正常对照组(P＜0.05)。表明在实验浓度范围内，培养24小时HSYA对正常内皮细胞的生长无明显抑制或促进作用。

表10不同浓度HSYA对正常HUVEC增殖的影响(A，n＝8)

注：与同一时间点对照组比较，*P＜0.05

2.3不同浓度HSYA在不同时间点对50％HepG2肿瘤上清诱导HUVEC增殖的抑制作用。

结果见表11，从表11中可看出，HepG2肿瘤上清液无论在24小时还是在48小时均可显著促进HUVEC增殖。而各种浓度的HSYA除0.0073g/L这个浓度在48小时无显著抑制外，其它各个浓度均可显著抑制肿瘤上清液诱导的HUVEC异常增殖，这种抑制作用特别在培养24小时最为明显(P＜0.05或P＜0.01)，并且以0.0037g/L浓度作用最强。

表11不同浓度HSYA对HepG2肿瘤上清诱导HUVEC增殖的抑制作用(A，

n＝8)

注：与同一时间点对照组比较，**P＜0.01；与同一时间点模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01

(二)不同浓度HSYA对人胃癌细胞BGC-823生长的影响

1、实验步骤：

采用MTT法。取HSYA用M199培养基配成终浓度为0.015g/L、0.0075g/L、0.0037g/L、0.0018g/L、0.0009g/L、0.00045g/L六个浓度，进行如下实验：

在96孔板上接种BGC-823肿瘤细胞，浓度为2.5x10⁴，接种24小时后给药，第一组为不加药的对照组，第2～7组分别加入终浓度为0.015g/L、0.0075g/L、0.0037g/L、0.0018g/L、0.0009g/L、0.00045g/L的HSYA组，同一浓度做4个复孔，药物作用24小时后加MTT，继续培养4小时后加入DMSO，振荡，酶标仪测570nm A值。

数理统计同实验例1

2、结果：

由表12中可看出0.015g/L～0.00045g/L浓度的HSYA具有显著抑制胃癌细胞BGC-823生长的作用，差异具统计学意义。

表12不同浓度HSYA对胃癌细胞BGC-823增殖的影响(

n＝4)

注：*与照组比较P＜0.05 **与照组比较P＜0.01

(三)不同浓度HSYA对人大肠癌细胞HCT-8生长的影响

采用MTT法。取HSYA用M199培养基配成终浓度为0.0037g/L、0.0018g/L、0.0009g/L、0.00045g/L四个浓度，进行如下实验：

在96孔板上接种HCT-8肿瘤细胞，浓度为1x10⁴，接种24小时后给药，第一组为不加药的对照组，第2～5组分别加入终浓度为0.0037g/L、0.0018g/L、0.0009g/L、0.00045g/L的HSYA组，同一浓度做8个复孔，药物作用24小时后加MTT，继续培养4小时后加入DMSO，振荡，酶标仪测570nm A值。

数理统计同实验例1

2、结果：

由表中可看出0.0037g/L～0.00045g/L浓度的HSYA具有显著抑制胃癌细胞BGC-823生长的作用，差异具统计学意义。

表13不同浓度HSYA对大肠癌细胞HCT-8增殖的影响(

n＝8)

注：**与照组比较P＜0.01

(四)HSYA对胃癌细胞BGC-823分泌上清液刺激下异常增殖血管内皮细胞的抑制作用

1、实验步骤：

1.1人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定：同实验(一)

采用MTT法。取HSYA用M199培养基配成终浓度为0.0075g/L、0.0037g/L、0.0018g/L、0.0009g/L、0.00045g/L、0.00022g/L、0.00012g/L、0.00006g/L七个浓度，进行如下实验：

取BGC-823肿瘤细胞株于DMEM培养液中常规培养并传代、换液，收集换液后2小时的细胞培养上清，离心，取上清，用DMEM培养液配成含50％的肿瘤上清培养液用于下述实验。

取新鲜脐带，D-Hanks液冲洗干净，胶原酶消化，收集细胞，用含20％胎牛血清的M199培养基制成单细胞悬液，调细胞浓度至1×10⁸·L^-1，加入96孔板，100μl/孔，每组设4个复孔。置37℃，5％CO₂孵箱内培养，贴壁后，吸出上清，加入用M199培养液稀释的50％BGC-823肿瘤上清液190μl和已配好的不同浓度的HSYA 10μl/孔，对照组只加入相同量的M199培养液，模型组则只加入相同量50％BGC-823肿瘤上清液。37℃，5％CO₂培养20小时后，加入MTT，继续培养4小时，加入DMSO，振荡，酶标仪测570nm A值。

