CN101569654B

CN101569654B - 木豆叶中木豆芪酸i在制备治疗肿瘤药物中的用途

Info

Publication number: CN101569654B
Application number: CN2009100722187A
Authority: CN
Inventors: 付玉杰; 祖元刚; 刘霞; 吴楠; 孔羽; 罗猛; 顾成波; 彭霄
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2009-06-09
Filing date: 2009-06-09
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2029-06-09
Also published as: CN101569654A

Abstract

本发明涉及了从木豆叶超临界提取物及其主要成分-木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，在抗肿瘤方面的新用途。木豆芪酸加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型。木豆叶中超临界提取物及木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，具有毒副作用小，疗效确切，安全可靠等特点。木豆资源丰富，采集方便，提取工艺简单，便于工业化生产。

Description

木豆叶中木豆芪酸I在制备治疗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及木豆叶中木豆芪酸I在制备治疗肿瘤药物中的用途。

背景技术

肿瘤是当今世界直接危及人类生命的一种最常见、最严重的疾病。近年来随着分子肿瘤学、分子药理学的不断发展以及对肿瘤本质的逐渐阐明，药物、基因工程、组合化学、大规模快速筛选等先进技术的广泛应用，加速了新型抗肿瘤药物的开发。目前主要的抗肿瘤药物有：烷化剂，抗代谢药物，抗肿瘤抗生素，铂类抗肿瘤药物，激素类，抗肿瘤植物药，用于微管和微管蛋白(如：紫杉醇等)，用于拓扑异构酶(如：喜树碱等)，抑制肿瘤细胞DNA合成(如：三尖杉酯碱等)。近年来，抗肿瘤药物的毒副作用对机体的损害愈来愈受到临床医师的广泛重视，因而，低毒、高效抗肿瘤天然产物类药物的开发将会具有广阔的市场前景。

木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]为豆科木豆属一年生或多年生木本植物、常绿灌木。原产东半球，我国西南和东南部常见栽培，无毒，可食用(Duke，1981；Nene et al.，1990)，种子供食用或制豆腐，叶可为饲料。木豆主要有清凉、消热、解毒、止痛止血、抑菌消炎等作用，还可用于治疗外伤、烧伤、感染、褥疮和抗菌消炎等(刘中秋等，1998；孙绍美等，1995)。此外，在印度、巴西、古巴、墨西哥、南非等国还有利用木豆提取物制剂治疗感冒、支气管炎、麻疹、痢疾、肝炎、皮肤病、烧伤、溃疡、肿瘤等疾病(Abbiw D.K.，1990；Duke J.A.et al，1994；Milliken W.，1997；Grover J.K.，2002)，疗效显著。我国临床组方用于治疗股骨头坏死以及循环系统疾病(袁浩等，2004)。

超临界二氧化碳萃取是以超临界状态(温度31.3℃，压力7.15MPa)下的二氧化碳为溶剂，利用其高渗透性和高溶解能力来提取分离混合物的过程。超临界二氧化碳萃取技术具有环境良好、操作安全、不存在有害物残留、产品品质高且能保持固有气味等特点。木豆叶超临界提取物是利用超临界二氧化碳萃取技术从木豆叶中提取的粗提物；木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，是从木豆中粗提物中分离纯化而获得的，是一系列已知的芪类化合物。将木豆叶超临界提取物及木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，用于抗肿瘤药物方面的应用至今尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供了从木豆超临界提取物及木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

本发明以人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人胃癌细胞、人结肠癌细胞、人白血病细胞、人卵巢癌细胞、人宫颈癌细胞、人肝癌细胞、人神经胶质瘤细胞为研究对象，使用MTT法检测木豆叶超临界提取物及木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，对肿瘤细胞的体外抑制作用，结果证明，木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，对肿瘤细胞的抑制作用较明显。

本发明通过小鼠体内实体瘤抑瘤实验证明木豆叶超临界提取物及木豆芪酸(以木豆芪酸Ⅰ为代表)具有体内抗肿瘤活性。

基于上述研究结果，本发明证实了木豆叶超临界提取物及木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，具有治疗乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等癌症的新用途，可用于制备抗肿瘤的药物。

