CN105521327B - 预防和/或治疗酒精性肝病或肝癌的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物领域，特别涉及一种药物组合物及其应用，该药物组合物含有以下原料：黄芪10‑30重量份、枸杞子5‑25重量份、松叶4‑20重量份、橘叶3‑9重量份、竹叶3‑9重量份、芦根3‑9重量份。本发明以黄芪、枸杞子、松叶、橘叶、竹叶、芦根作为原料，以药理为基础，各个原料之间的功效相互协同作用，保肝效果优异，所以可以用于酒精性肝病和肝癌的药物的制备。

Description

预防和 / 或治疗酒精性肝病或肝癌的药物组合物

技术领域

本发明属于药物领域，特别涉及一种药物组合物及其应用，具体地，涉及一种药物组合物及其在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病或肝癌的药物中的应用。

背景技术

近年来，我国酒精性肝病和肝癌的发病率在逐年增加。

酒精性肝病(alcoholic liver disease ALD)是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病。酒精性肝病初期通常表现为脂肪肝，酒精性脂肪肝是最早、最常见的慢性肝损害之一，进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死甚或肝功能衰竭。酒精滥用、酒精依赖和过量饮酒是当今世界范围内日益严重的公共卫生问题，酒精性肝病近年来有增加的趋势，与病毒性肝炎成为肝脏疾病的两大原因。随着人民生活水平的提高及应酬接待、聚会饮酒场合的增加，在我国因酒精性肝病住院的病例数也呈逐年上升的趋势。流行病学资料表明，在我国12亿人口中，约有3亿饮酒人口，东北地区酒精性肝病的发病率在肝病患者中高达20％。目前，酒精性肝损伤发病机制尚不明确，酒精性肝病的治疗手段主要是采用戒酒、增加营养、体育锻炼等综合手段，药物治疗大多处于试验阶段，国内外亦无防治的理想药物，因此，寻找有效、安全的药物来防治酒精性肝损伤变得尤为重要。

我国每年因肝癌死亡的患者高达60万人，达到全球肝癌总患者总数的50％以上，且近些年发病率呈现一定的上升势态。当前临床通常采用手术以及放疗和化疗的方式进行治疗肝癌治疗，虽对抑制肿瘤细胞的增生起到了一定的效果，但往往同时对患者自身也产生较大的毒副作用但往往伴随较大的毒副作用。随着临床经验的不断丰富，近年来中医药治疗肝癌的方式逐步得到认可。中药可以通过提高患者抗氧化作用等方式，诱导肿瘤细胞的凋亡，达到防癌治癌的目的。同时中药性质比较温和，对患者身体的损伤较小，具 有较很强的临床应用和推广价值。但目前暂无此类的中药问世。

因此，在目前在中医药领域中，亟需研发出一种对于酒精性肝病和肝癌具有良好的治疗作用的药物。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种药物组合物及其应用，该药物组合物的原料中包括黄芪、枸杞子、松叶、橘叶、竹叶、芦根，可以应用于预防和/或治疗酒精性肝病和肝癌的药物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种药物组合物，含有如下重量份数比的原料：

黄芪10-30重量份、枸杞子5-25重量份、松叶4-20重量份、橘叶3-9重量份、竹叶3-9重量份、芦根3-9重量份。

上述药物组合物的优选的实施方式中，该药物组合物含有如下重量份数比的原料：

黄芪15-25重量份、枸杞子10-20重量份、松叶8-16重量份、橘叶5-7重量份、竹叶5-7重量份、芦根5-7重量份。

上述药物组合物的优选的实施方式中，该药物组合物含有如下重量份数比的原料：

黄芪20重量份、枸杞子15重量份、松叶12重量份、橘叶6重量份、竹叶6重量份、芦根6重量份。

上述药物组合物的优选的实施方式中，所述药物组合物还含有一种或多种药学上可接受的载体。

上述药物组合物的优选的实施方式中，所述药物组合物可以为临床上任何可接受的剂型。

上述药物组合物的优选的实施方式中，所述剂型包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型。

上述药物组合物的优选的实施方式中，所述剂型选自片剂、胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊、水针、冻干粉针、无菌粉针和输液中的任意一种。

上述药物组合物的优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体选自填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体；溶剂、 抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂和pH调节剂中的至少一种。

上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的应用。

上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。

本发明相比现有技术具有如下有益效果：

本发明以黄芪、枸杞子、松叶、橘叶、竹叶、芦根作为原料，以药理为基础，各个原料之间的功效相互协同作用，保肝效果优异，所以可以用于制备预防和/或治疗酒精性肝病和肝癌的药物。

附图说明

图1为测试例3中大鼠肝脏肝纤维化相关指标的检测结果柱状图。

图2为测试例3中大鼠血清抗氧化指标的检测结果柱状图。

图3为测试例3中大鼠肝损伤指标以及炎性细胞因子水平的检测结果柱状图。

图4为测试例3中大鼠肝星形细胞活化指标表达水平的检测结果柱状图。

图5为测试例4中药物组合物对HepG2细胞增殖的作用柱状图。

图6为测试例4中流式细胞仪检测药物组合物对HepG2细胞凋亡的作用图。

图7为测试例4中药物组合物对小鼠肿瘤生长的作用的照片。

图8为测试例4中药物组合物对小鼠肿瘤生长作用变化曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有按重量份计算的如下原料：