数理统计方法同实验例1

2.结果：

在一定的浓度范围内HSYA能有效抑制胃癌细胞BGC-823分泌上清液刺激下异常增殖血管内皮细胞的作用。

结论：

通过上述4个实验，得出0.015g/L～0.00045g/L浓度的HSYA有显著抑制人胃癌细胞BGC-823及人大肠癌细胞HCT-8增殖的作用。

同时0.0075g/L～0.00006g/L浓度的HSYA有显著抑制人胃癌细胞BGC-8233分泌上清液刺激下异常增殖血管内皮细胞的作用。

实验例9羟基红花黄色素A对血管内皮细胞生长因子等相关因子的影响

(一)HSYA抑制肝癌细胞HepG2刺激下异常增殖的实验研究

消化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，离心，用含20％胎牛血清的M199培养基制成单细胞悬液，调细胞浓度至1×10⁸·L^-1，在37℃，5％CO₂条件下使细胞贴壁12h，吸出上清，加入用M199稀释的50％HepG2肿瘤上清液和终浓度为0.0037g/L的HSYA。正常组加入相同量的M199培养液，模型组只加入相同量的50％HepG2肿瘤上清液，每组做4个复孔，以上各组于37℃，5％CO₂条件下培养24h后，进行如下实验：

1、检测相关因子mRNA表达的情况：

取上述三组细胞，常规提取RNA，确定其完整性，检测RNA浓度和纯度。并进行逆转录反应。最后按照试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR反应，

通过实时荧光定量PCR检测正常组、模型组、0.0037g/L HSYA组的癌基因C-myc、癌基因N-ras、核因子NFκB和碱性成纤维因子bFGF受体bFGFR mRNA表达的情况。

结果：

见表14，由表中可看出0.0037g/L浓度的HSYA能显著抑制C-myc、N-ras、NFκB、bFGFR mRNA的表达，经统计学处理具显著性差异。

表14HSYA对C-myc、N-ras、NFκB、bFGFR mRNA表达的影响(

n＝4)

注：与模型组比较 *P＜0.05 **P＜0.01

结论：

0.0037g/L浓度的HSYA能显著抑制肝癌细胞HepG2刺激下异常增殖的血管内皮细胞，其机制之一是抑制了内皮细胞中癌基因C-myc、N-ras、核因子NFκB及碱性成纤维因子受体bFGFR mRNA的表达，

(二)ELISA法检测各种相关因子的蛋白表达

消化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，离心，用含20％胎牛血清的M199培养基制成单细胞悬液，调细胞浓度至1×10⁸·L^-1，在37℃，5％CO₂条件下使细胞贴壁12h，吸出上清，加入用M199稀释的50％BGC-823肿瘤上清液和终浓度为0.0037g/L的HSYA。正常组加入相同量的M199培养液，模型组只加入相同量的50％BGC-823肿瘤上清液，每组做4个复孔，以上各组于37℃，5％CO₂条件下培养24h后，进行如下实验：

酶联免疫吸附法(ELISA)检测上述三组细胞培养上清中与内皮细胞增殖相关因子：VEGF、bFGF、HIFa、MMP9、KDR的含量以及细胞裂解液中KDR、c-myc蛋白含量：

按照试剂盒说明书进行操作，将各组细胞消化，离心，用PBS洗涤2次，加样：设空白孔、标准孔、待测样品孔。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度。以A值为纵坐标，标准品浓度为横坐标用Excel软件制作标准曲线，根据公式计算得出各样品中上述指标的浓度值。

结果：

结果见表15，HSYA组均能显著抑制VEGF、bFGF、HIFa、MMP9、KDR和c-myc的蛋白表达，与肿瘤组比较，有显著性差异，具统计学意义。

表15羟基红花黄色素A对肿瘤上清诱导HUVEC各指标蛋白表达的影响(

n＝4)

注：和正常组比较，**P＜0.01，和肿瘤组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01

结论：

低浓度的HSYA能抑制肿瘤细胞刺激下异常增殖血管内皮细胞的生长和转移，其机制之一是显著抑制了血管内皮细胞生长因子VEGF及其受体KDR、碱性成纤维生长因子bFGF、缺氧诱导因子HIF、基质金属蛋白酶MMP-9和癌基因C-myc的表达。