本发明可以纯化的形式与药学上适当的载体一起被使用。可制成的药物剂型包括片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液或粉针剂，还可以采用现代制药界所公认的控释或缓释剂型。

根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员普遍知道的任何一种。可以通过任何适当的方式给药，包括非肠道、静脉内、肌内、腹腔内给药，或者也可以通过用导管直接灌注给药。给药的剂量和频率依据年龄、性别、病人状态，同时服用其它药物、不良反应和临床医师考虑到的其它因素而定。

本发明的优点：

1.本发明以新鲜或者干燥木豆枝叶为原料，在不破坏植物生态平衡、不影响农业生产的基础上，对植物资源进行高效合理的利用。

2.本发明中的木豆叶中的木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，具有低毒不易产生耐药性的特点，且具有很好地抗肿瘤活性。

具体实施方案

实例一体外检测抗肿瘤细胞活性实验

细胞：人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞(A549)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人结肠癌细胞(HCT-8)、人白血病细胞(CEM)、人卵巢癌细胞(HO-4980)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肝癌细胞(HepG2)、人神经胶质瘤细胞(SHG-44)、小鼠实体瘤S180细胞。均购自上海细胞库。

实验材料：木豆超临界提取物及木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，本实验室制备；生理盐水，哈尔滨三联药业；紫杉醇，上海昊化化工有限公司。

方法：

(1)分别取处于指数生长期的肿瘤细胞，用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液稀释成20000个细胞/mL。

(2)96孔板每孔中加入200μL细胞悬液，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。

(3)将木豆叶超临界提取物及木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，用DMSO溶解，每孔中加入一定浓度的药物，稀释至需要的工作浓度。同时以紫杉醇为阳性对照。

(4)置于37℃，5％CO₂培养箱中分别培养48h。

(5)MTT用无血清RPMI1640培养液配成5mg/mL溶液，每孔中加入20μL，置于37℃、5％CO₂孵箱中孵育4h。

(6)吸出上清，用培养液洗三次加入100μL DMSO溶解沉淀物，用振荡器摇匀测定OD570值。

(7)按公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率：

公式：肿瘤细胞生长抑制率＝(1-实验组OD/对照组OD)×100％

根据48h的实验数据，由OD值计算生长抑制率，将抑制率与药物浓度做图，得出剂量反应曲线，计算出IC₅₀(半数抑制浓度)值。

表1木豆芪酸对肿瘤细胞的体外半数抑制率

结果：IC₅₀表示药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度。如表1所示，木豆超临界提取物肿瘤抑制效果较阳性对照较弱，IC₅₀大约在20-40μg/mL左右，木豆芪酸，包括木豆芪酸Ⅰ-Ⅵ，对上述十种肿瘤细胞均具有非常强的抑制作用，其IC₅₀值与阳性对照数量级一致。

实例二体内检测抗肿瘤活性试验

S180腹水传代小鼠，购自黑龙江省肿瘤研究医院。昆明小鼠，体重24-25g，购自黑龙江省肿瘤医院实验动物中心。环磷酰胺购自哈尔滨医科大学附属第二医院。

方法：试验用小鼠随机分为对照组(生理盐水200mL/kg)、环磷酰胺(20mg/kg)、木豆芪酸I(40mg/kg，15mg/kg)，木豆超临界提取物(250mg/kg，125mg/kg)由于灌胃给药后紫杉醇分解，所以体内试验选用环磷酰胺作为阳性对照药品。选取移植肿瘤7天、肿瘤生长良好、腹部隆起明显的小鼠，腹部皮肤消毒，用一次性无毒采血器经腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入无菌烧杯中以生理盐水稀释成1∶3的癌细胞混悬液，于每只小鼠右腋下接种0.2mL，各组动物与接种肿瘤次日开始给药，每日一次，连续给要10天。给药结束后，将动物称重处死，剥离肿块称重，比较各组肿瘤生长情况(各组动物初始数目据为10只，表中所列动物数均为去除死亡动物后剩余的数目)。实验表明木豆芪酸(以木豆芪酸Ⅰ为代表)对S180肿瘤细胞具有明显的抑制作用，对S180的肿瘤抑制率具体结果见下表。