黄芪10-30重量份、枸杞子5-25重量份、松叶4-20重量份、橘叶3-9重量份、竹叶3-9重量份、芦根3-9重量份。

优选地，在本发明的药物组合物中，含有按重量份计算的如下原料：

黄芪15-25重量份、枸杞子10-20重量份、松叶8-16重量份、橘叶5-7 重量份、竹叶5-7重量份、芦根5-7重量份。

进一步优选地，在本发明第一方面提供的药物组合物中，含有按重量份计算的如下原料：

黄芪20重量份、枸杞子15重量份、松叶12重量份、橘叶6重量份、竹叶6重量份、芦根6重量份。

示例性地，上述黄芪可以为10重量份、15重量份、18重量份、20重量份、23重量份、28重量份、30重量份等中任意值或任意两者之间的范围；

上述枸杞子可以为5重量份、8重量份、10重量份、15重量份、20重量份、23重量份、25重量份等中任意值或任意两者之间的范围；

上述松叶可以为4重量份、5重量份、10重量份、13重量份、15重量份、18重量份、20重量份等中任意值或任意两者之间的范围；

上述橘叶可以为5重量份、6重量份、6.5重量份、7重量份等中任意值或任意两者之间的范围；

上述竹叶可以为3重量份、5重量份、7重量份、8重量份、9重量份等中任意值或任意两者之间的范围；

上述芦根可以为3重量份、5重量份、7重量份、8重量份、9重量份等中任意值或任意两者之间的范围。

在本发明的药物组合物中，所述黄芪(拉丁学名Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.)为豆科黄芪属植物；在我国主产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地，因此也又名北芪。在黄芪的叶中含有较高的黄酮和皂苷，其中黄酮有抗炎、抗氧化、保护脑缺血等多方面的药理作用。在本发明的药物组合物中，可以采用黄芪的任何部分作为原料，优选采用黄芪的根和/或叶。所述黄芪优选采用正北芪。

在本发明的药物组合物中，所述枸杞子为枸杞属植物的果实。在本发明的药物组合物中，所述枸杞子优选为宁夏枸杞(拉丁学名Lycium barbarum L)的果实。枸杞子功能主治滋补肝肾，益精明目。

在本发明的药物组合物中，所述松叶为松科松属植物(拉丁学名Pinus)的针叶。松叶具有祛风燥湿、杀虫止痒、活血安神的功效。在本发明的药物组合物中，所述松叶例如可以为马尾松(拉丁学名Pinus massoniana Lamb.) 或油松(拉丁学名Pinus tabulaeformisCarr.)的松叶。

在本发明的药物组合物中，所述橘叶为芸香科植物橘(拉丁学名Citrusreticulata)的叶。在本发明的药物组合物中，所述橘叶例如可以为甜橘(C.pondi Tanaka)或乳橘(C.dinokuni Tanaka)的叶。橘叶功能主治疏肝，行气，化痰，消肿毒。

在本发明的药物组合物中，所述竹叶为禾本科植物淡竹(拉丁学名Phyllostachysglauca McClure)的叶。竹叶具有清热除烦、生津利尿的功效，可用于主治热病烦渴、小儿惊痫、咳逆吐衄、小便短赤和口糜舌疮。

在本发明的药物组合物中，所述芦根为禾本科植物芦苇(拉丁学名Phragmitesaustralis(Cav.)Trin.ex Steud)的根茎。芦根具有热病烦渴、胃热呕吐、肺热咳嗽、肺痈吐脓、热淋涩痛的功效。

本发明的药物组合物可以为临床上任何可接受的剂型形式，包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型，例如片剂、胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口腔崩解片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊、水针、冻干粉针、无菌粉针和输液中的任意一种。

本发明的药物组合物，可以含有一种或多种药学上可接受的载体。该药学上可接受的载体可以为选自填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体、溶剂、抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂和pH调节剂中的至少一种。

第二方面，本发明还提供了上述药物组合物的制备方法，剂型以煎煮液为例，包括以下步骤：

步骤一、清洗：按照上述配比称取各个原料，清洗处理后晾干。

步骤二、煎煮：将清洗后的各个原料混合在一起，按照各个原料的总重量和水的重量比1：(5-15)的比例与水混合，进行煎煮处理5-20min，再进行冷却处理至室温，再经过过滤处理，收集煎煮液，即为本发明的药物组合物。

作为一种优选的实施方式，上述药物组合物的制备方法中，剂型以煎煮液为例，也可以将各种原料分别煎煮，包括以下步骤：

步骤一、清洗：按照上述配比称取各个原料，清洗处理后晾干。

步骤二、煎煮：将清洗后的各个原料分别按照原料的重量和水的重量比1：(5-15)的比例与水混合，进行煎煮处理5-20min，再进行冷却处理至室温，再经过过滤处理，收集各个原料的煎煮液。

步骤三、混合：混合上述各个原料的煎煮液，得到总煎煮液，即为本发明的药物组合物。

示例性地，上述重量份数比可以为1：5、1：8、1：10、1：12、1：15等中任意值或任意两者之间的范围；

上述煎煮时间可以为5min、8min、10min、13min、15min、18min、20min等中任意值或任意两者之间的范围。

本发明的其他剂型可使用药物制剂工艺学中惯常使用的任何方法生产，没有特别限制。

第三方面，本发明还提供了根据本发明的药物组合物在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的应用，以及预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。