实验10羟基红花黄色素A促进了内皮细胞的凋亡

1、流式细胞检测各组的凋亡率：

实验步骤：

取实验(一)中三组细胞，离心收集细胞沉淀，无菌D-Hank’s液洗涤两次，加入-20℃预冷的70％乙醇4℃固定过夜，加入碘化丙啶(PI)染色，于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

结果：

由表中可看出模型组凋亡细胞所占比例明显低于正常对照组(P＜0.05)，经HSYA作用后，凋亡细胞比例明显增多(P＜0.05)。见表16、图6。

表16HSYA对肿瘤上清诱导HUVEC凋亡的影响(％，

n＝4)

注：与正常组比较*P＜0.05 与模型组比较#P＜0.05

2、免疫组化检测HUVEC细胞培养上清中肿瘤坏死因子TNF-α含量

实验步骤：

取上述三组细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α含量，按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪检测450nm A值。以A值为纵坐标，标准品浓度为横坐标制作标准曲线，根据公式计算得出各样品中TNF-α浓度值。

结果：

模型组肿瘤坏死因子TNF-α含量比正常对照组明显降低(P＜0.05)，而HSYA给药组TNF-α含量比模型组明显升高(P＜0.05)。结果具统计学意义。见表17。

表17HSYA对肿瘤上清诱导HUVEC凋亡的影响(％，

n＝4)

注：与正常组比较*P＜0.05 与模型组比较#P＜0.05

3、荧光Tunel法检测各组细胞中凋亡细胞的数目

实验步骤：

将上述各组细胞消化，离心，调整浓度为3×10⁵个/ml，于4％中性甲醛中固定10min。按照说明书进行TUNEL荧光染色。凋亡细胞能被荧光染料染上，在显微镜下观察、计数，计算凋亡率。

结果：

见图7，HSYA组可见多个散在的凋亡细胞的荧光点，明显比正常组和肿瘤组多，说明HSYA却有促进异常增殖血管内皮细胞凋亡的作用。

结论：通过流式细胞术检测凋亡细胞、ELISA法检测凋亡相关因子TNF-a的表达、荧光Tunel法观察凋亡细胞这三个实验，从三个不同角度反映出HSYA抑制肿瘤细胞刺激下异常增殖血管内皮细胞的作用机制之一是：促进了异常增殖血管内皮细胞的凋亡。

实验例11羟基红花黄色素A对MAPK信号转导通路的影响

实验步骤：

1、收集细胞：

取新生儿脐带，消化下内皮细胞(HUVEC)，常规培养，光镜下观察细胞形态。换无血清培养液并加入50％的人肝癌细胞株HepG2培养上清液，同时加入抑制效果最好的0.0037g/L浓度的HSYA，培养24小时后，收集细胞，同时设立正常对照组(未加HepG2培养上清液和HSYA)、肿瘤诱导组(只加入HepG2培养上清液，未加HSYA)，本实验做3个复孔。

2、提取蛋白：

常规方法裂解细胞总蛋白，Lowry法测蛋白浓度。

3、Western blot：

经SDS-PAGE电泳及半干电转移仪将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。购买cellsignaling公司的有关信号转导通路中各种酶的一抗13个：Ras、总Raf、磷酸化Raf、总ERK、磷酸化ERK、总Akt、磷酸化Akt、总p38MAPK、磷酸化p38MAPK。将上述抗体分别与膜孵育过夜，X胶片显色。用凝胶成像扫描系统对胶片条带行定量密度测定。

结果：

见图8，结果显示：中药HSYA对HUVEC细胞内Ras蛋白的表达与肿瘤组相比有显著抑制作用；对磷酸化Raf蛋白的表达与肿瘤组相比有显著抑制作用；对磷酸化ERK蛋白的表达与肿瘤组相比有显著抑制作用；而对磷酸化Akt蛋白、磷酸化p38MARK蛋白的表达与肿瘤组相比没有显著抑制作用。

结论：

由上述结果可以得出，HSYA抑制内皮细胞异常增殖，主要是通过抑制Ras→Rsf→MEK→ERK这条信号转导通路的某些激酶的表达而达到作用的。

实验例12HSYA抑制肿瘤血管内皮细胞转移的作用

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能促进内皮细胞增长、分化和迁移，参与调控体内血管新生的整个过程。在此过程中，bFGF调节胶原酶、蛋白酶、尿激酶型纤溶原激活剂和整合素的活性，导致血管基底膜的降解，细胞得以侵人周围的基质，迁移、增殖和分化，最终形成新的毛细血管网络。bFGF还能促进VEGF的分泌，是VEGF的重要调节因素之一。体外实验表明bFGF可促进细胞外基质降解，并直接作用于内皮细胞，诱导其脱离基质，向肿瘤区迁移并增殖，形成新的血管。bFGF在癌组织中的表达明显高于正常组织，而且与微血管密度值增高一致。它还调节细胞的粘附、分化、浸润和转移等生物学行为。