表2木豆超临界提取物与木豆芪酸Ⅰ对肿瘤细胞的体内抑制率

结果：从表2可以看出，木豆超临界提取物和木豆芪酸都有较明显的肿瘤抑制作用，其中木豆芪酸对S180肿瘤细胞抑制作用较强，40mg/kg的木豆芪酸Ⅰ抑瘤率达到54.27％，15mg/kg的木豆芪酸Ⅰ抑瘤率达到48.21％。荷瘤小鼠给药后，木豆超临界提取物和木豆芪酸Ⅰ对荷瘤小鼠体重增长均无影响，但环磷酰胺对荷瘤小鼠体重增长影响较大，给药7天后体重较给药前下降，表明环磷酰胺毒副作用较大，木豆超临界提取物和木豆芪酸Ⅰ无明显毒副作用。

实例三抗肿瘤机制研究

1、利用激光共聚焦显微镜进行乳腺癌MCF-7细胞DNA形态学研究

取对数生长期MCF-7细胞，加入5μM木豆芪酸，并设阴性空白对照。MCF-7细胞经过48h的孵育，去除培养液，冷PBS洗涤2次，PC-3细胞被0.25％胰蛋白酶消化，3000×g离心收集MCF-7细胞，冷PBS洗涤2次，3000×g离心5min去除PBS。细胞被3000×g离心5min收集，并用冷PBS缓冲液重悬，调整细胞的密度为1×10³/mL、并加入1mL 50μg/mL DAPI，吹打均匀，避光室温孵育5min，上激光共聚焦显微镜进行前列腺癌MCF-7细胞DNA形态学研究。

结果：图2(A)是空白对照MCF-7细胞，图2(B)是加药的MCF-7细胞，比较来看，(B)细胞核染色质浓集、边聚，核碎裂，并可见凋亡小体。凋亡小体是细胞凋亡的主要特征之一，促进肿瘤细胞凋亡是药物抗肿瘤的主要途径。

2、乳腺癌MCF-7的DNA降解

取对数生长期MCF-7细胞，分别加入3μg/ml，4μg/ml，5μg/ml木豆芪酸，并设阴性空白对照。经过48h的孵育，去除培养液，冷PBS洗涤2次，MCF-7细胞被0.25％胰蛋白酶消化，3000×g离心5min收集MCF-7细胞，冷PBS洗涤2次， 3000×g离心5min去除PBS。细胞总DNA用DNA分离试剂盒提取纯化，按试剂盒说明书的步骤进行操作

结果：图3，在琼脂糖凝胶电泳上line 3，line 4可观察到带状泳道(DNA ladder)，由于片段化而形成的DNA Ladder被认为是细胞凋亡的典型特征，4μg/ml和5μg/ml木豆芪酸作用MCF-7细胞48h可导致肿瘤细胞凋亡，表明木豆芪酸可诱导MCF-7细胞凋亡。

附图说明

图1木豆叶中木豆芪酸Ⅰ的结构式

图2木豆叶中木豆芪酸Ⅱ的结构式

图3木豆叶中木豆芪酸Ⅲ的结构式

图4木豆叶中木豆芪酸Ⅳ的结构式

图5木豆叶中木豆芪酸Ⅴ的结构式

图6木豆叶中木豆芪酸的Ⅵ结构式

图7木豆超临界提取物体内抑瘤图片

图8木豆芪酸体内抑瘤图片

图9激光共聚焦显微镜检测MCF-7细胞DNA形态学

图10琼脂糖凝胶电泳检测MCF-7细胞凋亡

Claims

1.木豆叶中木豆芪酸I在制备治疗肿瘤药物中的用途，其特征在于木豆叶中木豆芪酸I加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型。

2.权利要求1所述的木豆叶中木豆芪酸I在制备治疗肿瘤药物中的用途，其特征在于所述的加入不同的赋形剂后可加工成的剂型是片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液或粉针剂，以及用现代制药界所公认的控释或缓释剂型。