以下将通过具体的实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

本实施例用以提供一种药物组合物，该药物组合物包括以下原料：

黄芪(选用正北芪的叶)20g、枸杞子15g、松叶12g、橘叶6g、竹叶6g、芦根6g。

本实施例的药物组合物的制备方法为：

称取上述各个原料混合后，加入500mL水中，加热煮沸10min，冷却至室温后过滤除去固体残余物，收集液体成分，获得药物组合物。

实施例2

本实施例用以提供一种药物组合物，该药物组合物包括以下原料：

黄芪(选用正北芪的叶)15g、枸杞子20g、松叶8g、橘叶7g、竹叶5g、芦根7g。

本实施例的药物组合物的制备方法为：

称取上述各个原料混合后，加入600mL水中，加热煮沸15min，冷却至室温后过滤除去固体残余物，收集液体成分，获得药物组合物。

实施例3

本实施例用以提供一种药物组合物，该药物组合物包括以下原料：

黄芪(选用正北芪的叶)25g、枸杞子10g、松叶16g、橘叶5g、竹叶7g、芦根5g。

本实施例的药物组合物的制备方法为：

称取上述各个原料混合后，加入750mL水中，加热煮沸20min，冷却至室温后过滤除去固体残余物，收集液体成分，获得药物组合物。

实施例4

本实施例用以提供一种药物组合物，该药物组合物包括以下原料：

黄芪30g(选用正北芪的叶)、枸杞子25g、松叶20g、橘叶9g、竹叶9g、芦根9g。

本实施例的药物组合物的制备方法为：

称取上述各个原料混合后，加入1000mL水中，加热煮沸20min，冷却至室温后过滤除去固体残余物，收集液体成分，获得药物组合物。

测试例1

本测试例的目的是检测实施例1的药物组合物在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的用途。

本测试例中，观察该药物组合物，又称为“芪叶保肝饮”(Liver-protectingdrinking from Stilbene leaf，缩写为SPDS)治疗酒精性肝病的疗效和安全性，并与小柴胡汤进行对比。

1、资料与方法

1.1、病例选择

2013年7月-2014年6月期间，招募已强行戒酒的酒精性肝病患者200例，随机分为两组，分别口服芪叶保肝饮或小柴胡汤(具体为广州白云山光华制药股份有限公司生产的白云山小柴胡颗粒的冲剂)进行治疗。

1.2、诊断标准

参照中华医学会肝病学分会酒精性肝病学组2006年2月修订的酒精性肝病诊疗指南中推荐的酒精性肝病临床诊断标准：

(1)有长期饮酒史，一般超过5年，折合酒精量男性≥40g/d，女性≥20g/d；或2周内有大量饮酒史，折合酒精量＞80g/d。但应注意性别、遗传易感性等因素的影响。酒精量换算公式为：g＝饮酒量(ml)×酒精含量(％)×0.8。

(2)临床症状为非特异性，可无症状，或有右上腹胀痛，食欲不振、乏力、体重减轻、黄疸等；随着病情加重，可有神经精神、蜘蛛痣、肝掌等症状和体征。

(3)血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素、凝血酶原时间和平均红细胞容积(MCV)等指标升高，禁酒后这些指标可明显下降，通常4周内基本恢复正常，AST/ALT>2，有助于诊断。

(4)肝脏B超或CT检查有典型表现。

(5)排除嗜肝病毒的感染、药物和中毒性肝损伤等。

1.3、入组标准

符合以下所有标准的受试者方可参加试验：(1)经研究者诊断确诊的酒精性肝病患者。(2)男性或女性患者，年龄18岁-75岁。(3)可配合治疗方案，治疗期间戒酒。(4)可与研究者进行自由的沟通，无语言和表达障碍，无精神神经、心脑血管等系统的疾病。(5)签署书面的知情同意书。

1.4、排除标准

符合下列任何一条的受试者将不能参加本试验：(1)怀孕或哺乳期妇女，参加试验期间无妊娠计划。(2)有多种药物过敏史，可能对试验用药过敏的患者。(3)合并乙肝、丙肝等肝脏疾病的患者。(4)入组前3个月参加过其他临床试验者。(5)入组后需合并使用保肝药物的患者。

1.5、治疗方法

入组的200例受试者分别口服芪叶保肝饮及小柴胡汤，每日一副，分早晚于饭前服用。三个月为一个疗程，连续服用2个疗程。用药期间，受试者需戒酒，并禁止服用其他治疗酒精性肝病的任何药物。

1.6、观察指标

观察受试者治疗前后的临床症状，包括乏力、食欲减退、恶心、呕吐、 肝区疼痛、黄疸及肝脾肿大等。

给药前及给药开始后每2周记录受试者症状体征变化。

在受试者服用试验药物前、开始服用试验药物后每4周检查肝功能(谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、总胆红素TBil、碱性磷酸酶ALP、γ-谷氨酰转肽酶GGT、血脂(低密度脂蛋白LDL、甘油三酯TG、总胆固醇TC)及肝纤维化标志物(层黏蛋白LN、Ⅲ型前胶原肽PⅢP、透明质酸HA、Ⅳ型胶原纤维ColⅣ)。

治疗前、开始服用试验药物治疗后每3个月进行一次腹部B超检查。

1.7、疗效判定标准

根据《中药新药临床研究指导原则》(2002年版)，确定疗效评价标准为：

治愈：临床症状消失、肝功能恢复正常。

显效：临床症状基本消失，肝功能明显恢复，ALT、AST恢复到正常值范围，或稍有异常但经研究者判断无临床意义。

有效：临床症状改善，ALT、AST值下降50％以上。

无效：临床症状无缓解或加重，肝功能未恢复或加重。

总有效率＝治愈率+显效率+有效率。

1.8、统计分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。数据以均值±标准差表示，计数资料采用χ²检验，计量资料采用t检验。

2、结果

2.1、人口学分析

本试验共入组200例酒精性肝病患者，其中芪叶保肝饮组100例，小柴胡汤组100例，芪叶保肝饮组完成试验数95例，脱落4例，剔除1例。小柴胡汤组完成试验数93例，脱落6例，剔除1例。两组脱落率、剔除率比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