在肿瘤血管生成过程中，血管壁发生不稳定变化，同时细胞外基质(ECM)降解以适应内皮细胞向基质迁移和肿瘤细胞向基质浸润的需要，因此，增强血管壁基膜的稳定，抑制某些能使ECM降解的酶如基质金属蛋白酶(MMPs)的活性，可阻止肿瘤血管生成及肿瘤细胞浸润，最终使肿瘤萎缩。基质金属蛋白酶MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，其主要功能是降解细胞外基质中起骨架作用的主要成分，在肿瘤介导的细胞外基质降解中起关键作用，通过降解基底膜和血管基质，参与肿瘤血管的生成。

(一)、实时荧光定量PCR检测移植瘤bFGF和MMP-9的mRNA的表达

本实验采用Roche LightCycler荧光定量PCR仪检测bFGF和MMP-9的mRNA的表达。

1、实验步骤：

按照TRIzol试剂说明提取RNA，所提总RNA经0.9％的琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，并经紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。取3μg总RNA，在Oligo(dT)和M-MLV逆转录酶的作用下进行逆转录反应。按照试剂盒说明进行实时荧光定量PCR反应。

引物设计：bFGF上游5’AGG ACC TGG GCA GAA AGC TA 3’、下游5’AGC TTC ACT GGGTAA CAG CAG 3’，扩增片段284bp；MMP-9上游5’GGC ACC TTG TCT TCA GGT ACC A 3’、下游5’TGC AGC ACC AGG TTC TTG ACA 3’，扩增片段276bp

PCR反应条件：退火时间设为10s，退火温度为50℃，延伸温度72℃的延伸时间(s)依据引物bp数/25而定。循环次数45次，总反应体系20μl。反应结束后，做熔解曲线并通过琼脂糖凝胶电泳确认是否是一个扩增产物，同时读取Ct值，采用β-actin作为内参，根据标准曲线得出bFGF和MMP-9mRNA的表达量。

统计方法同实验例1。

2、结果：

见表18，结果显示，0.35mg/kg浓度的HSYA能抑制碱性成纤维细胞生长因子bFGF和基质金属蛋白酶MMP-9的mRNA表达，结果有统计学意义。

表18HSYA对移植瘤VEGF、KDR mRNA表达的影响(

n＝6)

注：与模型组比较 *P＜0.05

3、结论：

0.35mg/kg浓度的HSYA通过抑制碱性成纤维细胞生长因子bFGF、基质金属蛋白酶MMP-9的mRNA表达，阻止了肿瘤血管内皮基底膜的降解和血管内皮细胞的转移，是抑制肿瘤内新血管生成、肿瘤生长的作用机制之一。

(二)、ELISA法检测移植瘤bFGF和MMP-9的蛋白表达

实验步骤同实验三，bFGF指标是取裸鼠血清测的蛋白含量；MMP-9指标是取裸鼠肿瘤测的蛋白含量。

统计方法同实验例1。

结果：

见表19，可看出0.35mg/kg浓度的HSYA能显著抑制碱性成纤维细胞生长因子bFGF、基质金属蛋白酶MMP-9的表达，经t检验有统计学意义。

表19HSYA对移植瘤bFGF、MMP-9蛋白质表达的影响(

n＝6)

注：与模型组比较 *P＜0.05 **P＜0.01

结论：

0.35mg/kg浓度的HSYA通过抑制碱性成纤维细胞生长因子bFGF、基质金属蛋白酶MMP-9的表达，阻止了肿瘤血管内皮基底膜的降解和血管内皮细胞的转移，是抑制肿瘤内新血管生成、肿瘤生长的作用机制之一。

实验例13HSYA抑制肿瘤标志物的生成

肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增生过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或是肿瘤与宿主相互作用而产生的一类物质。这类物质可在细胞、组织或体液中出现，反映着肿瘤的存在与生长。胃癌肿瘤标志物由胃癌组织产生后，多经淋巴引流进入血液循环，在血清中含量的高低取决于肿瘤组织产生的量。