治疗前芪叶保肝饮组男性90例，女性5例，年龄35-69岁，平均年龄为：55±7.950岁，饮酒量(折合乙醇量)50-300g/d，临床诊断为酒精性脂肪肝66例，酒精性肝炎9例，酒精性肝硬化20例，饮酒年限5-30年，平均为13.73±6.06年。小柴胡汤组男性90例，女性3例，年龄35-67岁，平均年龄55±8.265岁，饮酒量(折合乙醇量)50-280g/d，临床诊断为酒精性脂肪肝64例，酒精性肝炎10例，酒精性肝硬化19例，饮酒年限4-32年，平均为13.58±3.37 年。

两组受试者之间年龄、性别、饮酒量、临床症状比较，组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2、两组患者总体疗效比较

芪叶保肝饮组临床治愈24例，显效39例，有效24例，无效8例，总有效率91.58％。小柴胡冲剂组临床治愈16例，显效29例，有效30例，无效18例，总有效率80.65％。芪叶保肝饮治疗组总体疗效明显优于小柴胡汤组(P＜0.05)。

表1两组患者总体疗效比较

注：两组总有效率比较，P＜0.05.

2.3、两组患者治疗前后临床症状比较

芪叶保肝饮组对酒精性肝病患者的乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝区疼痛、黄疸及肝脾肿大等症状均有明显的改善作用，芪叶保肝饮组患者治疗后及随访6个月时上述症状的改善比例明显优于小柴胡汤组，但两组比较没有明显的统计学差异(P＞0.05)。

2.4、两组患者治疗前后肝功能变化的比较

两组患者在治疗前肝功能(ALT、AST、TBil、ALP、GGT)检查均明显高于正常值范围上限，治疗后两组患者ALT、AST、TBil、ALP、GGT的降低与治疗前比较均有显著性差异(P<0.05)。治疗后芪叶保肝饮组患者ALT、AST、TBil、ALP、GGT的数值有低于小柴胡汤组相应指标的趋势。

表2两组患者治疗前后肝功能变化的比较

注：两组各项指标，与疗前比较均有显著性差异，*P＜0.05

2.5两组患者治疗前后血脂变化的比较

两组患者在治疗前血脂(低密度脂蛋白LDL、甘油三酯TG、总胆固醇TC)检查均明显异常，治疗后两组患者血脂改善明显。芪叶保肝饮组治疗后较治疗前低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)均有较显著的降低，且甘油三酯(TG)的降低优小柴胡汤组(P<0.05)，低密度脂蛋白(LDL)及总胆固醇(TC)的降低优于小柴胡组，但两组间比较没有显著性差异。

表3两组患者治疗前后血脂变化的比较

注：两组各项指标，与疗前比较均有显著性差异，*P＜0.05；芪叶保肝饮组与小柴胡汤组比较TG的降低有显著性差异△＜0.05。

2.6两组患者治疗前后肝纤维化标志物变化的比较

两组患者服用2个疗程的试验药物治疗后，肝纤维化标志物层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、透明质酸(HA)及Ⅳ型胶原纤维(ColⅣ)值均有一定程度的降低，见表4。

表4两组患者治疗前后肝纤维化标志物变化的比较

2.7两组患者治疗前后影像学的改善情况比较

两组患者治疗3个月、治疗6个月时的B超诊断与治疗前的B超诊断相比，脂肪肝均有一定程度的改善。

2.8安全性

两组患者在服用药物治疗期间，无因药物相关不良反应停药或脱落的情 况发生。结合患者随访时的生命体征、实验室检查及主诉，未发现与服用芪叶保肝饮或小柴胡汤相关的不良反应。

3讨论

近年来，我国酒精性肝病的发病率逐年增高，酒精性脂肪肝是最早、最常见的慢性肝损害之一，因其可逐渐发展为肝纤维化、肝硬化危害极大。目前，酒精性肝损伤发病机制尚不明确，国内外亦无防治的理想药物，因此，寻找有效、安全的药物来防治酒精性肝损伤变得尤为重要。

本测试例的结果表明，芪叶保肝饮对酒精性肝病患者有明显的治疗作用。酒精性肝病患者服用芪叶保肝饮治疗6个月后，总有效率明显优于服用小柴胡汤治疗的患者。酒精性肝病患者服用芪叶保肝饮及小柴胡汤均可明显改善食欲减退、恶心、呕吐、肝区疼痛及黄疸等临床症状，患者肝功能、血脂及肝纤维化标志物检查均有明显的改善。

测试例2

本测试例的目的也是检测实施例1的药物组合物在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的用途。

本测试例中，观察药物组合物(又称为“芪叶保肝饮”)治疗有效的酒精性肝病患者的远期预后情况。

1、资料与方法

1.1、一般资料

2013年7月-2014年6月期间，共招募100例酒精性肝病患者，男性90例，女性5例，年龄范围35-69岁，平均年龄：55±7.95岁，饮酒量(折合乙醇量)50-300g/d，饮酒年限5-30年，平均为13.73±6.06年，临床诊断为酒精性脂肪肝66例，酒精性肝炎9例，酒精性肝硬化20例。

酒精性肝病的诊断参照中华医学会肝病学分会酒精性肝病学组2006年2月修订的酒精性肝病诊疗指南中推荐的酒精性肝病临床诊断标准。所有入组的受试者均经研究者诊断确诊且为已强行戒酒的酒精性肝病患者，治疗期间可配合治疗方案并戒酒，可与研究者进行自由的沟通，无语言和表达障碍，无精神神经、心脑血管等系统的疾病。入组前所有受试者均签署书面的知情同意书。

排除妊娠或哺乳期妇女、有多种药物过敏史或可能对试验用药过敏的患 者、合并乙肝、丙肝等肝脏疾病或入组后需合并使用保肝药物的患者以及入组前3个月参加过其他临床试验者。

1.2、研究方法

入组的受试者口服芪叶保肝饮，每日一剂，分早晚于饭前服用，3个月为一个疗程，连续服用2个疗程。用药结束后，进行疗效判定。疗效判定标准根据《中药新药临床研究指导原则》(2002年版)确定，分治愈、显效、有效及无效四个级别，各个级别的评定标准如下：

治愈：临床症状消失，肝功能恢复正常。

显效：临床症状基本消失，肝功能明显恢复，ALT、AST值恢复到正常值范围，或稍有异常但经研究者判断无临床意义。

有效：临床症状改善，ALT、AST值下降50％以上。

无效：临床症状无缓解或加重，肝功能未恢复或加重。

治愈率+显效率+有效率＝总有效率。

疗效判定有效的患者，继续进行6个月的电话随访。随访期间，每月电话与患者及家属沟通一次，每次15-20min，电话随访内容包括：了解上次随访至今患者是否一直戒酒，合理饮食、正常社会交往等执行情况，针对存在的各种不健康的生活方式进行干预，督促患者严格戒酒、合理饮食、按时复查、保持良好的社交状态。

在用药前、用药结束时及用药结束后第6个月随访时，检查患者肝功能、血脂及血清转化生长因子(TGF-β)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的水平。

2、结果

芪叶保肝饮组完成试验数95例，脱落4例，剔除1例。完成临床试验的95例患者中，治愈24例，显效39例，有效24例，无效8例，总有效率91.58％。

对治愈有效的87例患者继续进行随访，在随访的第6个月末，失访5例，接受随访的82例患者中，严格戒酒、合理饮食并保持健康生活方式者62例(75.6％)，复饮者20例(24.4％)。

在用药前、用药结束时及用药结束后第6个月随访时，患者的肝功能(ALT、AST、TBil、GGT)变化如下：

表5患者治疗前、治疗结束时及治疗结束后第6个月肝功能变化的比较

注：*与治疗前比较，有显著性差异(P＜0.05)

在用药前、用药结束时及用药结束后第6个月随访时，患者的血脂(低密度脂蛋白LDL、甘油三酯TG、总胆固醇TC)变化如下：

表6患者治疗前、治疗结束时及治疗结束后第6个月血脂变化的比较

注：*与治疗前比较，有显著性差异(P＜0.05)

在用药前、用药结束时及用药结束后第6个月随访时，患者的血清转化生长因子(TGF-β)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的水平。

表7患者治疗前、治疗结束时及治疗结束后第6个月血清TGF-β、IL-6和IL-8的水平变化的比较

注：*与治疗前比较，有显著性差异(P＜0.05)

3、讨论

酒精性肝病的发生与乙醇及其代谢产物的毒性作用、脂质过氧化、炎症介质、细胞因子、内毒素、肝脏纤维化及免疫调节紊乱等有关。酒精性肝病的治疗主要是采用戒酒、增加营养、体育锻炼等综合手段，药物治疗大多处于试验阶段。

正北芪、枸杞子、松叶、橘叶、竹叶和芦根组成的芪叶保肝饮治疗酒精性肝病取得了较好的治疗效果。酒精性肝病患者服用芪叶保肝饮治疗6个月后，肝功能各项指标均有一定程度的恢复，血脂水平降低，TGF-β、IL-6和IL-8的水平降低，临床评价总体有效率达到91.58％，显示出较好的应用前景。

测试例3

本测试例的目的也是检测实施例1的药物组合物在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的作用。

本测试例中，通过药物组合物(又称为“芪叶保肝饮”)对大鼠肝脏纤维化及星形细胞的纤维化研究，说明该药物组合物可以抑制星形细胞的活化，从而减轻CCl4诱导的肝脏纤维化。

1、材料和方法

1.1、实验动物与设计

选取体重230±12g，11周龄左右的雄性SD大鼠30只(北京市实验动物中心提供)，并饲养于控温控湿12h光照的环境中，自由饮食。依据体重，将大鼠随机分成3组，每组10只，分别为对照组、模型组和SPDS保护组。模型组和SPDS保护组大鼠均于皮下注射400ml·L^{- 1}CCl₄花生油溶液，剂量为2ml·kg^-1，每周2次，首次剂量加倍。SPDS组在注射CCl₄的同时，以15ml/kg的剂量标准灌服芪叶保肝饮溶液，每日2次。以上两组大鼠给予含5g·kg^-1胆固醇和200g·kg^-1猪油的高脂饮食。对照组给予普通饮食并同时皮下注射等量花生油溶剂。三组均自由采食，不限饮水。

实验结束时，全部动物禁食12小时，经腹腔注射苯巴比妥钠(40mg·kg^-1)麻醉后通过颈椎脱臼处死，开胸、剖开腹腔，收集血液并对血清进行分析。迅速取出肝脏，并用4℃生理盐水清洗干净，取样分别用于制作肝匀浆、固定组织样品。

1.2、肝纤维化指标的测定及组织病理学研究

透明质酸(hyaluronic acid，HA)、Ⅳ型胶原(type IV collagen，CⅣ)、层粘连蛋白(Laminin,LN)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)浓度通过放免测定(试剂：中国医学科学院基础医学研究所)；用分光光度计测定。

取部分肝组织以10％的中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋和HE、Masson染色，由半定量的方法对肝纤维化程度进行评估。

1.3、肝脏抗氧化指标的测定

肝匀浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以及乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活力使用754型紫外分光光度计测定，试剂盒均采购于南京建成科技有限公司。