CA199是1979年从人结肠癌细胞株中提取的抗原，临床上用于胰腺癌、大肠癌、胃癌的诊断，是一种特异性较高的肿瘤标志物。CEA是在人的结肠癌和胰腺癌组织中提出的一种糖蛋白。目前常把它作为消化道恶性肿瘤的肿瘤标志物。

本实验通过ELISA法，检测裸鼠接种人胃癌BGC-823移植瘤后，血清中的CA199和CEA的表达，探索HSYA抑制肿瘤的机制。

1.实验步骤：

人胃癌细胞BGC-823裸鼠移植瘤造模同实验例1，第20天将全部裸小鼠颈椎脱臼处死，摘取眼球取血，离心，取血清。取模型组和抑瘤率最高的HSYA-0.35mg/kg组的血清进行常规ELISA实验，检测指标：CA199和CEA。

2、结果：

见表可看出0.35mg/kg浓度的HSYA能显著抑制肿瘤标志物CA199和CEA的表达，呈极显著性差异，数据有统计学意义。

表20HSYA对荷瘤裸鼠CA199和CEA蛋白质表达的影响(

n＝6)

注：与模型组比较 **P＜0.01

结论：HSYA抑制裸鼠肿瘤生长的作用机制之一是其抑制了肿瘤标志物CA199和CEA的表达。

附图说明

图1：HSYA-0.35mg/kg组(A)与模型组(B)移植瘤光镜下病理形态学观察(HE×200)

A：肿瘤细胞坏死明显 B：有大量癌巢

图2人胃癌裸鼠肿瘤各组的Annexin V/PI双染法流式细胞仪图

A：模型组 B：HSYA-0.7mg/kg 组 C：HSYA-0.35mg/kg 组 D：CTX+HSYA组

图3透射电镜显示模型组及各药物组人胃癌裸鼠肿瘤细胞的形态(TEM×8000)

A：模型组 B：HSYA-0.7mg/kg 组 C：HSYA-0.35mg/kg 组 D：CTX-25mg/kg+HSYA-0.7mg/kg组

图4人胃癌裸鼠移植瘤微血管密度(×400)

A：模型组 B：环磷酰胺组 C：HSYA-0.35mg/kg组

图5各浓度HepG2肿瘤上清液对HUVEC增殖的影响

图6各组流式细胞图

A：正常对照组流式细胞图B：肿瘤上清诱导组流式细胞图C：HSYA组流式细胞图

图7TUNEL法显示各组血管内皮细胞凋亡图

A：正常组 B：肿瘤组 C：.0037g/L HSYA组

图8各组MAPK信号转导通路相关因子Western结果

A：Ras蛋白 B：总Raf蛋白 C：磷酸化Raf蛋白 D：总Erk蛋白 E：磷酸化Erk蛋白F：总Akt蛋白 G：磷酸化Akt蛋白 H：总p38蛋白 I：磷酸化p38蛋白

A、B、C——正常组；D、E、F——肿瘤组；G、H、I——HSYA组

具体实施方式

实施例1：胶囊剂

羟基红花黄色素A 10g，加入常规辅料制成2000粒胶囊。日服2粒。

实施例2：粉针剂

取羟基红花黄色素A 5g，加注射用水300g溶解，调节pH为7，121℃热压0.7kg/cm²灭菌35分钟，微孔滤膜过滤后超滤，超滤液分装于西林瓶，冷冻干燥。

Claims

1.羟基红花黄色素A在制备治疗、辅助治疗或预防肿瘤药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述的肿瘤为胃癌、结肠癌、大肠癌或肝癌。

3.羟基红花黄色素A在制备使癌瘤细胞凋亡的药物中的应用。

4.羟基红花黄色素A在制备促进Fas和肿瘤坏死因子TNF-a的表达药物中的应用。

5.羟基红花黄色素A在制备抑制肿瘤细胞FasL的高表达药物中的应用。

6.羟基红花黄色素A在制备抑制VEGF及其受体KDR、bFGF及其受体bFGFR的表达和其下游癌基因Ras的表达药物中的应用。

7.羟基红花黄色素A在制备抑制突变型p53、NF-κB p65基因表达药物中的应用。

8.羟基红花黄色素A在制备抑制癌基因C-myc、癌基因N-ras、核因子NFκB mRNA表达药物中的应用。

9.一种治疗肿瘤的药物组合物，其中该组合物由日用剂量为1.0-20mg的羟基红花黄色素A和药学上可接受的载体制成。

10.一种治疗肿瘤的药剂盒，该药剂盒由羟基红花黄色素A的制剂和环磷酰胺制剂组成，其中活性成分的重量比为20-30∶0.5-2。