MDA：葡萄糖对硫代巴比妥酸反应的比色测定。

LDH：其定义为每克组织蛋白37℃与基质作用15min，反应体系中产生1反应体系丙酮为1单位(U·mg^-1prot)。

SOD：黄嘌呤氧化酶法，每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U·mg^-1prot)。

CAT：可见光法，其定义为每毫克组织蛋白每秒钟分解1可见光法的H₂O₂的量为一个活力单位(U·mg^-1prot)。

1.4、肝脏炎症指标的测定

谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)由日立生化7180型号全自动血液分析仪测定；转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)采用酶联免疫吸附法测定。1.5、肝星形细胞活化指标的测定

取肝组织切片，再经二甲苯脱蜡，酒精水合。由En Vision免疫组织化学的方法测定肝组织的α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA，购自北京中创宏达科技有限公司)和I型胶原(typeⅠcollagen，CⅠ，购自亚太恒信生物科技有限公司)表达程度，并按它们的染色面积在标本中所占百分比表示。

1.6、统计学分析

采用SPSS13.0统计软件分析，计量资料均以均数±标准差，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2、实验结果

三组大鼠经过8周实验期后均全部存活。图1为肝脏HA、CⅣ、LN和TNF-α等肝纤维化相关指标的检测结果。与对照组相比，肝纤维化模型组的HA、CⅣ、LN、TNF-α含量均显著升高(P<0.01)。灌服SPDS后，保护组对应的肝纤维化指标升高程度得到了明显的抑制(P<0.01)。

肝脏组织HE染色结果在光镜下显示对照组的肝脏具有正常的肝小叶结构，肝细胞排列整齐，肝小叶规则，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀。模型组大鼠的肝脏表现出严重的损伤性病理改变，肝小叶失去正常结构，肝细胞肿胀，体积较对照组明显增大、普遍变性，大多数为脂肪变性，少数水样变，炎症及坏死明显，汇管区纤维组织增生，部分有肝细胞再生及假小叶形成。Masson胶原染色肝脏胶原水平的半定量结果为3.4±0.9，SPDS保护组胶原纤维增生程度明显较模型组低，未见假小叶形成，其肝纤维化半定量测定结果为1.9±0.7，明显弱于模型组(P＜0.05)。

图2展示的是实验大鼠血清抗氧化指标，即MDA含量以及SOD、CAT、LDH活力。与对照组相比，CCl₄诱导的模型组导致了大鼠肝脏MDA含量显著增加、同时降低了血清中SOD活力(P<0.01)，而SPDS则抑制了这种作用。三组大鼠血清LDH、CAT活力差异均无统计学意义(P＞0.10)。

图3为实验大鼠肝损伤指标(ALT、AST)以及炎性细胞因子(TGF-β)水平的检测结果。皮下注射CCl₄明显升高了大鼠血清中ALT、TGF-β的含量(P<0.01)。而SPDS可以有效抑制这种作用(P<0.01)。

肝星形细胞活化指标的结果显示α-SMA在对照组血管平滑肌细胞中有着色，但在肝窦中无表达；CⅠ在对照组中表达很少。模型组中α-SMA及CⅠ阳性细胞主要位于中央小叶和门静脉周围纤维带，SPDS保护组的阳性细胞染色面积均小于模型组(P均＜0.05)(如图4所示)。

3、讨论

HSCs表达α-SMA是细胞由静止型转变为肌成纤维细胞并合成和释放多种细胞外基质的重要标志。因此α-SMA的表达被认为是HSCs活化的依据。HSCs是肝纤维化时细胞外基质过多产生和沉积的主要细胞来源。HSCs活化引起肝脏纤维化，更有研究把活化的HSCs数量作为抗纤维化疗效判断的指标。

本实验模型组大鼠肝脏α-SMA表达明显高于对照组，同时肝组织呈现 炎症、坏死、胶原沉积及假小叶形成，Ⅰ型胶原蛋白表达增加。HA、CⅣ、LN、TNF-α等血清肝纤维化指标也显著升高。这表明模型组大鼠肝脏发生了典型的肝纤维化改变。SPDS保护组以上指标的升高程度均显著低于模型组，肝组织胶原纤维增生程度也较模型组轻。因此，我们猜测SPDS对CCl4诱导的肝纤维化有一定的预防和抑制作用。

HSCs活化引起的肝纤维化通常与肝细胞炎症、坏死及修复过程密切相关。ALT是反映肝脏是否损伤主要敏感指标，健康动物血清中转氨酶浓度较低，转氨酶中ALT在肝细胞中教多，当肝细胞膜损害或肝细胞坏死时，血清中ALT、TGF-β含量增高。本实验中模型组慢性摄入CCl₄诱导的肝纤维化引起ALT、TGF-β水平升高，其原因是肝细胞膜结构完整性遭到了破坏，加重了肝脏炎性反应。其中脂质过氧化是破坏膜脂质层结构完整性的机制之一。脂质过氧化还可以导致炎症因子(TGF-β)的过度表达及胶原的大量合成。同时血液中O^2-和H₂O₂含量增加导致大鼠免疫疲劳，易产生了较多的炎性物质。大鼠皮下注射CCl₄时，活化的HSCs总是出现在坏死区域(含大量超氧离子)的周边，并在超氧离子形成后才出现。因此，肝脏炎症反应与HSCs的活化关系密切。炎症反应产生的自由基和MDA促使了HSCs的活化及胶原的合成。

芪叶保肝饮作为中药，其活性成分主要是黄酮和皂苷，有研究显示两者均有很强的内源抗氧化作用，可以降低肝脏中脂质过氧化水平。SOD是动物体内氧化和抗氧化物反应关键酶，其活性高低可反映抗氧化系统氧自由基清除机制的高低和体内氧自由基水平高低。本实验模型组血清中MDA升高及胶原合成增加，同时抗氧化酶SOD活力下降，而SPDS中的活性物质则可以抑制这种作用。SPDS干预可以降低肝脏氧化水平，维持肝细胞膜的完整性，减少炎性物质的产生，从而降低了HSCs的活化，使α-SMA的表达减少，Ⅰ型胶原蛋白合成受到抑制。因此，SPDS的抗纤维化机制源于其自由基清除作用和抗氧化作用。

4、结论

皮下注射CCl₄明显增加了大鼠血清中HA、CⅣ、LN等肝纤维化指标，灌服SPDS有效抑制了肝纤维化程度。SPDS通过其抗氧化作用，减轻肝脏损伤，降低肝脏炎症，抑制星形细胞的活化，从而缓解了CCl₄诱导的肝脏纤维化。

测试例4

本测试例的目的是提供实施例1的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。

本测试例中，通过该药物组合物(又称为“芪叶保肝饮”，Liver-protectingdrinking from Stilbene leaf，缩写为SPDS)对肝癌细胞增殖和凋亡的作用，证明该药物组合物具有较强的抗氧化活性，能够抑制HepG2肝癌细胞增长并促进其凋亡。

1、材料与方法

1.1、动物

BALB/C，雄性裸鼠50只，体重20g～26g，购于山西医科大学动物实验中心。

1.2、材料及试剂

SPDS，中成药。人肝癌细胞株HepG2，二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)(美国sigma公司，批号S43654-098)，Cell Proliferation Reagent WST-1试剂盒(美国Roche公司)，nuclear/cytosol fractionation kit(美国pierce公司)，BCA蛋白定量试剂盒(美国pierce公司)，ECL化学发光液(美国pierce公司)。

1.3、SPDS清除DPPH自由基的作用

用PBS将SPDS稀释成不同浓度，分别取15μl原液、稀释2倍、4倍样品和60μl17mmol/L Tris-HCl(pH7.4)以及150μl 1mmol/L DPPH溶液混合，避光反应30min。同时用水溶性维生素E(Trolox)作为阳性对照，乙醇溶液作为颜色空白对照，PBS作为空白对照。均取波长520nm下的反应液吸光值，最后按下述公式计算：自由基清除率＝[OD520(空白对照)-(OD520(样品)-OD520(颜色对照))/OD520(空白对照)]×100％。得到样品的自由基清除率，在相同DPPH自由基清除率下的样品浓度对应的Trolox浓度，为此浓度样品的Trolox当量浓度。

通过回归分析得出多糖浓度与清除率之间的回归方程，根据方程计算出其IC50(清除率为50％时的浓度)。每组实验重复3次。

1.4、SPDS对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

1.4.1、HepG2细胞培养

人肝癌细胞株HepG2，细胞复苏后，于12％胎牛血清的DMEM培养基中培养，含1％的青链霉素(100IU/ml的青霉素和100ng/ml的链霉素)，以及2mM的谷氨酸，于37℃、5％CO₂条件下培养。换液周期为1～2天，3～4天传代一次。

1.4.2、SPDS对HepG2细胞增殖的影响

用Cell Proliferation Reagent WST-1(Roche，USA)试剂盒检测HepG2细胞在SPDS作用下的活力和增殖情况。在96孔板中加入2×10⁴个/孔HepG2细胞，37℃、5％CO₂条件下培养12h后，分别加入5μl、10μl、15μl和20μl SPDS处理细胞，对照组分别加入与之相同剂量的PBS(空白对照)和板蓝根溶液(阴性对照)，孵育18h。弃上清培养基，PBS洗涤3次，加入20μl WST-1试剂和180μl培养基，孵育1h，分别读取各组在450nm处的吸光值。

1.4.3、流式细胞仪检测SPDS对HepG2细胞凋亡的作用

(1)在6孔板中，每孔加入2×10⁵个/孔HepG2细胞，37℃、5％CO₂条件下培养12h，0μl、25μl、50μl、75μl、100μl SPDS处理16h，胰酶消化，含12％胎牛血清的培养基终止反应，1000rpm、8min离心收集细胞。PBS洗涤3次，1000rpm、8min，离心收集细胞。

(2)加入500ul的Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5ul Armexin V-APC溶液，混匀，室温避光反应15min。

(3)加入5ul的7-AAD染液,混匀,室温,避光反应15min。

(4)l h内用流式细胞仪检测,激发波长Ex＝633nm，最大发射波长

Em＝660nm，Annexin V-APC的红色荧光使用FL4通道检测，激发波长

Ex＝546nm,发射波长Em＝647nm，7-AAD红色荧光使用FL3通道检测。

Em＝647nm，7-AAD红色荧光使用FL3通道检测。

1.5、SPDS对小鼠肿瘤生长的影响

1.5.1、小鼠肿瘤模型的建立

取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后，重悬于PBS中，调整细胞浓度至6.0×10⁶个/ml。每只裸鼠背部皮下注射细胞悬液200μl，所有实验小鼠均在恒温(25±1)℃、恒湿(50％±10％)、无特定病原体(SPF)条件下的层流架中饲养，自由饮食。移植肿瘤细胞10天左右，挑选背部移植的肿瘤大小生长至100mm³～200mm³的小鼠用于试验。

1.5.2、实验分组

将实验小鼠随机分为实验组和对照组2组(10只/组)，实验组灌胃SPDS200μl/只，每天早晚各一次。对照组灌胃同等剂量的生理盐水。

1.5.2、SPDS对小鼠肿瘤的影响

从首次给药开始，用游标卡尺每天测量记录各组肿瘤体积，用游标卡尺测量肿瘤结节的长度和宽度(精确到0.002cm)按公式V＝ab²/2计算肿瘤的体积，至第30天时结束实验。计并在第30天时，麻醉并处死裸鼠，手术剥离切除肿瘤组织，称重。按如下公式计算抑瘤率，肿瘤抑制率(％)＝[1－(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100％。

1.6、统计方法

采用SPSS18.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1、SPDS的抗氧化作用

SPDS的DPPH自由基清除作用如表8所示，SPDS清除DPPH自由基的能力随剂量增加而升高，呈线性相关，它们之间的线性回归方程为：y＝0.029x+0.0434，R²＝0.9947，IC50＝15.74ul。随着自由基清除率的增加，相对Trolox的当量浓度也随之增大。

表8 SPDS对DPPH自由基的清除作用

2.2、SPDS对HepG2细胞的增殖及凋亡的影响

2.2.1、SPDS对HepG2细胞的增殖作用

不同剂量板蓝根和PBS处理下的HepG2细胞数量无显著差异，SPDS实验组细胞数量随着剂量增加而减少。15ul和20ul的SPDS实验组HepG2细胞数量显著少于板蓝根和PBS组(P＜0.05)，见图5。

2.2.2、流式细胞仪检测SPDS对HepG2细胞凋亡的作用

X轴表示APC染色荧光，Y轴表示7-AAD染色荧光：A区表示坏死细胞，表现为APC-/7-AAD+；B区表示晚期凋亡细胞，表现为ApC+/7-AAD+；C区表示正常细胞，表现为APC-/7-AAD-；D区表示早期凋亡细胞，表现为APC+/7-AAD-，见图6。

2.3、SPDS对小鼠肿瘤生长的作用

SPDS实验组与对照组随着时间增长肿瘤体积均逐渐增大。第30天时，SPDS实验组肿瘤体积显著小于对照组(P＜0.05)。称量对照组平均肿瘤重量为(4.57±0.82)g。SPDS实验组平均肿瘤重量为(2.73±0.82)g，实验组重量小于对照组，差异显著(P＜0.05)。肿瘤抑制率为40.3％(见图7，箭头所指部位为肿瘤病灶部位；见图8，与对照组组比较：*P＜0.05)。

3、讨论

早在上世纪80年代，人们就发现自由基与癌症的发生密切相关。自由基通过作用于DNA，导致机体遗传物质发生改变，引起蛋白质结构、功能变化，肽键断裂、非正常聚合以及脂质过氧化等，最终可能导致肿瘤的发生。研究发现采用抗氧化剂干预、阻断自由基的形成，可以预防肿瘤发生。本测试例的结果表明SPDS具有较强的清除自由基的能力。

宋岩等研究表明黄芪可显著抑制HepG2细胞增殖，细胞凋亡率随着黄芪浓度增加而逐渐升高，存在剂量依赖性。耿国军等研究黄芪对肺腺癌细胞生长的影响，表明不同浓度黄芪处理后细胞的生长受到明显抑制，细胞生长抑制率随黄芪的浓度增加而增长。本测试例的结果表明SPDS能抑制HepG2细胞的增殖。流式细胞仪检测结果显示，随着SPDS的剂量增加，晚期凋亡细胞比例呈现逐渐增加的趋势，说明SPDS具有致HepG2细胞凋亡的作用。

谷俊朝等通过研究黄芪多糖对TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生长发现，服用黄芪多糖的小鼠瘤质量有所减轻，具有一定的抑瘤作用。刘成军等研究黄芪注射液对人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤的抑制作用，结果显示黄芪注射液高、中剂量组移植瘤体积明显低于对照组，瘤质量明显低于对照组，抑瘤率分别为39.90％、30.77％。任美萍等研究表明，黄芪多糖在50，100mg/kg时，对H22的抑瘤率分别为32.84％，45.09％，对S180的抑瘤率分别为36.55％，50.35％。本测试例通过在小鼠皮下注射HepG2细胞建立相应的肿瘤模型，给裸鼠灌胃适量的SPDS治疗并观察肿瘤生长变化情况，通过测量肿瘤体积以及重量评估SPDS的治疗效果。结果表明SPDS对肿瘤的生长有一定的抑制 作用。

综上所述，SPDS这一新型中成药具有较强的抗氧化活性，能够抑制HepG2肝癌的生长，促进肝癌细胞凋亡，并对抑制肿瘤的生长有一定作用，值得临床推广应用。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (6)

1.一种预防和/或治疗酒精性肝病或肝癌的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物由如下重量份数比的原料制成：

黄芪10-30重量份、枸杞子5-25重量份、松叶4-20重量份、橘叶3-9重量份、竹叶3-9重量份、芦根3-9重量份。

2.根据权利要求1所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物由如下重量份数比的原料制成：

黄芪15-25重量份、枸杞子10-20重量份、松叶8-16重量份、橘叶5-7重量份、竹叶5-7重量份、芦根5-7重量份。

3.根据权利要求2所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物由如下重量份数比的原料制成：

黄芪20重量份、枸杞子15重量份、松叶12重量份、橘叶6重量份、竹叶6重量份、芦根6重量份。

4.根据权利要求1-3任一项所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还含有一种或多种药学上可接受的载体。

5.根据权利要求1-3任一项所述药物组合物，其特征在于：

所述药物组合物为临床上任何可接受的剂型。

6.根据权利要求5所述药物组合物，其特征在于：

所述剂型包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型。